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烯醇化酶1对RA滑膜成纤维细胞增殖凋亡的影响

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烯醇化酶1对RA滑膜成纤维细胞增殖凋亡的影响

人烯醇化酶1在原核细胞中的可溶性表达及纯化

第九届全国免疫学学术大会

作者：樊莎莎宗明张慧陆英范列英上海市东方医院

背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)以关节滑膜内层增生为特征,这种增生可能是滑膜成纤维细胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)增殖与凋亡之间的不平衡引起的。据报道RA-FLS内烯醇化酶1(enolase1,ENO1)表达量增加,且ENO1与肿瘤细胞的增殖凋亡有关,本文研究目的是研究ENO1对RA-FLS增殖、凋亡的影响。方法:分离培养RA及对照组骨关节炎(osteoarthritis,OA)患者滑膜组织FLS,取对数生长期的FLS分别在在21%O2、7%O及3%O的条件下培养,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(RCR)及蛋白质印迹技术(Western Blot,WB)检测FLS中ENO1 mRNA及蛋白水平表达的差异。构建ENO1小干扰RNA(ENO1SiRNA)转染RA-FLS及OA-FLS。MTS法检测FLS的增殖,流式细胞术检测FLS凋亡。结果:3%O组与21%O、7%O相比,FLS内ENO1在mRNA及蛋白水平表达均增加,而21%O组与7%O组之间均无差异;3%O组FLS细胞增殖率高于21%O组与7%O组,而21%O组与7%O组之间无差异。FLS转染ENO1 SiRNA后,ENO1表达受抑制、FLS增值率降低;FLS凋亡增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论:缺氧环境促进FLS表达ENO1,ENO1可调控关节滑膜FLS增生与凋亡。在RA中,FLS内ENO1可促进细胞增殖,抑制细胞凋亡。

关键词：滑膜成纤维细胞烯醇化酶1 增殖凋亡缺氧

来源： cnki会议评论

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湖北科技学院学报（医学版） 2022年第5期36卷 405-408,412页

作者：金科华向念慈刘洋湖北科技学院医学部基础医学院湖北咸宁437100 湖北科技学院医学部药学院

目的用原核表达系统生产人烯醇化酶1(ENO1),为筛选抑制剂奠定基础。方法通过5′分别带Nde I和Xho I位点的一对引物PCR扩增ENO1 cDNA,用Nde I+Xho I酶切cDNA和质粒pET-28a。酶切产物经纯化后用T4 DNA ligase连接,并转化大肠杆菌Top10,用... 详细信息

目的用原核表达系统生产人烯醇化酶1(ENO1),为筛选抑制剂奠定基础。方法通过5′分别带Nde I和Xho I位点的一对引物PCR扩增ENO1 cDNA,用Nde I+Xho I酶切cDNA和质粒pET-28a。酶切产物经纯化后用T4 DNA ligase连接,并转化大肠杆菌Top10,用含卡那霉素的LB平板(LBK培养基)筛选转化子。提取转化子质粒,酶切和测序法鉴定。将序列正确的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3),用LBK培养基培养抗性菌落至OD_(600)约为0.7,加入终浓度0.2mmol/L IPTG,16℃诱导ENO1表达20h。超声破碎收集的菌体离心取上清,用组氨酸标签蛋白(可溶性)纯化试剂盒纯化ENO1。对纯化的ENO1进行超滤浓缩和缓冲液交换后,BCA法测定浓度,低温保存。结果ENO1正确连入pET-28a,重组菌pET-28a-ENO1-BL21(DE3)经0.2mmol/L IPTG诱导后,从裂解液上清中获得了高纯度的ENO1,产量达427mg/L。结论高产量、高纯度可溶性ENO1奠定了抑制剂筛选模型建立的基础。

关键词：烯醇化酶1 表达纯化原核细胞可溶性

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大肠癌组织棕榈酰化修饰蛋白的组学分析

分析化学 2022年第10期50卷 1465-1472页

作者：杨静波何成彦卢日峰刘宁吉林大学第二医院医学研究中心吉林大学中日联谊医院检验科吉林大学公共卫生学院

蛋白质棕榈酰化修饰在大肠癌的发生、发展和转移等过程中发挥了重要作用。本研究采用改进的酰基-生物素交换方法(Acyl-biotinyl exchange, ABE),对大肠癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白进行富集，并利用蛋白质组学技术对富集的蛋白进行分析... 详细信息

蛋白质棕榈酰化修饰在大肠癌的发生、发展和转移等过程中发挥了重要作用。本研究采用改进的酰基-生物素交换方法(Acyl-biotinyl exchange, ABE),对大肠癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白进行富集，并利用蛋白质组学技术对富集的蛋白进行分析鉴定。结果共鉴定出213种高可信度(+HA/-HA>3)的棕榈酰化修饰蛋白，包括烯醇化酶1、过氧化物氧化还原酶、波形蛋白、线粒体苹果酸脱氢酶、核异质性核糖核蛋白K、分子伴侣复合体蛋白1等，并以烯醇化酶1棕榈酰化修饰为例，采用蛋白质印迹技术对其进行了验证。本研究对经典的ABE方法进行了改进，降低了非特异性背景信号，大肠癌癌组织中的棕榈酰化修饰蛋白的鉴定分析结果可为进一步研究特定肿瘤相关蛋白分子的棕榈酰化修饰调控的分子机制、精准发现大肠癌肿瘤标志物或分子靶点提供新思路。

关键词：棕榈酰化修饰大肠癌蛋白质组酰基-生物素交换烯醇化酶1

松花粉水提液通过调节ENO1的表达抗肝癌的实验研究

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松花粉水提液通过调节ENO1的表达抗肝癌的实验研究

作者：徐伟鑫右江民族医学院

学位级别：硕士

目的:探讨松花粉(pollen pini,PP)水提液如何通过影响烯醇化酶1(enolase1,ENO1)基因的表达产物进而抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白丝氨酸苏氨酸激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/protein-serine-threonine kinase,PI3K/AKT)通路的过度激活,从而抑制肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移。方法:⑴本研究首先对ENO1进行生信分析。⑵检测PP水提液中的主要成分。⑶分别做SMMC-7721细胞和过表达ENO1稳转株的细胞计数试剂盒8(cell counting kit 8,CCK8)实验、Transwell实验和蛋白质免疫印迹法(Western blot)实验、过表达ENO1稳转株的细胞划痕实验。⑷用ENO1抑制剂进行ENO1的增殖抑制实验。⑸建立过表达ENO1稳转株和空载转染细胞的裸鼠成瘤模型,取各组存活裸鼠的血清做丙氨酸氨基转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)和AST/ALT的检测,取各组成瘤存活裸鼠的瘤体称重并提蛋白做Western blot实验。结果:⑴肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的ENO1与正常组织的相比磷酸化水平差异显著。⑵PP中主要抗癌成分总多糖、总黄酮含量和PP水提液锌离子浓度大都高于其他抗肿瘤药物。⑶PP水提液在体外抑制了SMMC-7721细胞、过表达ENO1稳转株和空载转染细胞的侵袭及增殖相关蛋白的表达。PP水提液对于过表达ENO1稳转株细胞迁移的抑制大于空载转染细胞。⑷ENO1抑制剂对过表达ENO1稳转株的存活率抑制显著。⑸PP水提液抑制了成瘤裸鼠血清ALT、AST、AST/ALT的升高并减低了瘤体重量;PP水提液在体内抑制了过表达ENO1瘤体的细胞增殖相关蛋白的表达;在PP水提液作用下,过表达ENO1瘤体的增殖相关蛋白表达都要高于空载瘤体。结论:⑴PP水提液可以抑制SMMC-7721细胞的增殖、侵袭和迁移。⑵PP水提液抑制肝癌细胞与抑制ENO1和PI3K/AKT通路有关。⑶PP水提液通过调节ENO1和MBP-1的表达,分别通过抑制C-MYC和Erb-B2受体酪氨酸激酶2(Erb-B2 Receptor Tyrosine Kinase 2,ERBB2)这两条途径抑制PI3K/AKT通路而实现对HCC的抑制。

关键词：松花粉水提液烯醇化酶1 磷脂酰肌醇3激酶/蛋白丝氨酸苏氨酸激酶肝细胞癌

ENO1mAb脂质体的制备及其抗宫颈癌作用研究

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ENO1mAb脂质体的制备及其抗宫颈癌作用研究

作者：路如霞甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的制备负载烯醇化酶1单克隆抗体(ENO1mAb)的脂质体,将ENO1单克隆抗体递送入靶细胞,进而研究ENO1单抗脂质体抑制宫颈癌Hela细胞的生长作用。方法1.采用双乳溶剂挥发法,通过单因素考察筛选出构建脂质体的最佳方案,进而制备空白脂质体(Bl... 详细信息

目的制备负载烯醇化酶1单克隆抗体(ENO1mAb)的脂质体,将ENO1单克隆抗体递送入靶细胞,进而研究ENO1单抗脂质体抑制宫颈癌Hela细胞的生长作用。方法1.采用双乳溶剂挥发法,通过单因素考察筛选出构建脂质体的最佳方案,进而制备空白脂质体(Blank Lipidosomes,Blank-Lips)、烯醇化酶1单克隆抗体脂质体(ENO1mAb Lipidosomes,ENO1mAb-Lips),并对其进行物理表征与形态观察;2.用FITC标记脂质体,通过共聚焦显微镜观察细胞对ENO1mAb-Lips的摄取情况;3.通过CCK-8实验评价Blank-Lips、载药脂质体对宫颈癌Hela细胞的毒性及增殖抑制作用。结果1.成功构建载药脂质体,其粒径在200nm左右,外貌呈球形,大小基本一致;2.细胞摄取实验结果证实Hela细胞对包被烯醇化酶1单克隆抗体的脂质体摄取效果良好,单克隆抗体被成功递送入胞。3.CCK-8实验结果显示Blank-Lips对Hela细胞无毒性作用,载药脂质体对细胞增殖无抑制作用。结论ENO1mAb脂质体可成功进入宫颈癌Hela细胞胞内,其制备材料对细胞无毒性作用。

关键词：脂质体烯醇化酶1单克隆抗体烯醇化酶1 宫颈癌

miR-527表达对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

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中华泌尿外科杂志 2020年第10期41卷 772-778页

作者：王磊马玲葛玉坤李龚龙李俊朋李浩然乔庆东新乡市中心医院泌尿外一科河南新乡453000 新乡市中心医院泌尿外二科河南新乡453000 新乡医学院基础医学院病原生物学系河南新乡453003

目的:探讨膀胱癌组织中miR-527的表达情况,及其对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:收集新乡市中心医院2018年2月至2019年6月手术治疗的40例膀胱癌患者的肿瘤组织和相应的癌旁正常膀胱组织(距离肿瘤组织边缘>3 cm),所有组织标本... 详细信息

目的:探讨膀胱癌组织中miR-527的表达情况,及其对膀胱癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:收集新乡市中心医院2018年2月至2019年6月手术治疗的40例膀胱癌患者的肿瘤组织和相应的癌旁正常膀胱组织(距离肿瘤组织边缘>3 cm),所有组织标本均经病理检查确诊。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验检测膀胱癌组织、癌旁正常膀胱组织、人膀胱癌细胞系(T24、UM-UC-3、5637、RT-112)和人膀胱上皮永生化细胞系(SV-HUC-1)中miR-527的表达情况。在膀胱癌细胞系中转染miR-527 mimics、miR-527 inhibitor、ENO1过表达质粒、ENO1 siRNA及相应的阴性对照,采用CCK8实验、克隆形成实验、Transwell实验研究细胞的增殖、迁移和侵袭。荧光素酶报告基因实验验证miR-527的靶基因。蛋白质印迹法检测miR-527对靶基因表达的调控。结果:与正常膀胱组织相比,miR-527在膀胱癌组织中的表达降低(1.723±1.070与1.148±0.760,P112(0.310±0.056)中miR-527的相对表达量明显低于SV-HUC-1(0.987±0.111),差异均有统计学意义(P15.50与157.00±15.52),差异有统计学意义(P141.70±10.50与76.67±9.07),差异有统计学意义(P1是miR-527的靶基因。荧光素酶报告基因实验结果显示转染miR-527 mimics组荧光素酶活性明显低于对照组(0.47±0.10与0.99±0.02),差异有统计学意义(P酶活性差异无统计学意义(0.96±0.05与1.03±0.04,P>0.05)。蛋白质印迹实验结果显示,转染miR-527 mimics组细胞的ENO1表达量明显低于与阴性对照组(0.31±0.13与1.09±0.17,P1表达量明显高于阴性对照组(2.17±0.15与0.97±0.09,P1过表达质粒能够减弱miR-527 mimics对膀胱癌细胞系增殖、迁移和侵袭的抑制作用(P1 siRNA能够减弱miR-527 inhibitor对膀胱癌细胞系增殖、迁移和侵袭促进作用(P<0.05)。结论:miR-527在膀胱癌中低表达,可抑制膀胱癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

关键词：膀胱肿瘤膀胱癌微小RNA 527 烯醇化酶1

凝胶电泳-毛细管液相色谱-质谱联用技术分析大肠癌肿瘤与癌旁组织的差异蛋白质组

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分析化学 2017年第3期45卷 322-330页

作者：刘卓李洪军李晓鸥杨照微赵丽纯黄丽红郭宏华王海赵晴何成彦吉林大学中日联谊医院吉林省肿瘤医院吉林大学药学院

通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织(肿瘤与癌旁)中的总蛋白按照分子量分成不同的组分,经胶内水解后,利用毛细管液相色谱-质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析,共鉴定出29种差异表达的蛋白质,其中肿瘤组织中表... 详细信息

通过凝胶电泳将大肠癌患者的手术标本组织(肿瘤与癌旁)中的总蛋白按照分子量分成不同的组分,经胶内水解后,利用毛细管液相色谱-质谱联用技术对各个组分的多肽混合物进行蛋白质组学分析,共鉴定出29种差异表达的蛋白质,其中肿瘤组织中表达上调的蛋白质19种,如Fibrinogen beta chain,Vimentin,Fibrinogen gamma chain,Histone H2A type 1-B/E,Isoform 1 of Periostin,Fibrinogen alpha chain,Histone H3.1,Alphaenolase,Protein disulfide-isomerase A3等;在肿瘤组织中表达下调的有10种蛋白质,如Sarcomeric tropomyosin kappa,Transgelin,Heat shock protein beta-1,Talin-1,Isoform 2 of Vinculin,Isoform 1 of Filamin-C等。通过蛋白质印迹实验对其中的踝蛋白1(Talin-1)和烯醇化酶(Alpha-enolase)的蛋白质组学鉴定结果进行了验证。生物信息学分析表明在大肠癌组织中表达上调的蛋白多具有胞外分泌的属性,提示这些蛋白很有可能会渗透到机体内的循环系统中,从而在患者血液或者腹水中能够被检测到;而在大肠癌组织中表达下调的蛋白则多为细胞骨架、胞外基质纤维等的组成成分,这些蛋白的下调常与肿瘤细胞向周围组织的侵袭和转移有密切关系。本研究为大肠癌的早期诊断、大肠癌初筛等方面的研究等提供了基础数据,对进一步深入研究大肠癌发病机制具有重要意义。

关键词：凝胶电泳-毛细管液相色谱-质谱大肠癌蛋白质组踝蛋白1 烯醇化酶1

多功能PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒的制备及其抗宫颈癌的实验研究

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多功能PLGA-ENO1mAb-H1纳米颗粒的制备及其抗宫颈癌的实验研究

作者：苟元凤甘肃中医药大学

学位级别：硕士

目的本实验通过构建包封烯醇化酶1单克隆抗体(ENO1 m Ab-H1)的多功能聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米颗粒,实现ENO1m Ab-H1的靶向胞内递送和响应性释放,进而研究ENO1单抗纳米颗粒体外对宫颈癌Hela细胞的治疗作用。方法 1.通过体内诱生腹水... 详细信息

目的本实验通过构建包封烯醇化酶1单克隆抗体(ENO1 m Ab-H1)的多功能聚乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米颗粒,实现ENO1m Ab-H1的靶向胞内递送和响应性释放,进而研究ENO1单抗纳米颗粒体外对宫颈癌Hela细胞的治疗作用。方法 1.通过体内诱生腹水法制备烯醇化酶1单克隆抗体(ENO1 m Ab-H1),应用正辛酸-硫酸铵法进行初步纯化,进而用Protein A层析柱进行二步纯化;2.通过酰胺化反应制备叶酸-胱胺-聚乳酸-羟基乙酸(FA-SS-PLGA)共聚物;3.通过双乳溶剂挥发法分别制备空白PLGA纳米颗粒、PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒和FA-SS-PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒,并对其进行表征;4.通过荧光显微镜观察Hela细胞对载药纳米颗粒的摄取情况;5.通过糖酵解相关试剂盒测定PLGA-ENO1 m Ab-H1纳米颗粒对Hela细胞糖酵解的抑制作用;6.通过MTT实验、划痕实验及平板克隆形成实验评价PLGA-ENO1 m Ab-H1纳米颗粒对宫颈癌Hela细胞的抑制作用。结果 1.纯化得到的ENO1 m Ab-H1 SDS-PAGE电泳结果显示分别在分子量50k Da和25k Da处出现与Ig G重链和轻链位置相符合的条带,单抗纯化效果良好;2.经过红外光谱(FT-IR)和核磁氢谱(H-NMR)验证,成功制备了FA-SS-PLGA共聚物;3.成功制备了粒径小于200nm,大小基本均一的包封ENO1 m Ab-H1的多功能PLGA纳米颗粒;4.细胞摄取实验结果显示Hela细胞对FA-SS-PLGA靶向纳米颗粒的摄取量大于非靶向PLGA纳米颗粒;5.FA-SS-PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒对Hela细胞乳酸和丙酮酸的抑制作用强于3-Br PA(P1m Ab-H1靶向纳米颗粒对Hela细胞的增殖抑制作用高于PLGA-ENO1m Ab-H1非靶向纳米颗粒,但弱于3-Br PA(P1 m Ab-H1 24h对Hela细胞的迁移抑制作用最强,FA-SS-PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒、PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒及3-Br PA次之(P1m Ab-H1纳米颗粒、PLGA-ENO1m Ab-H1纳米颗粒均能抑制Hela细胞克隆球的形成(P1.多功能PLGA-ENO1 m Ab-H1纳米颗粒能够明显抑制宫颈癌Hela细胞乳酸和丙酮酸的生成;2.多功能PLGA-ENO1 m Ab-H1纳米颗粒能够抑制宫颈癌Hela细胞的增殖、迁移和克隆形成。

关键词：单克隆抗体宫颈癌 PLGA纳米颗粒糖酵解烯醇化酶1

非小细胞肺癌患者肿瘤组织和外周血血浆中ENO1蛋白水平分析

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中国肺癌杂志 2010年第12期13卷 1089-1093页

作者：张莹李敏刘宇韩迺珺张开泰肖汀程书钧高燕宁中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院肿瘤研究所"癌发生及预防分子机理"北京市重点实验室北京100021

背景与目的肺癌严重威胁人类生存健康,有效的肿瘤标志物可以辅助诊断、判断预后和指导治疗。本研究旨在检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血浆中烯醇化酶1(alpha-enolase,ENO1)蛋白水平,初步探讨ENO1作为肺癌相关蛋白标志物的可能性。方... 详细信息

背景与目的肺癌严重威胁人类生存健康,有效的肿瘤标志物可以辅助诊断、判断预后和指导治疗。本研究旨在检测非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血浆中烯醇化酶1(alpha-enolase,ENO1)蛋白水平,初步探讨ENO1作为肺癌相关蛋白标志物的可能性。方法采用Western blot方法检测16例肺鳞癌患者的肿瘤组织及其配对正常肺组织中ENO1蛋白水平。采用双抗体夹心酶联免疫吸附分析(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)测定42例健康体检者、34例肺部良性疾病患者和84例非小细胞肺癌患者三组人群血浆中ENO1蛋白水平。结果在87.5%(14/16)的肺鳞癌患者肿瘤组织中ENO1蛋白表达量高于其配对正常肺组织;非小细胞肺癌患者血浆中ENO1蛋白水平高于健康体检者(P=0.031)和肺部良性疾病者(P=0.019),且ENO1蛋白在肺腺癌患者血浆中的水平高于肺鳞癌患者(P=0.023)。结论非小细胞肺癌肿瘤组织和血浆中ENO1蛋白水平升高,提示ENO1可作为潜在的非小细胞肺癌相关血浆蛋白标志物。

关键词：肺肿瘤烯醇化酶1 血浆酶联免疫吸附分析