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绿豆、小麦钙调蛋白基因的克隆及分析

绿豆、小麦钙调蛋白基因的克隆及分析

作者：杨静陕西师范大学

学位级别：硕士

钙调蛋白(Calmodulin)是生物体中广泛存在的一类结构保守的调节蛋白。钙调蛋白通过和Ca结合，并与靶酶相互作用，调控细胞的发育和对外界刺激的反应。它参与多种生理过程，如基因表达、调节细胞分裂和代谢、生殖发育和细胞膜通道调控等... 详细信息

钙调蛋白(Calmodulin)是生物体中广泛存在的一类结构保守的调节蛋白。钙调蛋白通过和Ca结合，并与靶酶相互作用，调控细胞的发育和对外界刺激的反应。它参与多种生理过程，如基因表达、调节细胞分裂和代谢、生殖发育和细胞膜通道调控等功能。现已从多种植物，如拟南芥、大麦、水稻、辣椒、甜菜、丹参和豇豆中成功克隆了钙调蛋白基因。绿豆是一年生豆科草本植物，它既是一种粮食作物，也是药用植物。以种子和种皮(绿豆衣)入药，具清热祛暑、解毒之功效。小麦是世界上重要的粮食作物之一，在谷类作物中其产量占到17％，是世界35％人口的主要食品作物。因此，本研究选择这两种重要的粮食作物作为实验材料具有一定实际价值。绿豆(Phaseolus radiatus L.)钙调蛋白基因未见报道，从小麦中已克隆出钙调蛋白基因。本研究首次从绿豆(Phaseolus radiatus L.)中克隆了钙调蛋白基因，并且克隆了小麦(Triticum aestivum L.)钙调蛋白基因，对基因结构进行了分析。分别从小麦、绿豆叶片中提取总RNA，逆转录为cDNA。通过PCR，扩增得到钙调蛋白基因。绿豆和小麦钙调蛋白cDNA全长均为447bp，包含了完整的读码框，编码148个氨基酸。通过把小麦和绿豆钙调蛋白基因序列、推导的蛋白质序列进行相似性分析，发现小麦钙调蛋白基因和绿豆钙调蛋白基因核苷酸的相似性为84.6％，氨基酸的相似性为95.6％。本文得到的小麦钙调蛋白基因与已知的小麦钙调蛋白基因相比，相似性高达85％以上。与已知的其它多种植物钙调蛋白基因相比也有很高的相似性，核苷酸序列相似性在80％以上，编码的氨基酸序列相似性在90％以上。在Genebank进行了注册，绿豆钙调蛋白基因注册号为DQ778070，小麦钙调蛋白基因注册号为EF577270。将绿豆、小麦钙调蛋白基因分别正向、反向插入pCambia1304表达载体，经PCR和酶切验证，绿豆、小麦钙调蛋白基因确已插入植物表达载体;再将植物反义表达载体分别通过农杆菌介导法转入丹参植物体内，分析钙调蛋白对植物的生长发育的作用。这为进一步研究钙调蛋白的功能奠定了基础。用TMHMM、ProtScale、SOPMA、Pfam等在线生物信息学软件分析了绿豆钙调蛋白和小麦钙调蛋白的亲／疏水性、跨膜结构域、卷曲螺旋结构及功能域，并对它进行了亚细胞定位和二级结构预测。结果表明绿豆钙调蛋白和小麦钙调蛋白亲水性大于疏水性，是亲水性蛋白质;并且它们不具有信号肽，位于细胞质中，在细胞质中合成并以可溶性状态保留在细胞质中;二级结构主要为α-螺旋，含有四个功能域(efhand)，可以和钙离子结合激活下游反应，起到信号传导的功能。热激蛋白(heat shock protein，Hsp)是一类受到高温或其它一系列逆境诱导的蛋白质。细胞中主要的热激蛋白包括Hsp60，Hsp70，Hsp90和低分子量Hsp的家族。热激蛋白能消除热胁迫的影响，有效地保护细胞和生物体。在高温条件下，许多生物体(包括植物)中，都能够产生热激蛋白。本研究同时从油菜(Brassica campestris L.)中克隆了热激蛋白基因片断，对基因序列进行了分析。通过PCR扩增得到了834 bp的片断，编码278个氨基酸。通过在NCBI上进行比对，发现它和拟南芥热激蛋白基因有很高的同源性：核苷酸的同源性在88.1％，氨基酸的同源性在90％以上。利用DNAstar和DNAman等在线生物软件分析了油菜热激蛋白的核苷酸序列、推导的蛋白质序列、开放读码框的亲水性／疏水性，卷曲螺旋结构，并对蛋白质二级结构进行了预测。

关键词：绿豆小麦油菜钙调蛋白基因热激蛋白基因

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法夫酵母耐热基因工程菌的构建

大连工业大学学报 2022年第1期41卷 18-22页

作者：杨蒙蒙刘诗文刘冰南大连工业大学生物工程学院辽宁大连116034

为筛选法夫酵母耐热菌株以实现虾青素的中温化(25~40℃)生产,构建了法夫酵母整合型表达载体pUC18-kan-18S-groes,并将嗜热菌HB8的热激蛋白基因整合到法夫酵母基因组中,构建了基因工程菌法夫酵母XD-G,成功将发酵温度提高至25℃。发酵动... 详细信息

为筛选法夫酵母耐热菌株以实现虾青素的中温化(25~40℃)生产,构建了法夫酵母整合型表达载体pUC18-kan-18S-groes,并将嗜热菌HB8的热激蛋白基因整合到法夫酵母基因组中,构建了基因工程菌法夫酵母XD-G,成功将发酵温度提高至25℃。发酵动力学研究结果表明,25℃下法夫酵母XD-G的虾青素产量达到177.7μg/g,比野生菌株提高了26.7%。

关键词：法夫酵母虾青素热激蛋白基因

高温诱导对性成熟尼罗罗非鱼性腺中性别分化相关基因表达的影响

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中国水产科学 2014年第2期21卷 214-224页

作者：李春歌赵燕陈红菊付佩胜王慧季相山山东农业大学动物科技学院山东省淡水水产研究所

利用qRT-PCR系统分析了高温诱导对8月龄尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺组织中8个性别分化相关基因、4个热激蛋白基因及2个甲基转移酶基因表达的影响。结果显示,高温诱导能显著下调卵巢发育相关基因Cyp19a1a、ERα和ERβ的表达水... 详细信息

利用qRT-PCR系统分析了高温诱导对8月龄尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)性腺组织中8个性别分化相关基因、4个热激蛋白基因及2个甲基转移酶基因表达的影响。结果显示,高温诱导能显著下调卵巢发育相关基因Cyp19a1a、ERα和ERβ的表达水平(P基因Cyp11b2和Dmrt1的表达水平没有显著影响(P>0.05),这与高温对性腺分化期罗非鱼性别分化相关基因表达的影响不同。高温诱导后雌雄鱼性腺中Hsp70的表达水平显著上升(P基因的表达水平(P基因表达的影响,旨在揭示高温诱导对罗非鱼性别分化相关基因表达的影响具有一定的时期特异性,为研究温度影响鱼类性别分化的分子机理提供基础。

关键词：尼罗罗非鱼高温诱导性别分化相关基因热激蛋白基因甲基转移酶基因

2009年与昆虫学相关的国家自然科学基金资助项目一览表

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昆虫知识 2010年第1期47卷 221-226页

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茶多酚诱导铜绿假单胞菌交叉耐受性研究

茶叶科学 2015年第6期35卷 534-542页

作者：刘小香孙爱华杜蓬陈文虎朱军莉浙江医学高等专科学校基础医学部浙江杭州310053 浙江工商大学食品与生物工程学院浙江省食品安全重点实验室浙江杭州310035

检测了亚致死浓度的茶多酚(Tea Polyphenols,TP)处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1 mg·m L^(-1)茶多酚1 h后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂(1 mmol·L^(-1)H_2O_2)、高温(47℃),及酸... 详细信息

检测了亚致死浓度的茶多酚(Tea Polyphenols,TP)处理对铜绿假单胞菌交叉耐受性的诱导作用。铜绿假单胞菌暴露于1 mg·m L^(-1)茶多酚1 h后能够显著增强细菌对多种环境条件的耐受性,包括氧化剂(1 mmol·L^(-1)H_2O_2)、高温(47℃),及酸性溶液[磷酸缓冲液(pH4.0)、含有有机酸(60 mmol·L^(-1)柠檬酸、60 mmol·L^(-1)乳酸、80 mmol·L^(-1)乙酸)的磷酸缓冲液(pH4.0)]。另外,通过荧光定量RT-PCR技术分析了茶多酚诱导下铜绿假单胞菌胁迫相关基因的表达情况。研究发现,茶多酚能够显著诱导铜绿假单胞菌氧化胁迫相关基因kat B、sod M、ohr、lex A和rec N的表达,以及热激蛋白基因dnaK、groEL、htpG、grpE和groES的表达。这些胁迫相关基因的表达很可能在细菌交叉耐受性形成过程中起到重要作用。以上研究结果表明,虽然茶多酚作为天然食品添加剂具有较高的安全性,但在实际应用过程中应充分考虑茶多酚诱导细菌交叉耐受性所导致的潜在风险,以优化食品保鲜策略。

关键词：茶多酚铜绿假单胞菌交叉耐受性氧化胁迫相关基因热激蛋白基因

紫茎泽兰hsp90和hsp17.66基因启动子的克隆及其序列分析

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热带亚热带植物学报 2009年第5期17卷 451-457页

作者：宫伟娜万方浩谢丙炎郭建英周艳中国农业科学院植物保护研究所植物病虫害生物学国家重点实验室北京100081 中国农业科学院蔬菜花卉研究所北京100081

以入侵植物紫茎泽兰(Ageratina adenophora Sprengel)为材料,采用基于PCR方法的染色体步行和改良的热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)两种方法分别克隆到hsp90和hsp17.66基因的5′上游启动子序列,长度分别为864 bp和1 485 bp(GenBank登录号分别为FJ434253和FJ434252)。测序结果表明:这两个启动子序列均具有hsp启动子特有的HSE元件,及其他一些启动子顺式作用元件,如TATA-box,CAAT-box等。

关键词：紫茎泽兰热激蛋白基因启动子克隆染色体步行 TAIL-PCR

外源γ-氨基丁酸对高温胁迫下茶树生理代谢的影响

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外源γ-氨基丁酸对高温胁迫下茶树生理代谢的影响

作者：任太钰南京农业大学

学位级别：硕士

茶树[Camellia sinensis(L.)***]是一种重要的叶用型木本经济作物,目前全球变暖形势加剧,尤其是夏季极端高温天气频频出现,严重影响茶树生长发育及代谢,茶叶的产量和品质也大大降低。外源物质对植物抗逆性相关的影响研究较多,比如γ-氨... 详细信息

茶树[Camellia sinensis(L.)***]是一种重要的叶用型木本经济作物,目前全球变暖形势加剧,尤其是夏季极端高温天气频频出现,严重影响茶树生长发育及代谢,茶叶的产量和品质也大大降低。外源物质对植物抗逆性相关的影响研究较多,比如γ-氨基丁酸(GABA)在植物抗盐、抗旱等胁迫中发挥着重要作用,但是GABA作为一种氨基酸生长调节剂,对茶树抗热性相关的作用研究仍未见报道。本文以‘中茶108’为试验材料,设置4个处理组:对照组——CK(25°C/20°C);高温组——H(42°C/40°C);高温和外源喷施GABA组——H+G(42°C/40°C+5 m M GABA);高温和外源喷施3-MPA(GABA合成抑制剂)组——H+M(42°C/40°C+0.1 m M 3-MPA),并分别于处理0,4,8,24 h时取样。研究内容和结论如下:1、通过检测不同处理组在各个取样时间点下内源GABA的含量,发现高温胁迫能在短时间迅速刺激茶树叶片中GABA的积累;此外,外源GABA能进一步促进高温胁迫下茶树叶片中内源GABA含量的提升。2、通过检测植物中四大关键生理系统中的指标,探究高温胁迫下外源GABA对茶树生理的影响。结果表明,细胞膜系统:GABA能在一定程度上抑制高温胁迫下茶树叶片中MDA含量以及电导率的增加。渗透调节系统:GABA能在一定程度上促进高温胁迫下茶树叶片中可溶性糖和游离脯氨酸的累积,但可溶性糖在初期便开始积累,而脯氨酸在后期24 h才有较明显的积累。抗氧化防御系统:GABA能在一定程度上促进高温胁迫下茶树叶片中SOD、POD、CAT、APX活性的增加。光合作用系统以及气孔开度和叶绿素:GABA能在一定程度上能促进高温胁迫下茶树叶片中Pn、Cond、Tr以及叶绿素含量的增加,此外还促进高温胁迫初期4 h时气孔开度的增加,Ci则有所降低。3、通过检测茶树叶片中三大品质成分的含量,以及类黄酮合成相关酶活性和相关基因的定量表达,探究高温胁迫下外源GABA对茶叶品质的影响。结果表明,酚类:GABA提升了热胁迫下茶叶中茶多酚、儿茶素以及大多数儿茶素单体的含量水平。其中,GABA在一定程度上能提高热胁迫下茶树叶片中类黄酮代谢相关基因的表达水平(CHS、LAR和ANR除外)以及相关酶的活性,进而促进茶叶中酚类物质的积累。此外,GABA与茶多酚的含量呈显著正相关(r=0.649),尤其与儿茶素总量(r=0.837)以及与EGC含量(r=0.896)的相关性极高,但与ECG+CG、EC和C无显著相关性。氨基酸类:GABA在一定程度上能促进热胁迫下茶叶中游离氨基酸总量的增加,尤其在处理24 h的作用效果较为明显;其中对氨基酸各组分中Thea、Asp和Ser的促进作用较为明显。咖啡碱:热胁迫下,GABA对茶树叶片中咖啡碱的含量没有显著性地促进或抑制作用。4、通过检测茶树叶片中CsHSPs基因的定量表达(包括CsHSP90.1、CsHSP90.7、CsHSP70.1、CsHSP70.17、CsHSP6、CsHSP10以及CsHSP22),探究高温胁迫下外源GABA对茶树叶片中CsHSPs基因表达水平的影响。研究发现,GABA在一定程度上能够上调热胁迫下茶树叶片中CsHSP90.1、CsHSP90.7以及CsHSP22基因的表达水平,尤其对CsHSP90.7作用最为明显;其又能下调热胁迫下茶树叶片中CsHSP70.1、CsHSP6以及CsHSP10基因的表达水平,尤其对CsHSP6作用最为明显。此外推断出茶树对热胁迫的响应可能受到多个CsHSPs基因或信号通路中其它基因相互互作的调控,而GABA参与了CsHSPs基因表达水平的调控。

关键词：茶树高温胁迫 GABA 生理系统品质成分热激蛋白基因

不结球白菜耐热性鉴定方法及其耐热基因片段克隆研究

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不结球白菜耐热性鉴定方法及其耐热基因片段克隆研究

作者：胡俏强南京农业大学

学位级别：硕士

根据夏季自然高温条件下观察结果,选取耐热性差异明显的10份不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）为试验材料,探索出一套较为准确的不结球白菜苗期耐热性鉴定方法;研究了夏季高温季节栽培条件下的成株期形态指标与... 详细信息

根据夏季自然高温条件下观察结果,选取耐热性差异明显的10份不结球白菜（Brassica campestris ssp. chinensis Makino）为试验材料,探索出一套较为准确的不结球白菜苗期耐热性鉴定方法;研究了夏季高温季节栽培条件下的成株期形态指标与各品种耐热性的相关性;阐明了不结球白菜在热激条件下相关生理生化特性与品种耐热性的关系;同时还从不结球白菜中克隆得到一个小分子量热激蛋白基因BOHSP612,为进一步研究不结球白菜中热激蛋白基因打下了基础。本文主要研究结果如下： 1.不结球白菜苗期耐热性鉴定采用人工气候箱高温处理方法,分别于2009年秋季和2010年春、夏季,在6种不同的高温条件下对10份不结球白菜材料进行了连续7d的高温处理。结果表明,在不同的高温胁迫下,各供试材料均会出现不同程度的热害症状,如叶片反卷、失绿等,并随着温度的升高和处理时间的延长,热害症状加剧。春季和秋季采用37℃/27℃（d/n）处理幼苗4d后调查热害指数,可以显著反映出不结球白菜各品种间的耐热性差异。而夏季自然高温条件下育苗后在37℃/27℃（d/n）则下不能区分不结球白菜各品种间耐热性差异。 2.不结球白菜成株期耐热性鉴定采用田间自然高温鉴定方法,分别于2010年春季和夏季,对上述10份不结球白菜进行成株期耐热性鉴定,并计算其与苗期热害指数间的相关系数。结果表明,春季不结球白菜成株期各项形态指标中除叶宽与苗期热害指数显著相关外,其余指标均不显著。而夏季不结球白菜成株期形态指标中叶片数与苗期热害指数呈负相关,其余指标均呈正相关;其中株幅、叶长和叶宽与苗期热害指数呈显著正相关,叶柄长与其相关性达到极显著水平。 3.不结球白菜生理生化指标耐热性鉴定以不结球白菜苗期鉴定结果中的耐热品种雪克青和高华青,中等耐热品种三伏和抗热605以及热敏品种四月慢和矮脚黄为试验材料进行连续10天的热激处理,测定了热激处理对不结球白菜叶片中叶绿素含量、膜透性、丙二醛（MDA）、保护酶活性以及脯氨酸（Pro）含量的影响。结果表明,热激处理后,耐热品种叶片中Pro含量和SOD、POD、CAT活性的相对增幅大于热敏品种,且分别处理4（Pro）、6（SOD、CAT）和8（POD）天可以显著区分各品种间耐热性;热敏品种叶片中电导率和丙二醛（MDA）的含量的相对增幅大于耐热品种,并且处理6（电导率）和8（MDA）天效果最佳,可作为鉴定标准之一;同时热敏品种叶片中总叶绿素和叶绿素a含量相对降幅大于耐热品种,并且第4（叶绿素a）和6（总叶绿素）天耐热品种相对降幅最小,热敏品种最大,中等耐热品种居中,各品种之间差异显著,可以作为耐热性鉴定的标准。然而研究发现叶绿素b含量变化较为复杂与各品种间耐热性无显著相关。 4.不结球白菜耐热相关基因特异片段的克隆利用已发表的甘蓝耐热相关蛋白基因序列设计引物,以不结球白菜抗热品种高华青幼苗为试验材料,通过特异片段扩增,获得了不结球白菜耐热基因特异片段序列,命名为BOHSP612。序列分析发现,不结球白菜BOHSP612基因核苷酸特异片段序列长度为612bp。用BLAST进行同源性分析发现它们编码的核苷酸序列与一些芸薹属作物、拟南芥、大豆、花生等核基因组部分序列、耐热相关蛋白mRNA序列以及一些假基因和假定蛋白mRNA序列有较高同源性。

关键词：不结球白菜耐热性鉴定热害指数生理生化特性热激蛋白基因克隆

不同生态区三系杂交棉遗传效应及恢复系恢复能力分析

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不同生态区三系杂交棉遗传效应及恢复系恢复能力分析

作者：崔艳利中国农业科学院

学位级别：硕士

棉花三系法制种不仅成本低、速度快，且简便高效，备受人们关注。近年来，我国虽然在三系杂交育种选育与应用方面取得了一定进展，但是在生产应用和优势组合选育方面仍存在着一些问题，如恢复系的育性恢复能力受到外界环境条件的影响等... 详细信息

棉花三系法制种不仅成本低、速度快，且简便高效，备受人们关注。近年来，我国虽然在三系杂交育种选育与应用方面取得了一定进展，但是在生产应用和优势组合选育方面仍存在着一些问题，如恢复系的育性恢复能力受到外界环境条件的影响等，在一定程度上限制了三系杂交棉的应用与发展。因此对三系杂交棉进行研究探索是非常有必要的。本研究利用3个核背景不同的恢复系材料和7个不同的哈克尼西棉胞质不育材料及其配置的21个F1后代通过不同试点种植、性状调查、室内考种，利用ADE模型和SAS统计软件分析的方法，明确棉花产量和纤维品质的遗传效应和优势组合、探索遗传背景对恢复系恢复能力的影响及其与温度等外界条件的关系。此外，利用哈克尼西棉细胞质雄性不育系、保持系和恢复系以及恢复基因近等基因系材料，通过实时荧光定量PCR技术对17个热激蛋白基因进行了分析，以期在在分子水平上对恢复系育性恢复能力与温度的相关性进行初步研究。取得的结果如下： 1.选用3个核背景不同的恢复系材料和7个不同的哈克尼西棉胞质不育材料及其通过NCⅡ遗传交配设计配置的21个杂交组合，分别在三个不同的生态区种植。对21个三系杂交组合的遗传效应分析结果显示，产量和纤维品质性状均受到加性效应的显著影响，产量性状均受到加性与环境互作效应的影响，而纤维品质中只有纤维长度和马克隆值受到加性与环境互作效应的影响。 2.对恢复系ZBR、H46和H80的恢复能力进行分析，结果表明，安阳和无为两个地点均表现为恢复系H46和H80的育性高于恢复系ZBR，且亲本为恢复系H46和H80的F1代在花粉育性和产量上均高于以恢复系ZBR为亲本的杂交组合;恢复系的恢复能力不仅与恢复系本身有关，还与其所种植的试验点所处的生态环境有关;F1花粉育性与产量之间呈极显著相关。 3.利用HSP基因对两套近等基因系材料以及3个恢复系材料进行荧光定量分析。实验结果表明，HSP基因GhiSP-5、GhiSP-8、GhiSP-14、GhiSP-17在两套近等基因系材料中表达相似，但在恢复系材料中GhiSP-5与其他3个基因表达差异较大，其基因来源也各不相同;HSP基因GhiSP-1、GhiSP-2、GhiSP-3、GhiSP-6，在恢复能力较强的恢复系H46中表达量较低，且在两套近等基因系材料中具有类似的表达模式。这些结果为进一步研究恢复基因的作用机理奠定了基础。

关键词：遗传背景遗传效应生态环境恢复能力热激蛋白基因