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食品科学 2023年第13期44卷 1-8页

作者：马旭华李亚蕾罗瑞明张杏亚宁夏大学食品与葡萄酒学院宁夏银川750021

为探究秦川牛宰后热休克蛋白a6(heat shock protein a6,HSPa6)差异表达对肉品质的影响,以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为研究对象,测定贮藏0、2、4、6、8 d时肉品质变化情况;基于4D-非标记定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)... 详细信息

为探究秦川牛宰后热休克蛋白a6(heat shock protein a6,HSPa6)差异表达对肉品质的影响,以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为研究对象,测定贮藏0、2、4、6、8 d时肉品质变化情况;基于4D-非标记定量(4D-label free quantification,4D-LFQ)蛋白质组学分析宰后秦川牛背最长肌中HSP70家族成员HSPa6及相关差异蛋白表达情况。结果表明:随贮藏时间延长,HSPa6表达量呈下降趋势,三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate,ADP)、单磷酸腺苷(adenosine monophosphate,AMP)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide,NADH)含量均呈下降趋势,肌纤维小片化指数(myofibril fragmentation index,MFI)呈上升趋势,剪切力、离心损失率均呈先上升后下降趋势;由相关性分析结果可知,HSPa6表达量与ATP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关(Pa6降解与牛肉能量代谢及保水性有密切联系。蛋白质组学分析发现贮藏过程中表达量变化显著的差异蛋白中有24种与HSPa6表达相关,通过碳水化合物衍生物结合、嘌呤核苷三磷酸结合等途径引起蛋白酶体介导泛素依赖性蛋白质分解代谢、细胞蛋白分解等,造成代谢紊乱或者代谢失衡,同时还能够控制蛋白质降解、细胞凋亡等变化,进而影响肌肉结构变化,降低组织能量水平,并通过抗细胞结构蛋白降解最终影响秦川牛肉的嫩度、MFI及保水性。

关键词：秦川牛背最长肌 4D-非标蛋白质组学热休克蛋白a6 肉品质

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牛HSPa6蛋白特性分析及蛋白互作网络构建

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食品科学 2024年第3期45卷 1-8页

作者：胡丽筠马旭华李亚蕾罗瑞明宁夏大学食品科学与工程学院宁夏银川750000

通过构建牛热休克蛋白a6(heat shock protein a6,HSPa6)序列与其他生物的系统进化树,以及运用生物信息学方法分析牛HSPa6蛋白的基本理化性质、亲疏水性等,并结合蛋白互作网络,探究牛HSPa6基因编码蛋白的结构和功能特性。结果显示,牛HSPA... 详细信息

通过构建牛热休克蛋白a6(heat shock protein a6,HSPa6)序列与其他生物的系统进化树,以及运用生物信息学方法分析牛HSPa6蛋白的基本理化性质、亲疏水性等,并结合蛋白互作网络,探究牛HSPa6基因编码蛋白的结构和功能特性。结果显示,牛HSPa6蛋白与羊、长江江豚等哺乳动物的氨基酸序列相似性较高;牛HSPa6蛋白分子质量为70 570.64 u,理论等电点为5.66,为酸性亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;可能存在11个得分>0.900的磷酸化位点,与N-糖基化激活位点可能位于后端碱基;牛HSPa6蛋白是一种主要由40.38%的α-螺旋和33.65%的无规卷曲组成的二级结构相对稳定的蛋白质,包含N-端核苷酸结合域和C-端多肽结合域两个主要的结构域,主要在细胞质中发挥作用;蛋白质互作网络构建结果显示,牛HSPa6蛋白主要与BAG1、DNAJA4、DNAJB1、DNAJC2等蛋白发生互作,参与腺苷酸交换因子活性、ATP酶调节活性、伴侣绑定等,表明牛HSPa6蛋白在牛机体能量代谢等过程中发挥潜在生物学功能。这些多重生物信息学分析为深入探讨牛HSPa6蛋白对肉品质的影响机制提供了理论依据。

关键词：牛热休克蛋白a6 结构特点功能特性蛋白质互作网络

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HSPa6在TBC1D3癌基因调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用

HSPA6在TBC1D3癌基因调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用

引用

作者：彭小伟东南大学

学位级别：硕士

研究目的TBC1D3癌基因最初是在人前列腺癌细胞中发现的,该基因在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和骨髓增生异常综合征等组织中均高表达,高表达的TBC1D3能使小鼠NIH 3T3成纤维细胞恶性转化为肿瘤细胞,把恶性转化细胞注入... 详细信息

研究目的TBC1D3癌基因最初是在人前列腺癌细胞中发现的,该基因在多种肿瘤包括前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、胰腺癌和骨髓增生异常综合征等组织中均高表达,高表达的TBC1D3能使小鼠NIH 3T3成纤维细胞恶性转化为肿瘤细胞,把恶性转化细胞注入裸鼠体内,可导致肿瘤形成,但其机制尚不十分清楚,特别是TBC1D3对乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响及其机制还有待阐明。我们前期的转录组高通量测序结果提示,癌基因TBC1D3高表达可上调人MCF-7乳腺癌细胞中HSPa6表达,而HSPa6属于热休克蛋白70(HSP70)家族,该家族成员在众多恶性肿瘤组织中高表达,能促进细胞增殖并在肿瘤的化疗耐药中至关重要。因此,本实验主要探讨癌基因TBC1D3对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响以及HSPa6在其中的作用。研究方法1.为了探讨TBC1D3在调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以未转染细胞为空白对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag空载体和Flag-TBC1D3质粒分别转染人MCF-7非三阴性乳腺癌细胞和BT549三阴性乳腺癌细胞,24 h后,用CCK8方法检测转染后不同时间点(如0h、12 h、24 h、36 h、48 h)、抗肿瘤药物表阿霉素(Epirubicin,EPI)处理细胞后不同时间点(如0h、12 h、24 h、36h、48 h)、或不同浓度(如0、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L)EPI处理细胞24 h后存活的细胞,分析癌基因TBC1D3高表达对人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性的影响。2.为了研究癌基因TBC1D3在调节人乳腺癌细胞的增殖和化疗敏感性中的作用机制,我们用Lipofectamine(?)3000方法将Flag空载体和Flag-TBC1D3分别转染MCF-7细胞或BT549细胞,然后提取细胞总RNA进行实时定量RT-PCR,检测HSPa6 mRNA水平,或提取细胞裂解物进行Western blot,检测HSPa6蛋白水平,以验证我们前期的转录组高通量测序结果:TBC1D3高表达上调MCF-7细胞中HSPa6表达。3.为了明确HSPa6在癌基因TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性中的作用,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag-TBC1D3分别转染 MCF-7 和 BT549 细胞,用 DMSO、HSPa6 功能抑制剂 Apoptozole(AZ)、EPI 单独,或AZ和EPI两者合用处理细胞,24 h后,用CCK8方法检测存活的细胞,分析HSPa6功能抑制对癌基因TBC1D3调节乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的影响。4.为初步探讨HSPa6功能的抑制使TBC1D3促进乳腺癌细胞增殖和降低细胞EPI化疗敏感性的作用丧失机制,我们以Flag空载体为对照,用Lipofectamine(?)3000方法将Flag-TBC1D3分别转染人乳腺癌MCF-7和BT549细胞,并用DMSO或15 μmol/L AZ处理细胞,24 h后,用Western blot方法检测细胞内Flag-TBC1D3蛋白水平,分析HSPa6功能抑制对人乳腺癌细胞内TBC1D3蛋白稳定性的影响。研究结果***1D3癌基因促进人乳腺癌细胞增殖和降低乳腺癌细胞对表阿霉素化疗的敏感性:在探讨TBC1D3调节人乳腺癌细胞增殖和化疗敏感性的研究中,CCK8细胞增殖实验显示,与未转染细胞和转染Flag空载体细胞相比较,转染Flag-TBC1D3的人MCF-7和BT549乳腺癌细胞增殖显著增加。用不同浓度表阿霉素(Epirubicin,EPI)进行的CCK8细胞毒性实验显示,随着EPI浓度的增高,未转染组、转染Flag空载体组和转染Flag-TBC1D3组的存活细胞数均逐渐减少,除所用的最低浓度2.5 mmol/L和最高浓度80 mmol/L外,在 5、10、20、40 和 60 mmol/L 等其它浓度,Flag-TBC1D3 转染使 MCF-7细胞和BT549细胞对EPI的敏感性显著降低,MCF-7和BT549细胞存活分别较Flag空载体组和未转染组增加最多可达约60%和约30%。用20 mmol/L和40 mmol/L的EPI处理细胞不同时间的CCK8细胞毒性实验显示,EPI处理12 h后,Flag-TBC1D3虽能使MCF-7细胞和BT549细胞对较高浓度(40mmol/L)EPI的敏感性均显著降低,但仅能显著降低BT549细胞对低浓度(20mmol/L)EPI的敏感性;处理24h和36h后,Flag-TBC1D3使两种细胞无论对较高还是较低浓度EPI的敏感性均显著降低;处理48 h后,Flag-TBC1D3虽能显著降低两种细胞对较低浓度(20 mmol/L

关键词： TBC1D3 增殖热休克蛋白a6 表阿霉素 Apoptozole

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秦川牛宰后肉品质变化对HSPa6差异表达的响应机理

秦川牛宰后肉品质变化对HSPA6差异表达的响应机理

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作者：马旭华宁夏大学

学位级别：硕士

热休克蛋白对肉品质稳定性具有重要的调控作用。目前,对肉品质的影响研究主要集中于小分子HSPs,而尚未发现大分子中热休克蛋白a6相关报道。本文以宰后4℃条件下不同成熟期秦川牛背最长肌为研究对象,通过鉴定HSPa6及其表达量、能量水平... 详细信息

热休克蛋白对肉品质稳定性具有重要的调控作用。目前,对肉品质的影响研究主要集中于小分子HSPs,而尚未发现大分子中热休克蛋白a6相关报道。本文以宰后4℃条件下不同成熟期秦川牛背最长肌为研究对象,通过鉴定HSPa6及其表达量、能量水平、品质特性变化,鉴定与HSPa6相关的差异蛋白质,采用生物信息学方法分析肉品质变化对热休克蛋白差异表达的响应机理。主要研究结果如下:1、以4℃条件下贮藏的秦川牛背最长肌为对象,探究秦川牛宰后成熟贮藏期间背最长肌中HSPa6降解及其与肉品质间的关系。研究了 4℃条件下不同成熟期牛肉中HSPa6表达量变化与能量物质水平及肉品质变化的关系。随贮藏时间增加,HSPa6表达量呈下降趋势,能量物质三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、腺苷酸、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸含量均呈下降趋势,品质指标pH呈先降低后升高趋势,b*值和肌纤维小片化指数呈上升趋势,L*值、a*值、剪切力、离心损失均呈先上升后下降趋势;相关性分析表明,HSPa6表达量与ATP含量、NADH含量、剪切力呈显著正相关（P＜0.05）;与L*、b*呈显著负相关（P＜0.05）;与MFI、离心损失呈极显著负相关（P＜0.01）,与ADP、AMP、pH、a*无显著相关性,表明秦川牛背最长肌在贮藏过程中HSPa6降解与牛肉能量代谢及保水性有密切联系。2、采用4D-非标定量蛋白质组学技术探究贮藏期间秦川牛肉HSPa6降解机理,设置差异倍数1.3,鉴定相关差异表达蛋白质,并通过功能特性富集,筛选出24种与HSPa6变化相关的DEPs,对其与HSPa6表达量作相关性分析及生物信息学分析,发现与HSPa6相关的差异表达蛋白包括三磷酸核苷酶和水解酶等具有催化功能的蛋白质及可与碳水化合物衍生物及嘌呤核苷三磷酸等结合功能的两类蛋白质。以上蛋白质的差异表达与蛋白质分解代谢有关。3、查阅Uniprot数据库中已录牛HSPa6基因编码蛋白序列搜索到其结构与功能特性描述,其分子量为70.6kDa,是酸性、亲水性蛋白质;经蛋白质功能预测表明,牛HSPa6具有11个可能发生磷酸化的位点,存在特异性磷酸化信号,可能通过宰后牛肉中所发生的蛋白质翻译后修饰进一步调控蛋白质结构、功能活性及蛋白质间的相互作用;经序列分析表明,该蛋白质C-末端具有一个有细胞质定位的特征基序EEVD,属于HSP70家族蛋白位于细胞质的一个保守序列;该蛋白质的二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,较为稳定;蛋白质三级结构ATP酶结构域和肽结合域分别被折叠成球形结构,并通过无规则卷曲的链链接,通过ATP酶结构域的ATP-ADP转换活性的作用影响ATP水解及核苷酸交换,完成底物结合、释放循环,从而影响宰后牛肉发生细胞凋亡和蛋白水解等变化。蛋白质互作网络构建结果显示,牛HSPa6主要与BAG1、DNAJA4、DNAJB1等蛋白存在互作关系,也会与其以聚合体形式发挥作用,保证蛋白质正确折叠及其降解、细胞凋亡和蛋白水解等变化,进而影响肌肉结构变化,最终影响嫩度、持水性等肉品质,明确肉品质变化对热休克蛋白差异表达的响应机理。

关键词：秦川牛肉热休克蛋白a6 4D-非标定量蛋白质组学肉品质

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