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烟草环斑病毒和番茄环斑病毒的半巢式RT-PCR检测

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植物保护学报 2007年第1期34卷 61-66页

作者：闻伟刚崔俊霞盛蕾宁波出入境检验检疫局浙江宁波315012

烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）和番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式***方法对这两种病毒进行了检测，用Trizol快速提取病毒总RNA，并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋... 详细信息

烟草环斑病毒（Tobacco ringspot virus，TRSV）和番茄环斑病毒（Tomato ringspot virus，ToRSV）是我国禁止入境的检疫性有害生物。采用半巢式***方法对这两种病毒进行了检测，用Trizol快速提取病毒总RNA，并根据TRSV和ToRSV的外壳蛋白基因设计特异性引物，经过第一轮RT-PCR和第二轮半巢式PCR扩增，TRSV样本分别得到359bp和206bp特异性片段，TORsV样本分别得到340bp和219bp特异性片段。半巢式***扩增产物的测序表明，TRSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在88％～97％的同源性，TORSV产物序列与GenBank中登录的外壳蛋白基因存在96％～100％的同源性。研究显示，DAS-ELISA与RT-PCR的检测灵敏度相近，而半巢式RT-PCR的检测灵敏度比这两种方法高出10^3倍以上。

关键词：烟草环斑病毒番茄环斑病毒半巢式RT-PCR 检测灵敏度

烟草环斑病毒RT-RealtimePCR检测方法

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植物保护学报 2007年第2期34卷 157-160页

作者：杨伟东郑耘陈枝楠章桂明吴绍精深圳出入境检验检疫局广东深圳518001

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条... 详细信息

烟草环斑病毒(Tobacco ringspotvirus,TRSV)是我国公布的二类检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大。受该病毒侵染的一些寄主植物出现隐症,并伴随病毒浓度降低,给检测工作造成困难。根据TRSV外壳蛋白基因序列设计合成了一对引物及一条MGB探针,优化了反应条件,建立了TRSV实时荧光RT-PCR检测方法。该方法与常规的DAS-ELISA方法和RT-PCR方法相比,灵敏度分别提高了200倍和4倍,并且对不同寄主上的TRSV均有较好的检测效果。

关键词：烟草环斑病毒 RT-PCR

烟草环斑病毒DB-RT-Realtime PCR检测方法研究

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植物保护 2007年第1期33卷 117-120页

作者：郑耘杨伟东陈枝楠李明福章桂明余道坚张永江深圳出入境检验检疫局深圳518001 中国检验检疫科学院动植物检疫研究所北京100025

本研究首次应用直接结合反转录实时荧光PCR技术(direct binding reverse transcription realtime PCR,DB-RT-Re-altime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了PCR管吸附病毒外壳蛋白、病毒核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,... 详细信息

本研究首次应用直接结合反转录实时荧光PCR技术(direct binding reverse transcription realtime PCR,DB-RT-Re-altime PCR)检测烟草环斑病毒,由于综合运用了PCR管吸附病毒外壳蛋白、病毒核酸分子杂交、高灵敏度实时荧光PCR技术的优点,从而使病毒检测在特异性、灵敏度、稳定性等技术指标上比传统的DAS-ELISA方法都有所提高,解决了烟草环斑病毒检测工作中由于隐症、干扰物质存在而影响检测结果的问题,为病毒检测提供了一个快速、简便有效的检测方法。

关键词：烟草环斑病毒反转录PCR 检测

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烟草环斑病毒RT-PCR检测体系的优化

山东农业科学 2021年第6期53卷 98-102页

作者：郇晓雪刘晓宇房乐杜传印李广强耿超李向东田延平山东农业大学植物保护学院山东泰安271018 山东潍坊烟草公司山东潍坊261061 枣庄市农业农村事业发展中心山东枣庄277899

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种,是我国公布的二类进境检疫有害生物。建立特异性强、灵敏性高的检测体系是有效控制TRSV传播的技术保障。本研究在分析... 详细信息

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是豇豆花叶病毒科(Comoviridae)线虫传多面体病毒属(Nepovirus)的代表种,是我国公布的二类进境检疫有害生物。建立特异性强、灵敏性高的检测体系是有效控制TRSV传播的技术保障。本研究在分析引物的特异性、优化退火温度及dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶浓度的基础上,建立了完善的TRSV RT-PCR检测体系。筛选出的TRSV特异性引物对为1-1F/1-1R,在退火温度为53℃、dNTPs终浓度为0.075 mmol/L、引物终浓度为0.30μmol/L、Taq DNA聚合酶终浓度为0.035 U/μL条件下检测效率最高,可从发病植物总RNA量为0.090 ng中检测到目的片段。研究结果对准确灵敏地检测TRSV具有重要意义。

关键词：烟草环斑病毒检测体系逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 优化

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烟草环斑病毒的检疫检测方法

植物检疫 1999年第4期13卷 215-217页

作者：陈燕芳陈京宋淑敏李明福农业部植物检疫实验所

通过研究，提出了烟草环斑病毒的血清学、生物学、免疫电镜等检测方法。初步建立了一套烟草环斑病毒的检测程序。

关键词：烟草环斑病毒生物鉴定免疫电镜血清学测定

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烟草环斑病毒无侵染性组分的分离

植物检疫 2000年第4期14卷 193-195页

作者：魏梅生李桂芬陈燕芳李明福农业部植物检疫实验所北京100029

采用 10 %～ 40 %的蔗糖梯度离心 ,将烟草环斑病毒无侵染性的病毒组分分开 ,获得了具抗原性但无侵染性的病毒外壳 ,可作为酶联免疫吸附试验中的阳性对照。

关键词：烟草环斑病毒提纯无侵染性组分检疫

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烟草环斑病毒磁免疫层析试纸条的研制

植物检疫 2014年第2期28卷 24-27页

作者：魏梅生李桂芬马洁鲁洁张永江孔君中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所北京100029

烟草环斑病毒是我国检疫性有害生物,为防止该病毒传入国内,需建立快速的诊断和检测方法。将烟草环斑病毒的多克隆抗体吸附到磁性纳米颗粒上,研制出磁免疫层析检测试纸条。该试纸条可特异性检测烟草环斑病毒,检测部分提纯病毒的灵敏度为1... 详细信息

烟草环斑病毒是我国检疫性有害生物,为防止该病毒传入国内,需建立快速的诊断和检测方法。将烟草环斑病毒的多克隆抗体吸附到磁性纳米颗粒上,研制出磁免疫层析检测试纸条。该试纸条可特异性检测烟草环斑病毒,检测部分提纯病毒的灵敏度为1μg/mL,检测烟草病汁液可稀释1000倍(重量/体积)。该试纸条和线虫传多面体病毒属的番茄环斑病毒、番茄黑环病毒、南芥菜花叶病毒和葡萄扇叶病毒未出现交叉反应,可用于烟草环斑病毒的现场检测。

关键词：烟草环斑病毒磁免疫层析试纸条

烟草环斑病毒外壳蛋白基因的原核表达及抗血清的制备

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中国病毒学 2005年第4期20卷 434-437页

作者：朱常香宋云枝王玫玫王秀芳温孚江山东农业大学生命科学学院山东泰安271018 中国农业科学院烟草研究所山东青州262500 山东省作物生物学重点实验室山东泰安271018

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构... 详细信息

烟草环斑病毒(Tobacco ringspot virus,TRSV)是我国二类进境检疫危险性有害生物,对农业生产危害较大.本研究依据TRSV外壳蛋白基因cp序列设计合成了2条引物,通过RT PCR扩增得到长约1500bp的目的片段.将目的片段与质粒pET-22b(+)连接,构建了含TRSV cp基因的融合蛋白原核表达载体pETRSV-CP.序列分析表明,TRSV-SD1的cp基因全长1548bp,编码515个氨基酸与GenBank中其它TRSV分离物cp基因相比,核苷酸及推导的氨基酸序列同源性为90.7%～94.6%.将pETRSV-CP转入大肠杆菌,诱导表达.SDS-PAGE结果显示,表达的TRSV CP融合蛋白的相对分子质量约为58kDa.以此融合蛋白制备的抗血清的效价为1/1024,抗血清与TRSV具有良好的特异性反应.

关键词：烟草环斑病毒外壳蛋白基因原核表达抗血清

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烟草环斑病毒检测及其cp基因片段原核表达

烟草环斑病毒检测及其cp基因片段原核表达

作者：乔艳艳西北农林科技大学

学位级别：硕士

本研究根据genbank中公布的烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)5个分离物的外壳蛋白全序列设计3对特异性引物,建立了烟草环斑病毒分子生物学(包括RT-PCR、巢式PCR、实时荧光RT-PCR)检测体系,研究了每对引物的特异性,通过提纯的... 详细信息

本研究根据genbank中公布的烟草环斑病毒(Tobacco ring spot virus,TRSV)5个分离物的外壳蛋白全序列设计3对特异性引物,建立了烟草环斑病毒分子生物学(包括RT-PCR、巢式PCR、实时荧光RT-PCR)检测体系,研究了每对引物的特异性,通过提纯的TRSV粗提液进行灵敏度试验,并与双抗体夹心酶联免疫吸附法(DAS-ELISA)、胶体金免疫试纸条法(CGIS)检测的灵敏度进行比较研究。结果表明:所设计引物的特异性好,均不与同属其他种病毒发生交叉反应;在进行灵敏度试验时,DAS-ELISA、CGIS最低检测量分别为100ng和200ng,TRSV-F/R-1的RT-PCR最低检测量10ng,TRSV-F/R-2的RT-PCR最低检测量1ng,巢式PCR与实时荧光RT-PCR当病毒含量只有100pg时仍可检测到。在引物TRSV-F/R-1上分别引入EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点,以接种在白肋烟上的TRSV为模板,扩增出744bp的TRSV外壳蛋白(TRSV-CP)基因,并将其克隆到PMD-18T载体上,提取质粒进行酶切,得到的TRSV-CP基因再重组到原核表达载体pET-28a中,通过菌落PCR、酶切鉴定及序列测定。结果表明,重组质粒pET-TRSV连接区域符合设计要求,具有正确的开放阅读框架,插入片段含有编码248个氨基酸的完整编码区,推测该段氨基酸序列与报道的TRSV外壳蛋白序列的同源性最高达99.2%。重组表达载体导入宿主菌BL2(1DE3),以终浓度为0.4mM /L的IPTG诱导,37℃培养4h后,SDS-PAGE电泳鉴定,得到34kDa的目的蛋白。大量诱导蛋白表达,并经过Ni+-NTA纯化,纯化后的蛋白经Western blot分析,再次证明所得的蛋白就是TRSV的外壳蛋白,并且具有免疫学活性。以纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔,制备了多抗血清。ELISA结果表明,免疫的1号和2号两只新西兰大白兔多抗血清与重组蛋白发生很好的抗原抗体反应,效价分别为409600和819200,特异性较好,为开发TRSV血清检测试剂盒打下基础。

关键词：烟草环斑病毒检测技术外壳蛋白原核表达