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炭疽芽胞杆菌BslA_((260-652))蛋白的表达纯化与黏附功能鉴定

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微生物学报 2012年第3期52卷 360-366页

作者：马坤王艳春陶好霞董杰曹诚张部昌刘纯杰安徽大学生命科学学院合肥230039 军事医学科学院生物工程研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071

【目的】克隆表达炭疽芽胞杆菌BlsA的功能区片段并对其生物学功能进行鉴定。【方法】以炭疽芽胞杆菌A16R基因组DNA为模板PCR扩增bslA(260-652)基因片段,克隆至pET-28a(+)载体。将成功构建的重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导... 详细信息

【目的】克隆表达炭疽芽胞杆菌BlsA的功能区片段并对其生物学功能进行鉴定。【方法】以炭疽芽胞杆菌A16R基因组DNA为模板PCR扩增bslA(260-652)基因片段,克隆至pET-28a(+)载体。将成功构建的重组质粒转化入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,诱导表达后收集菌体经超声破碎后,对可溶表达部分用镍柱进行亲和层析纯化。以纯化后的蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备该蛋白的多抗,用ELISA和Western blot检测抗血清;使用间接免疫荧光实验和细菌黏附实验研究目标蛋白及其抗体的生物学功能。【结果】BslA(260-652)获得了可溶性表达,纯化后纯度约为87.4%。以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠制备的抗血清ELISA效价可达1∶20000。将BslA(260-652)蛋白与Hela细胞共孵育后,能够直接和Hela的细胞膜结合。细菌黏附实验表明BslA(260-652)蛋白及其相应的多抗血清都能够显著地抑制炭疽芽胞杆菌A16R对Hela细胞的黏附。【结论】大肠杆菌表达得到的炭疽芽胞杆菌BslA(260-652)蛋白具有与天然蛋白相似的生物活性,为深入研究BslA蛋白在炭疽芽胞杆菌致病过程中的作用奠定实验基础。

关键词：炭疽芽胞杆菌 BslA蛋白多克隆抗体免疫荧光黏附

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炭疽芽胞杆菌中CRISPR位点

微生物学报 2014年第11期54卷 1362-1368页

作者：高志奇王东澍冯尔玲王秉翔惠一鸣韩少波焦磊刘先凯王恒樑军事医学科学院生物工程研究所病原微生物生物安全国家重点实验室北京100071 兰州生物制品研究所有限责任公司甘肃兰州730046

【目的】考察炭疽芽胞杆菌中规律成簇的间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位点多态性情况及基于CRISPR位点多态性的分子分型方法是否在炭疽芽胞杆菌分型中适用。【方法】下载NCBI数据... 详细信息

【目的】考察炭疽芽胞杆菌中规律成簇的间隔短回文序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)位点多态性情况及基于CRISPR位点多态性的分子分型方法是否在炭疽芽胞杆菌分型中适用。【方法】下载NCBI数据库中6株炭疽芽胞杆菌基因组并截取其中CRISPR位点片段序列。根据炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点信息,设计相关引物,以193株炭疽芽胞杆菌基因组为模板PCR扩增CRISPR位点片段,测序。本地Blast比对截取序列及测序结果,查看CRISPR位点在炭疽芽胞杆菌中的多态性情况,并比较炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌内CRISPR位点情况。【结果】炭疽芽胞杆菌内CRISPR位点不存在多态性。【结论】基于CRISPR位点多态性的分子分型方法不适用于炭疽芽胞杆菌分型,但可以用于区分炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌。

关键词：规律成簇间隔短回文重复序列炭疽芽胞杆菌分子分型

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炭疽芽胞杆菌疫苗研究进展

微生物学报 2005年第1期45卷 149-152页

作者：展德文王芃王令春张兆山军事医学科学院生物工程研究所北京100071

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘... 详细信息

炭疽芽胞杆菌引起的炭疽病死亡率非常高 ,当前的疫苗具有效力不稳定、对吸入性炭疽的保护率低、免疫程序繁琐、存在副作用等缺点。近年来人们在改造传统疫苗的同时又有一些新的发现 ,如保护性抗原 (PA)的抗体在体内可杀死芽胞 ;通过粘膜免疫能够诱导机体分泌IgA抗体 ;抗多聚谷氨酸 (γ D PGA)抗体可以同炭疽杆菌的繁殖体作用 ,从而杀死繁殖体 ;寻找到新的免疫原。DNA疫苗、活载体疫苗的出现为新一代安全、免疫程序简单。

关键词：炭疽芽胞杆菌保护性抗原疫苗

炭疽芽胞杆菌基因组中串联重复序列拷贝数的分析

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中华微生物学和免疫学杂志 2006年第9期26卷 786-789页

作者：田国忠俞东征海荣魏建春马凤琴蔡虹张建华郑玉红付秀萍张志凯张恩民徐冬蕾中国疾病预防控制中心传染病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室北京102206

目的研究炭疽芽胞杆菌基因组中多位点串联重复序列遗传标记的遗传变异规律。方法根据文献上发表的串联重复序列位点,利用已发表的13对引物,对88株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用凝胶影... 详细信息

目的研究炭疽芽胞杆菌基因组中多位点串联重复序列遗传标记的遗传变异规律。方法根据文献上发表的串联重复序列位点,利用已发表的13对引物,对88株炭疽芽胞杆菌基因组DNA进行PCR扩增,扩增产物进行琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳,利用凝胶影像分析软件对PCR产物DNA片段的碱基含量进行测算,计算出串联重复拷贝数。对部分PCR扩增产物DNA片段进行测序,利用DNAStar软件进行序列比对,分析不同菌株间的串联重复序列遗传变异规律。结果(1)炭疽芽胞杆菌基因组中的串联重复序列位置,同一菌株具有相对稳定的串联重复拷贝数。(2)88株炭疽芽胞杆菌DNA上的13个串联重复序列遗传标记中,有的串联重复序列拷贝数变异较小,有的却存在着复杂的多态性;(3)有些串联重复序列单位内的核苷酸数目不变,但核苷酸的排列组合有差异,不过其重复单位内都包含着一个相同的稳定不变的核心核苷酸序列。结论炭疽芽胞杆菌基因组DNA中串联重复序列可以精确定位,测定结果可以数值化,并且串联重复序列在菌株DNA中具有相对的稳定性,因此,串联重复序列是研究炭疽芽胞杆菌遗传特征的较好指标,具有鉴别炭疽芽胞杆菌菌株间差别的能力。

关键词：炭疽芽胞杆菌串联重复序列

Cre-LoxP系统在炭疽芽胞杆菌基因敲除中的应用及eag基因的敲除

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生物化学与生物物理进展 2009年第7期36卷 934-940页

作者：王艳春姜娜展德文邱炎袁盛凌陶好霞王令春张兆山刘纯杰军事医学科学院生物工程研究所病原微生物与生物安全国家重点实验室北京100071

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以***基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化***422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过... 详细信息

将Cre-LoxP系统应用于Bacillus anthracis中并成功敲除eag基因.以***基因组为模板扩增得到上下游同源臂,联合两端带有LoxP位点的壮观霉素抗性基因片段构建好同源重组载体,转化***422,通过一系列筛选得到带有抗性标记的重组菌.然后,通过转入Cre重组酶表达质粒,去除抗性标记,得到eag基因缺失的重组菌,并在DNA水平、RNA水平和蛋白质水平进行了系统的鉴定.最终建立了Cre-LoxP系统在***中的应用方法,并成功敲除eag基因.

关键词：炭疽芽胞杆菌 Cre-LoxP系统 eag基因同源重组基因敲除

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炭疽芽胞杆菌的感染与生物恐怖

环境与健康杂志 2003年第5期20卷 318-320页

作者：张致一陈锦英天津市卫生防病中心微生物学部天津300011 天津医科大学天津300070

综述了炭疽生物恐怖、炭疽在中国的流行概况、实验室诊断方法的最新进展。同时介绍了炭疽的预防与控制,提出了应对可能发生的生物恐怖应采取的措施。

关键词：炭疽芽胞杆菌感染生物恐怖

中国炭疽芽胞杆菌多位点可变数目串联重复序列分析基因型多态性

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中华流行病学杂志 2024年第7期45卷 990-996页

作者：张慧娟张恩民贺金荣李伟魏建春传染病溯源预警与智能决策全国重点实验室中国疾病预防控制中心传染病预防控制所北京102206

目的分析中国炭疽芽胞杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)基因型多态性,建立中国炭疽芽胞杆菌MLVA基因型数据库。方法收集1947年以来中国不同来源的炭疽芽胞杆菌分离菌株,采用MLVA15分型策略进行基因型鉴定,对基因型进行统一编... 详细信息

目的分析中国炭疽芽胞杆菌多位点可变数目串联重复序列分析(MLVA)基因型多态性,建立中国炭疽芽胞杆菌MLVA基因型数据库。方法收集1947年以来中国不同来源的炭疽芽胞杆菌分离菌株,采用MLVA15分型策略进行基因型鉴定,对基因型进行统一编号和命名,分析不同来源菌株MLVA基因型的分布特征,同时通过Bionumerics软件绘制聚类图,分析不同基因型间的遗传关系。结果MLVA15分型可将533株中国炭疽芽胞杆菌分为4群91个基因型,其中54个基因型为中国独有的基因型。新命名的基因型MLVA15-CHN1~MLVA15-CHN6广泛分布于中国不同地区、不同年代和宿主,其余基因型具有地区和年代特征性。结论本研究建立了中国炭疽芽胞杆菌MLVA基因型数据库,掌握了MLVA基因型分布特征及其遗传多态性,为中国炭疽疫情防控及分子溯源技术提供了参考依据。

关键词：炭疽芽胞杆菌基因分型多位点可变数目串联重复序列分析遗传多态性

炭疽芽胞杆菌保护性抗原及致死因子融合蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

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炭疽芽胞杆菌保护性抗原及致死因子融合蛋白的原核表达及间接ELIS...

作者：吕双飞石河子大学

学位级别：硕士

目的:炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)所引起的一种急性、烈性人畜共患病。由于近几年不时有炭疽爆发或散发,因此牛羊炭疽疫苗的免疫被列入免疫程序,目前中国应用于动物上的炭疽疫苗主要是Ⅱ号炭疽芽孢疫苗和无荚膜... 详细信息

目的:炭疽(Anthrax)是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)所引起的一种急性、烈性人畜共患病。由于近几年不时有炭疽爆发或散发,因此牛羊炭疽疫苗的免疫被列入免疫程序,目前中国应用于动物上的炭疽疫苗主要是Ⅱ号炭疽芽孢疫苗和无荚膜炭疽芽孢疫苗,但目前由于缺乏快速敏感的抗体检测技术,导致无法明确评价炭疽疫苗的免疫效果。故本实验通过诱导表达PA-LF1融合蛋白来建立炭疽芽胞杆菌抗体间接ELISA检测方法,为炭疽疫苗免疫动物后的抗体效价及抗体消长的检测提供技术支持。方法:(1)利用PCR技术分别扩增炭疽芽胞杆菌弱毒C40-202株PA、LF1的基因,通过XhoⅠ粘性末端连接获得PA-LF1融合基因,连接T载体克隆测序,软件预测PA、LF1及PA-LF1蛋白结构和比对序列相似性;构建p ET32a-PA-LF1的表达载体,IPTG诱导表达后,表达蛋白经SDS-PAGE和Western blot鉴定,通过SDS-PAGE对PA-LF1融合蛋白进行可溶性检测,对PA-LF1融合蛋白纯化时的咪唑浓度进行优化。通过Ni Sepharose 6 Fast Flow亲和层析柱进行目的蛋白的纯化,测定蛋白浓度。分别以鼠抗His标签单克隆抗体、免疫Ⅱ号炭疽芽孢疫苗的绵羊血清、炭疽沉淀素为一抗,通过Western blot来检测PA-LF1融合蛋白的反应原性。(2)以表达的PA-LF1融合蛋白作为包被抗原,通过棋盘滴定法分别筛选最佳蛋白包被浓度、包被条件、封闭时间、稀释条件、一抗稀释倍数、一抗反应时间、二抗稀释倍数、二抗反应时间等条件建立间接ELISA检测方法。对建立的间接ELISA检测方法进行敏感性、特异性、重复性检测。结果:(1)成功获得PA-LF1基因,大小约为2067bp,PA、LF1单独的蛋白结构与PA-LF1融合后的蛋白结构均未发生改变,经序列相似性比对发现炭疽芽胞杆菌弱毒C40-202株的PA、LF1基因与NCBI数据库中公布的12株炭疽芽胞杆菌的PA、LF1基因序列一致,表明PA、LF1这两个基因属于保守基因,各菌株间无差异。PA-LF1融合蛋白在IPTG浓度为1mmol/L,37℃诱导表达6h时蛋白表达量最高。SDS-PAGE显示重组蛋白大小为96k Da,PA-LF1融合蛋白在沉淀中主要以包涵体形式存在,在咪唑浓度为30m M时,可获得较纯的PA-LF1融合蛋白,经Western blot检测证实PA-LF1融合蛋白能与鼠抗His标签单克隆抗体、免疫Ⅱ号炭疽芽孢疫苗后的绵羊血清和炭疽沉淀素发生特异性结合,表明其具有良好的反应原性。(2)棋盘滴定法筛选的间接ELISA最佳反应条件为:蛋白包被浓度为4μg/ml、包被条件为37℃包被2h、封闭时间为37℃封闭2h、抗体稀释液为PBST+2%脱脂奶粉、一抗稀释倍数为1:200、一抗反应时间为30min、二抗稀释倍数为1:8000、二抗反应时间为45min。敏感性结果表明,炭疽芽胞杆菌弱毒C40-202株免疫绵羊阳性血清1和2可在稀释至1:800时仍检测到该血清为阳性,阳性血清3可在稀释至1:1600倍时仍检测到该血清为阳性,表明本试验所建立的炭疽芽胞杆菌抗体间接ELISA检测方法具有较好的敏感性。特异性结果表明,绵羊产气荚膜梭菌病抗体、绵羊腐败梭菌α毒素抗体、绵羊蜡样芽胞杆菌肠毒素抗体的间接ELISA检测结果均为阴性,说明该间接ELISA检测方法具有较好的特异性。重复性结果表明,批内阳性血清的OD值变异系数在1.5%—5.2%之间,阴性血清OD值变异系数在1.2%—7.5%之间,批间阳性血清的OD值变异系数为3.9%,阴性血清的OD值变异系数为4.0%。批内及批间试验结果表明,本研究所建立的炭疽芽胞杆菌抗体间接ELISA检测方法具有较好的重复性。结论:(1)成功诱导表达并纯化PA-LF1融合蛋白,经Western-blot验证,PA-LF1融合蛋白可与绵羊炭疽血清及炭疽沉淀素发生特异性结合,表明PA-LF1融合蛋白具有良好的反应原性。(2)成功建立炭疽芽胞杆菌抗体间接ELISA检测方法。

关键词：炭疽芽胞杆菌 PA-LF1融合蛋白间接ELISA 炭疽疫苗

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炭疽芽胞杆菌BslA蛋白粘附功能研究

炭疽芽胞杆菌BslA蛋白粘附功能研究

作者：马坤安徽大学

学位级别：硕士

炭疽病是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的一种人畜共患烈性传染病,主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人,严重危害人类和家畜的生命健康。大量研究表明,单一的PA组分疫苗并不能够提供完全的免疫保护,以PA为主,辅以其它... 详细信息

炭疽病是由炭疽芽胞杆菌(Bacillus anthracis)引起的一种人畜共患烈性传染病,主要通过皮肤、呼吸道和消化道感染动物和人,严重危害人类和家畜的生命健康。大量研究表明,单一的PA组分疫苗并不能够提供完全的免疫保护,以PA为主,辅以其它来自菌体或芽胞的保护性组份是一个比较理想的炭疽疫苗研究策略,因此研究者一直致力于寻找和鉴定新的炭疽芽胞杆菌保护性抗原。炭疽芽孢杆菌的细胞外膜由一层二维晶状结构S层蛋白包裹,其生物学功能主要是作为保护性的外膜、分子泵和细菌粘附等。BslA蛋白(B. anthracis S-layer protein A)由炭疽芽胞杆菌pXO1致病岛区域上的bslA(pXO1-90)基因编码,包含652个氨基酸残基。BslA蛋白N端1-259位氨基酸残基中含有三个保守的SLH基序(S-layer-homologous motifs),是一种典型的S层蛋白。BslA蛋白炭疽芽胞杆菌感染宿主后有稳定的表达,天然表达的BslA与其它S层蛋白共同展示于菌体表面。研究表明BslA蛋白在炭疽芽胞杆菌致病过程中起着重要作用。本研究拟对BslA蛋白功能及其核心结构域方面进行研究,具体如下：第一部分工作利用PCR的技术扩增bslA基因片段,进行原核表达载体构建、重组蛋白分离纯化、多克隆抗体制备,并且通过流式细胞、细菌粘附抑制实验、免疫荧光等实验方法鉴定BslA蛋白的功能。从实验结果来看,成功构建重组菌株pET28a-BslA/Rosetta((DE3)并对BslA实现了可溶性表达。通过ProBondTM Purification system得到纯度在87%以上的BslA蛋白,流式细胞与免疫荧光的结果表明BslA蛋白具有黏附功能。细菌粘附抑制实验计算出BslA重组蛋白及其抗血清能够抑制约为98%的炭疽杆菌黏附,表明BslA蛋白可能是一种潜在的保护性抗原。第二部分工作中,本实验通过蛋白结构预测软件,确定核心功能结构域可能存在的位置,从而进行分段研究。为了更好、更方便的检测,我们将蛋白片段与EGFP蛋白融合表达,使EGFP成为标签。再通过免疫荧光等方法检测(?)BslA蛋白片段功能。结果表明,成功构建了pET28a-EGFP/Rosetta(DE3)和实现了可溶性表达,并对其进行了纯化。表达分析和流式细胞检测结果表明,构建的EGFP蛋白有很好的荧光性。另外,根据蛋白结构软件的预测我们对BslA蛋白进行了首次分段,成功构建了pET28a-EGFP-BslA(260-500)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(411-560)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(511-652)/Rosetta(DE3),进行了截短BslA的表达与纯化。经荧光电镜检测结果表明,BslA(260-500)、BslA(411-560)具有黏附功能,以此推断核心功能结构域位于BslA蛋白的411-500位氨基酸。根据此结果,进行了第二次分段,成功构建pET28a-EGFP-BslA(411-455)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(431-485)/Rosetta(DE3)、pET28a-EGFP-BslA(456-500/Rosetta(DE3)重组菌,对表达的蛋白进行了纯化。免疫荧光检测的结果表明BslA(411-455)、BslA(431-485)片段具有粘附功能,进一步确定了BslA蛋白的核心功能结构域位于431455位点。综上,BslA是一种重要的保护性抗原,可能在新一代炭疽疫苗的研究和开发中扮演重要的角色。BslA蛋白是具有细胞粘附功能,其核心功能结构域的确定为进一步研究炭疽芽胞杆菌的致病机制与免疫预防打下了良好的基础。

关键词：炭疽芽胞杆菌 BslA蛋白免疫荧光粘附 EGFP蛋白