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炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因筛选

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炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因筛选

作者：江云江西师范大学

学位级别：硕士

炭样小单孢菌JXNU-1是本实验室从土壤中筛选得到的一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌。前期研究已建立了从该菌发酵液中分离纯化抗生素的方法,并经分析初步确定其抗生素为一核苷类抗生素,但有关炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机... 详细信息

炭样小单孢菌JXNU-1是本实验室从土壤中筛选得到的一株具有广谱抗菌活性的稀有放线菌。前期研究已建立了从该菌发酵液中分离纯化抗生素的方法,并经分析初步确定其抗生素为一核苷类抗生素,但有关炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机制仍不清楚。本文采用组学方法筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相关基因(簇),具体内容和结果如下:1.以优化SDS法提取炭样小单孢菌JXNU-1基因组DNA,采用高通量测序技术对基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学分析,最终获得炭样小单孢菌JXNU-1全基因组精细图,相关序列已提交GenBank,获得登录号为JXSX00000000;2.以RNAiso试剂法提取发酵36 h(抗生素分泌前)和发酵108 h(抗生素分泌后)炭样小单孢菌JXNU-1总RNA,分别构建抗生素分泌前后的cDNA文库,采用Illumina Hiseq 2500测序平台对cDNA文库测序,序列已提交到NCBI SRA,获得登录号SRP066689;基于cDNA文库测序结果,得到炭样小单孢菌JXNU-1抗生素分泌后与分泌前的差异表达基因1072个,其中上调表达基因573个,下调表达基因499个。将抗生素分泌过程中表达显著上调的30个基因定位到炭样小单孢菌JXNU-1全基因组的13基因簇中,经分析初步确定基因簇cluster12为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因(簇);3.以发酵108 h的炭样小单孢菌JXNU-1菌体为实验组(Tester),发酵36h的菌体为驱动组(Driver),分别提取总RNA、合成双链cDNA,进行抑制性消减杂交,成功构建炭样小单孢菌JXNU-1发酵分泌抗生素前后的消减cDNA文库,选取部分阳性克隆进行测序,获得差异片段26个,从中筛选得到与抗生素生物合成密切相关基因5个(经荧光定量PCR验证)。根据炭样小单孢菌JXNU-1全基因组序列,上述5个基因被定位到4个基因簇中,且分析确定基因簇cluster 2极可能为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成基因(簇);4.经比对分析发现,转录组测序分析得到的基因簇cluster 12与抑制性消减杂交技术分析得到的cluster 2实际为同一基因簇,可以确定为炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成基因簇,cluster 2序列已提交Gene Bank,获得登录号KU355271;上述研究结果为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成的代谢通路及调控机制提供了实验依据。

关键词：炭样小单孢菌全基因组序列分析转录组分析抑制性消减杂交抗生素生物合成基因簇

炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成相关蛋白的筛选

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炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成相关蛋白的筛选

作者：陈娟江西师范大学

学位级别：硕士

实验室在前期研究中筛选到一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1,其发酵所产核苷类抗生素对常见的G+和G-细菌均有抑制作用,但该抗生素的生物合成与分子调控机制尚不清楚。为探寻炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成与分子调控机... 详细信息

实验室在前期研究中筛选到一株具有广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1,其发酵所产核苷类抗生素对常见的G+和G-细菌均有抑制作用,但该抗生素的生物合成与分子调控机制尚不清楚。为探寻炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成与分子调控机制,本文采用相对和绝对定量同位素标记(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术对炭样小单孢菌JXNU-1分泌抗生素前后期的蛋白质组进行分析,主要结论如下:(1)共鉴定出炭样小单孢菌菌体蛋白2390个,获得172个差异表达蛋白,产物合成期上调表达蛋白76个,下调表达蛋白96个;(2)根据蛋白质组学分析,上调蛋白中含有12个与抗生素合成密切相关蛋白,分别是ABC转运器底物结合蛋白、ABC转运器ATP结合蛋白、糖基转移酶、P450单加氧酶、S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶、甲基转移酶和丝氨酸羟甲基转移酶。利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)技术对筛选出的相关蛋白的mRNA定量分析,结果表明这12个基因均为表达上调基因,与蛋白的表达趋势相符;(3)采用生物信息学方法对上述12个抗生素合成相关蛋白进行基因定位,结果表明相关蛋白分布在5个抗生素合成相关基因簇中,且Cluster 2被推测为炭样小单孢菌JXNU-1生物合成抗生素的基因簇。上述研究结果为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中核苷类抗生素生物合成与分子调控机制提供了实验依据。

关键词：炭样小单孢菌核苷类抗生素相对和绝对定量同位素标记基因簇

抑制性消减杂交法筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因

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基因组学与应用生物学 2016年第10期35卷 2733-2743页

作者：江云黄运红李非龙中儿江西师范大学生命科学学院南昌330022

为了筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因,本研究以培养36 h(抗生素分泌前)的炭样小单孢菌JXNU-1菌体所合成c DNA为Driver,以培养108 h(抗生素分泌后)的菌体所合成的c DNA为Tester,构建炭样小单孢菌JXNU-1分泌抗生素前后的差异c... 详细信息

为了筛选炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素合成相关基因,本研究以培养36 h(抗生素分泌前)的炭样小单孢菌JXNU-1菌体所合成c DNA为Driver,以培养108 h(抗生素分泌后)的菌体所合成的c DNA为Tester,构建炭样小单孢菌JXNU-1分泌抗生素前后的差异c DNA消减文库,筛选差异表达基因,荧光定量PCR验证其表达量,生物信息学方法分析其功能。研究结果表明,经抑制性消减杂交筛选得到5个与抗生素合成相关的差异表达基因;比照炭样小单孢菌JXNU-1全基因组序列,将所获5个基因定位到4个生物合成基因簇中,最后确定了炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素生物合成相关的基因簇。本研究为阐明炭样小单孢菌JXNU-1中抗生素的生物合成机制提供了实验依据。

关键词：炭样小单孢菌抑制性消减杂交抗生素合成相关基因生物合成机制

一株具有广谱抗菌活性炭样小单孢菌的全基因组序列测定

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微生物学通报 2015年第11期42卷 2178-2188页

作者：江云黄运红李非龙中儿江西师范大学生命科学学院江西南昌330022

【目的】炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的放线菌,研究揭示该菌的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对炭样小单孢菌JXNU-1的基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学... 详细信息

【目的】炭样小单孢菌JXNU-1是一株具有广谱抗菌活性的放线菌,研究揭示该菌的基因组序列信息。【方法】采用高通量测序技术对炭样小单孢菌JXNU-1的基因组DNA测序,利用SOAPdenovo软件组装,人工PCR修补基因组部分缺口,然后进行生物信息学分析。【结果】对炭样小单孢菌JXNU-1的全基因组序列进行了测定和注释,得到基因组精细图,相关序列已提交Gen Bank,获得登录号为JXSX00000000。【结论】研究为揭示炭样小单孢菌JXNU-1抗生素产生机制及其抗菌机理提供了基础数据,对进一步研发其抗生素具有重要的理论意义和巨大的应用价值。

关键词：炭样小单孢菌全基因组测序生物合成基因簇抗菌活性

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抗生素高产炭样小单孢菌的热诱变育种

生物技术通报 2013年第4期29卷 147-151页

作者：李瑾黄运红李鹿鸣彭伟梦龙中儿江西师范大学生命科学学院南昌330022

采用热诱变处理,结合庆大霉素抗性筛选法筛选,对产抗生素的炭样小单孢菌JXNU-1进行选育,最终获得抗生素高产菌株JXNU-1-16-R4。结果显示,其抗生素产率比出发菌株提高了98.53%。

关键词：炭样小单孢菌热诱变抗性筛选

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抗生素高产炭样小单孢菌的育种研究

抗生素高产炭样小单孢菌的育种研究

作者：李瑾江西师范大学

学位级别：硕士

随着抗生素的广泛使用，耐药菌的大量出现，不断研发新抗生素成为人类社会健康发展的必然要求。小单孢菌属放线菌是新抗生素的一个重要来源。课题组前期研究获得的炭样小单孢菌JXNU-1具有广谱抗菌活性，能产单一组分的抗生素为一全新结... 详细信息

随着抗生素的广泛使用，耐药菌的大量出现，不断研发新抗生素成为人类社会健康发展的必然要求。小单孢菌属放线菌是新抗生素的一个重要来源。课题组前期研究获得的炭样小单孢菌JXNU-1具有广谱抗菌活性，能产单一组分的抗生素为一全新结构的核苷类抗生素，但产率较低，不适产业化生产。本文以炭样小单孢菌JXNU-1为研究对象，首先筛选了炭样小单孢菌敏感抗生素，检测了各种抗生素对炭样小单孢菌的最低抑菌浓度。然后经自然选育得到相对高产菌株作为出发菌株，通过热诱变、微波诱变、亚硝酸诱变和热-亚硝酸复合诱变四种诱变处理方法结合抗性筛选法筛选，获得抗生素高产炭样小单孢菌突变株;最后利用热诱变及微波诱变所获高产菌株进行原生质体融合育种，选育抗生素高产的炭样小单孢菌融合菌株。具体结果如下：（1）炭样小单孢菌对多种抗生素都具有较强的敏感性，其中敏感程度从高到低依次为氨苄西林、环丙沙星、氧氟沙星、四环素、庆大霉素、利福平，其对炭样小单孢菌JXNU-1的最低抑菌浓度分别为1μg/mL、16μg/mL、32μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、128μg/mL。（2）通过对原始菌株炭样小单孢菌JXNU-1的自然选育，获得一株抗生素相对高产炭样小单孢菌JXNU-1-16，其抑菌圈直径达到26.00mm。实验将该菌作为诱变育种的出发菌株。（3）通过对出发菌株炭样小单孢菌JXNU-1-16进行热诱变处理，以最低抑菌浓度的庆大霉素作为筛选条件，获得一株突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-R4，其发酵液抑菌圈直径达到29.15mm，效价比出发菌株提高了98.53%。热诱变的最适作用条件为温度76℃，作用时间10min。（4）采用微波辐射的诱变方法对炭样小单孢菌JXNU-1-16进行诱变处理。首先确定了微波诱变的适宜辐射时间为9s，结合环丙沙星抗性筛选，获得了一抗生素高产突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-W12，其发酵液抑菌圈直径达到27.80mm，效价比出发菌株提高了47.98%。（5）在实验确定亚硝酸钠浓度和亚硝酸处理时间与炭样小单孢菌致死率之间存在明显的剂量效应关系的基础上，优化了亚硝酸盐诱变的适宜剂量为亚硝酸钠浓度为0.1mol/L，作用时间为20min。出发菌株炭样小单孢菌JXNU-1-16经亚硝酸诱变处理后，采用利福平最低抑菌浓度128ug/mL作为筛选因子，获得突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-Y65，其发酵液抑菌圈直径达到31.96mm，效价比出发菌株提高了266%。（6）以炭样小单孢菌JXNU-1-16为出发菌株，经复合诱变处理（热诱变最适条件为76℃作用10min，亚硝酸诱变最适条件为亚硝酸钠浓度0.1mol/L作用20min）后，以最低抑菌浓度的庆大霉素与环丙沙星作为筛选条件，获得突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-F28，其发酵液抑菌圈直径达到32.06mm，效价比出发菌株提高了274.1%。（7）在优化炭样小单孢菌原生质体制备条件为溶菌酶浓度3mg/mL、酶解时间90min、酶解温度33℃的基础上，制备了热诱变突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-R4和微波诱变突变株炭样小单孢菌JXNU-1-16-W12的原生质体，用PEG促融合，然后通过最低抑菌浓度的庆大霉素与环丙沙星的双抗平板进行初筛，最后从挑选的40株再生融合子进行摇瓶复筛，测其摇瓶效价，发现抗生素最高产的一株突变株炭样小单孢菌JXNU-1-Y6，其发酵液抑菌圈直径为26.38mm，未及融合的出发菌株。

关键词：炭样小单孢菌核苷类抗生素诱变育种原生质体融合育种抗性筛选

水稻白叶枯病菌FtsZ的体外表达及炭样小单孢菌JXNU-1抗生素对其作用研究

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水稻白叶枯病菌FtsZ的体外表达及炭样小单孢菌JXNU-1抗生素对其作...

作者：陈洋江西师范大学

学位级别：硕士

炭样小单孢菌菌株JXNU-1是一株从土壤中分离得到的放线菌,所产单一组分的广谱抗生素对常见的G+和G-均有抑制作用,但其抗菌机制尚不明确。本研究以引起水稻生产严重病害的水稻白叶枯病菌为例,研究了炭样小单孢菌JXNU-1抗生素对水稻白叶... 详细信息

炭样小单孢菌菌株JXNU-1是一株从土壤中分离得到的放线菌,所产单一组分的广谱抗生素对常见的G+和G-均有抑制作用,但其抗菌机制尚不明确。本研究以引起水稻生产严重病害的水稻白叶枯病菌为例,研究了炭样小单孢菌JXNU-1抗生素对水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白的作用,具体内容和结果如下：(1)以水稻白叶枯病菌总DNA为模板,采用巢式PCR方法扩增获得水稻白叶枯病菌FtsZ基因,构建FtsZ基因的表达载体pET-22b-fteZ,转化表达宿主E. coli BL21后,经PCR、Nde I/Xho I双酶切及测序鉴定、阳性克隆子经IPTG诱导表达,FtsZ蛋白经镍柱纯化后,通过SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,获得了电泳纯的FtsZ蛋白;(2)以单因素实验法优化了重组大肠杆菌表达FtsZ蛋白的条件,即在诱导的菌体浓度(以OD600表示)为0.8,IPTG浓度为1.0 mmol/L,温度为37℃,诱导时间为3h,FtsZ蛋白有最大可溶性表达;(3)利用生物信息学方法分析了水稻白叶枯病菌FtsZ蛋白的结构,结果表明,水稻白叶枯病菌FtsZ为结构稳定的亲水性蛋白,含414个氨基酸残基,C端起第15至第187个氨基酸残基决定其GTPase活性,蛋白含细菌FtsZ蛋白共有的GTP结合位点GGGTGTG,FtsZ蛋白二级结构中,螺旋结构为30.4%,折叠结构为11.8%。(4)采用酶学方法研究了FtsZ蛋白的GTPase特性,结果表明其最适温度为50℃,在温度为60℃时迅速失活,最适pH值为7.0,Mg2+存在时活性最强,其Km值为5.78 mmol/L(5)炭样小单孢菌JXNU-1抗生素可抑制水稻白叶枯病菌的生长,并导致水稻白叶枯病菌出现丝化现象,同时可明显抑制FtsZ蛋白的GTPsae活性。上述研究结果表明,炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素的抗菌作用可通过抑制水稻白叶枯病菌的FtsZ蛋白的GTPsae活性,进而抑制细胞的分裂。

关键词：炭样小单孢菌抗生素水稻白叶枯病菌 FtsZ蛋白抗菌机理

一株炭样小单孢菌产抗生素的抗菌作用及其热诱变育种研究

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一株炭样小单孢菌产抗生素的抗菌作用及其热诱变育种研究

作者：高兴强江西师范大学

学位级别：硕士

不断开发利用新抗生素是人类社会健康发展的要求。筛选新抗生素的产生菌及其开发利用具有重要的社会意义和生物学意义。本文在前期分离到一株具广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1、并从发酵液中分离纯化得到层析、电泳纯抗生素产品的基... 详细信息

不断开发利用新抗生素是人类社会健康发展的要求。筛选新抗生素的产生菌及其开发利用具有重要的社会意义和生物学意义。本文在前期分离到一株具广谱抗菌活性的炭样小单孢菌JXNU-1、并从发酵液中分离纯化得到层析、电泳纯抗生素产品的基础上: 1)研究了炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素的体外抗菌活性。结果表明,炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素对不产芽孢的球菌、杆菌及产芽孢的杆菌等常见G均有抗菌作用,且对芽孢杆菌的抑菌作用强于对非芽孢菌的抑菌作用,对芽孢菌的杀菌速率快于对非芽孢菌的杀菌速率。同时,所产抗生素对常见的G菌,如铜绿假单孢菌、福氏志贺氏菌、伤寒沙门氏菌、产气肠杆菌均有较强的抗菌作用。炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素对G、G的最低杀菌浓度一般是最低抑菌浓度的8-16倍。抗生素对菌体的MIC受体系的pH、菌体接种量和离子强度的影响。通过显微观察最低抑菌浓度的抗生素处理的细菌的形态变化,表明炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素抗菌作用是抑制了细菌细胞的分裂。 2)研究了炭样小单孢菌JXNU-1产抗生素和常见抗生素的联合抗菌作用。结果表明,炭样小单孢菌JXNU-1所产抗生素与抑制细胞壁合成的头孢拉定联用为无关作用(FIC指数=2.0),而与抑制细菌蛋白质、核酸的合成的抗生素联用时,为相加或协同作用(FIC指数≤1.0)。 3)探究了炭样小单孢菌JXNU-1热诱变育种的影响因素,并筛选抗生素高产菌株。结果表明,生长7 d的孢子热诱变后的正变率分别是生长9 d、11 d的孢子热诱变后的正变率2.2倍、2倍;并且高浓度的孢子比较低浓度的孢子更易产生正突变;87%的致死率比73%的致死率更有利于正突变体的产生;但加入dNTP mixture、调节孢子液pH、平板培养温度以及孢子悬液状态的处理虽然对致死率有一定的影响,但都不能有效提高正突变率。从41株正突变株中筛选到一抗生素高产菌株ZD-2,其抑菌圈直径达到33 mm,比出发菌株的抑菌圈直径高出了6.6 mm。

关键词：炭样小单孢菌抗生素抗菌作用联合用药诱变育种

一株炭样小单孢菌产新型核苷类抗生素的抗菌作用研究

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一株炭样小单孢菌产新型核苷类抗生素的抗菌作用研究

作者：彭伟梦江西师范大学

学位级别：硕士

新抗生素产生菌的分离、筛选是研发新抗生素的重要途径之一，课题组前期研究获得的炭样小单孢菌所产抗菌单体组分经鉴定为一新型核苷类抗生素。该抗生素具有广谱抗菌活性，但抗菌作用特点及作用机理不清楚。本研究以该抗生素和常用抗生... 详细信息

新抗生素产生菌的分离、筛选是研发新抗生素的重要途径之一，课题组前期研究获得的炭样小单孢菌所产抗菌单体组分经鉴定为一新型核苷类抗生素。该抗生素具有广谱抗菌活性，但抗菌作用特点及作用机理不清楚。本研究以该抗生素和常用抗生素活性检测靶菌分别作为试验材料和试验对象，研究抗生素的体外抗菌谱、抗菌方式、抗菌强度及其作用机理，为进一步开发炭样小单孢菌产抗生素成为我国具有自主知识产权的新型抗生素奠定坚实的理论基础，具有重大的理论研究和实践应用价值。研究结果如下：（1）采用琼脂扩散法和液体稀释法分别测定了炭样小单孢菌所产核苷类抗生素抗菌谱及其最低抑菌浓度和最低杀菌强度，表明该抗生素对常见的G+和G-均具有抗菌作用，为广谱抗生素，并且对G+和G-的最低杀菌浓度（MBC）一般是最低抑菌浓度（MIC）的8～16倍。（2）采用显微观察法研究了炭样小单孢菌所产核苷类抗生素处理后的G+和G-细菌形态变化，结果显示，在最低抑菌浓度的抗生素作用下，无论是G+、G-，细胞形态都发生明显改变，许多细胞形体变长，甚至成丝状，还有部分细胞开始破裂，并且，细胞的个体数目明显减少。（3）通过比较抗生素处理前后细胞对溶菌酶的敏感性及细胞壁的含量，表明炭样小单孢菌所产核苷类抗生素的作用不影响细菌细胞壁的合成，但使细胞壁变厚。（4）通过比较抗生素作用后细胞悬浮液的电导率变化，表明抗生素对细菌细胞膜的渗透性没有明显的影响，说明不影响细胞膜的结构与功能。（5）采用孔雀石绿—磷钼杂多酸分光光度法测定了抗生素对细胞GTP酶活性的影响，表明炭样小单孢菌所产抗生素可促进细胞GTP酶的活性，进而增强了GTP酶的催化作用。（6）采用G-250考马斯亮蓝法检测了炭样小单孢菌所产抗生素作用下G+和G-细菌细胞内蛋白质含量的变化，及其对大肠埃希氏菌无细胞表达系统体外合成蛋白质的影响，表明炭样小单孢菌所产抗生素可抑制细胞蛋白质的合成。从上述结果可以推断，炭样小单孢菌所产抗生素通过抑制细胞蛋白质的合成而抑制细胞的分裂，进而实现其抑/杀菌功能。但有关该抗生素抑制蛋白质合成的具体机制还有待进一步研究。

关键词：炭样小单孢菌核苷类抗生素生物活性抗菌机理