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作者：张圣英承德医学院

学位级别：硕士

随着人们生活方式和饮食结构的改变，糖尿病的患病率在全球范围内不断升高，严重危害到居民的身体健康。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，主要病理表现为细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM... 详细信息

随着人们生活方式和饮食结构的改变，糖尿病的患病率在全球范围内不断升高，严重危害到居民的身体健康。糖尿病肾病(Diabetic nephropathy, DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，主要病理表现为细胞外基质(Extra cellular matrix, ECM)过度沉积、肾小球基底膜增厚、肾小球硬化以及肾脏纤维化(Renal fibrosis, RF)，其中肾脏纤维化是糖尿病肾病发展的关键病理过程。肾脏纤维化的发生过程中，有多个细胞生长因子、过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptors, PPARs)参与，其中转化生长因子β(Transforming growth factor beta,TGF-β)和PPARγ是目前公认的导致肾脏纤维化关键因子。Smad蛋白是TGF-β信号通路的关键下游蛋白， TGF-β/Smad信号通路是防治糖尿病肾脏纤维化的关键通路。因此深入研究PPARγ与TGF-β/Smad信号通路的关系，探讨糖尿病肾脏纤维化的发病机制，并寻找安全有效的治疗方法和药物变得尤为重要。目前临床上常用的 PPARs 人工合成激动剂噻唑烷二酮类(Thiazolidinediones, TZDs)能够降低血糖，但其副作用明显，极大地限制了其在临床上的应用。所以，寻找既能有效防治糖尿病肾脏纤维化，同时副作用又小的药物，逐渐成为当前研究的新方向。灰兜巴是峨眉山老茶树根部生长出来的菌科植物，其性平味淡，具有益气健脾，滋补肾阴的功效。既往研究表明，灰兜巴有降低血糖，减轻糖尿病肾脏纤维化的作用，但其激活PPARγ治疗糖尿病肾脏纤维化作用机制报道不多。本课题组前期研究显示，灰兜巴可减轻糖尿病肾病大鼠足细胞损伤，减少尿蛋白，减轻肾脏纤维化。本实验基于灰兜巴对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用，研究灰兜巴不同溶剂提取部分对PPARγ的激活作用，选出对PPARγ激活作用最强的部分，进一步观察其激活PPARγ后对TGF-β/Smad信号通路的影响，从而阐明灰兜巴抑制高糖诱导肾小管上皮细胞纤维化的机制。　　目的：　　通过研究灰兜巴不同溶剂提取部分对PPARγ的激活作用，选择激活作用最强的提取部分，研究激活PPARγ后对高糖诱导下的肾小管上皮细胞HK-2中层粗连蛋白(Laminin, LN)、纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)、TGF-β、结缔组织生长因子(Connective tissue growth factor, CTGF)、p-Smad2/3等相关蛋白表达的影响，探讨灰兜巴通过激活PPARγ抑制TGF-β/Smad信号通路，减轻高糖诱导的HK-2细胞纤维化机制。　　方法：　　1.采用正己烷、乙酸乙酯、正丁醇、无水乙醇、水等不同极性溶剂分别提取灰兜巴，得到5种不同的极性组分正己烷部分(ZJW)、乙酸乙酯部分(YSYZ)、正丁醇部分(ZDC)、水提醇沉上清部分(STS)和水提醇沉沉淀部分(STC)。　　2.CCK8法检测灰兜巴不同溶剂提取部分对细胞增殖的影响，构建重组质粒pBIND-PPARγ-LBD，并将重组质粒pBIND-PPARγ-LBD与报告质粒pGL4.35，瞬时转入293T细胞中，用PPARγ激动剂吡格列酮作为阳性对照，通过测定荧光素酶的表达率，建立PPARγ筛选模型，用于筛选灰兜巴不同溶剂提取部分的PPARγ激活作用。　　3.体外实验：培养人肾小管上皮HK-2细胞，随机分为六组：对照组（空白培养基培养）、模型组（30mmol/L葡萄糖共培养）、吡格列酮组（30mmol/L葡萄糖+0.75μg/mL吡格列酮共培养）、400、200、100μg/mL灰兜巴STC组（30mmol/L葡萄糖+400、200、100μg/mL灰兜巴STC共培养），各组经不同干预后收集细胞上清液，采用酶联免疫法吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定各组细胞上清液中LN、FN的含量;采用Western Blot测定TGF-β、CTGF、p-Smad2/3等相关蛋白的表达。　　4.为进一步验证灰兜巴 STC 是否通过激活 PPARγ抑制TGF-β/Smad信号通路，减轻高糖诱导的HK-2细胞纤维化，采用RNA干扰技术下调PPARγ表达进行验证。将生长状态良好的HK-2细胞随机分为四组：对照组（空白培养基培养）、模型组（30mmol/L葡萄糖共培养）、SiRNA PPARγ组（30mmol/L葡萄糖+转染SiRNA PPARγ共培养）、灰兜巴STC+SiRNA PPARγ处理组（30mmol/L葡萄糖+转染SiRNA PPARγ+400μg/mL灰兜巴STC共培养），经不同干预后，收取细胞上清液和细胞蛋白，采用ELISA、Western Blot方法检测相关蛋白的表达。　　结果：　　1.采用不同溶剂提取灰兜巴，得到五

关键词：糖尿病肾脏纤维化灰兜巴肾脏保护信号通路

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灰兜巴提取物对糖尿病前期小鼠骨骼肌代谢灵活性的调控作用研究

灰兜巴提取物对糖尿病前期小鼠骨骼肌代谢灵活性的调控作用研究

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作者：田宇中央民族大学

学位级别：硕士

[目的]本研究旨在明确灰兜巴对糖尿病前期C57BL/6J小鼠糖脂代谢及骨骼肌代谢灵活性的影响和部分作用机制。[方法]1.分组及给药:SPF级,6周龄C57BL/6J雄性小鼠,体质量20±2g,随机分为2组,空白对照组(Control,n=10)、模型复制组(n=60),分... 详细信息

[目的]本研究旨在明确灰兜巴对糖尿病前期C57BL/6J小鼠糖脂代谢及骨骼肌代谢灵活性的影响和部分作用机制。[方法]1.分组及给药:SPF级,6周龄C57BL/6J雄性小鼠,体质量20±2g,随机分为2组,空白对照组(Control,n=10)、模型复制组(n=60),分别给予低脂饲料D12450J和高脂饲料D12492,共造模12周,检测体质量和空腹血糖(FBG)变化。12周后,小鼠FBG≧6.1mmol/L,伴随葡萄糖耐量受损视为模型复制成功。将成模小鼠随机分为:模型组(Model)、二甲双胍组(Met,200mg/kg)、灰兜巴低剂量组(HDB50,50mg/kg),灰兜巴中剂量组(HDB100,100 mg/kg),灰兜巴高剂量组(HDB200,200mg/kg)。以灌胃给药的方式共给药6周。2.生化指标检测及肌肉组织病理学观察:检测小鼠血清中FFA、TC、TG、HDL-C、LDL-C、LDH含量,考察模型小鼠脂代谢的变化及各给药组的干预作用;利用HE染色观察肌肉组织病理形态变化,检测小鼠腓肠肌肉组织的TC和TG、油红O染色观察肌肉组织脂质累积状态、PAS染色观察肌糖原分布,考察各给药组对小鼠肌肉组织形态的影响。3.相关信号通路检测:利用q-PCR和Western blot分析小鼠肌肉组织中 MG53/AMPK/PGC-1α/PPARα信号通路和 GLUT4 mRNA 和蛋白的表达。[结果]1.灰兜巴对糖尿病前期C57BL/6J小鼠糖脂代谢水平的影响(1)小鼠的体质量及空腹血糖变化:造模第12周,造模组小鼠体质量相较于对照组显著上升(P灰兜巴各给药组的体质量则无明显改变,但各给药组的空腹血糖均显著降低(P灰兜巴给药后模型小鼠的糖耐量和胰岛素耐量均有所改善(P灰兜巴改善糖尿病前期C56BL/6J小鼠骨骼肌代谢灵活性的作用及其机制(1)脂代谢:模型组小鼠骨骼肌组织匀浆中的TC、TG水平相较于对照组显著增加(P灰兜巴组的骨骼肌组织病理结构明显改善,肌纤维逐渐规则,肌细胞排列整齐,肌纤维横截面积显著升高(P灰兜巴干预给药后,AMPK/PGC-1α/PPAR-α和GLUT-4的mRNA水平及这四种蛋白的表达量显著升高(P灰兜巴有效改善糖尿病前期模型小鼠的糖脂代谢水平,提高了对于葡萄糖和胰岛素的敏感水平。2.灰兜巴改善了骨骼肌的组织形态及脂代谢水平,并通过调节MG53/AMPK/PGC-1α/PPAR-α信号通路以及上调GLUT-4蛋白提高了糖尿病前期小鼠骨骼肌代谢的灵活性,促进了肌糖原的累积。

关键词：灰兜巴糖尿病前期糖脂代谢骨骼肌代谢灵活性肌糖原累积 MG53/AMPK/PGC-1α/PPAR-α信号通路

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藏族药灰兜巴下调Nox4表达减轻糖尿病肾病大鼠肾脏氧化应激损伤

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中国实验方剂学杂志 2020年第18期26卷 84-90页

作者：杨坤宝庞宗然白颖慧鲁碧楠于宁韩桂艳尹长江中央民族大学药学院北京100081 承德医学院河北承德067000

目的:从减轻糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏氧化应激损伤角度探讨藏族药灰兜巴的肾脏保护作用,为其治疗DN提供科学依据。方法:本实验采取高脂饮食喂养加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg·kg-1法诱导DN大鼠模型,空白组注射等体积溶媒并饲以大鼠维... 详细信息

目的:从减轻糖尿病肾病(DN)大鼠肾脏氧化应激损伤角度探讨藏族药灰兜巴的肾脏保护作用,为其治疗DN提供科学依据。方法:本实验采取高脂饮食喂养加腹腔注射链脲佐菌素(STZ)65 mg·kg-1法诱导DN大鼠模型,空白组注射等体积溶媒并饲以大鼠维持饲料。将造模成功DN大鼠随机分为DN模型组(10 mL·kg-1·d-1),二甲双胍组(0.045 g·kg-1·d-1),灰兜巴组(0.18 g·kg-1·d-1),每组8只,分别以溶媒或相应药物灌胃给药干预6周。动态监测各组大鼠体质量、血糖变化,并于药物干预前后收集24 h尿液,检测24 h尿微量白蛋白(mAlb);实验取材后,计算肾脏质量指数(KI);并利用全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)水平;马松(Masson)染色观察肾组织病理学改变;脂质氧化丙二醛(MDA)测定试剂盒检测肾组织MDA含量;蛋白免疫印迹法(Western blot)和免疫荧光法检测肾组织烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4(Nox4)蛋白表达。结果:与空白组比较,DN模型组大鼠空腹血糖(FBG)及24 h mAlb,SCr,BUN水平均显著升高(P灰兜巴可减轻DN大鼠肾脏氧化应激损伤,降低蛋白尿,从而延缓DN发生发展,其作用机制与下调DN大鼠肾脏组织NADPH氧化酶Nox4蛋白表达有关。

关键词：灰兜巴烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶4(Nox4) 蛋白尿糖尿病肾病氧化应激

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灰兜巴粗多糖提取液的脱蛋白工艺研究

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中成药 2013年第7期35卷 1557-1560页

作者：谢清春符美燕广东药学院药物研究所广东广州510006 广州白云山制药股份有限公司白云山何济公制药厂广东广州510410

目的研究民间治疗糖尿病药物灰兜巴粗多糖提取液的最佳脱蛋白工艺条件。方法采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、Sevag法、盐酸法、三氯乙酸(TCA)法,以多糖总糖量的保留率和总固体质量的下降率为双重指标,对灰兜巴粗多糖提取液的脱蛋白... 详细信息

目的研究民间治疗糖尿病药物灰兜巴粗多糖提取液的最佳脱蛋白工艺条件。方法采用十六烷基三乙基溴化铵(CTAB)法、Sevag法、盐酸法、三氯乙酸(TCA)法,以多糖总糖量的保留率和总固体质量的下降率为双重指标,对灰兜巴粗多糖提取液的脱蛋白工艺进行研究,并对脱蛋白效果较好的TCA法进行正交试验优选,最终确定灰兜巴粗多糖提取液的最佳脱蛋白工艺。结果灰兜巴粗多糖提取液的最佳脱蛋白工艺为TCA法,冰水浴静置时间2h、TCA最终质量分数为3%、醇沉静置时间为0 h。结论优化后的TCA法,操作简单,重现性好,可用于灰兜巴粗多糖提取液的脱蛋白工艺。

关键词：灰兜巴多糖脱蛋白正交试验

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灰兜巴活性成分治疗Ⅱ型糖尿病效果研究

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中药材 2013年第8期36卷 1313-1316页

作者：伍艳王小楠陈烽烽陈又南田淑琴四川大学华西医院四川成都610041 西南民族大学生命科学与技术学院四川成都610041

目的:研究灰兜巴各活性成分对Ⅱ型糖尿病的治疗作用。方法:将从灰兜巴提取所得的活性成分分为蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组(蛋白质、多糖和生物碱联合使用),分别对四氧嘧啶制作的Ⅱ型糖尿病模型小鼠进行治疗,30 d后测定小鼠体质... 详细信息

目的:研究灰兜巴各活性成分对Ⅱ型糖尿病的治疗作用。方法:将从灰兜巴提取所得的活性成分分为蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组(蛋白质、多糖和生物碱联合使用),分别对四氧嘧啶制作的Ⅱ型糖尿病模型小鼠进行治疗,30 d后测定小鼠体质量、血糖、肾脏皮质的醛糖还原酶含量及α-葡萄糖苷酶抑制率。结果:经治疗后,与模型组比较,蛋白质组与复合组的小鼠体质量显著升高,血糖显著降低,多糖组、生物碱组指标变化无显著性;蛋白质组、多糖组、生物碱组及复合组的肾脏醛糖还原酶含量分别为0.940、1.30、1.31和0.772 mU/mL;对α-葡萄糖苷酶抑制率分别为46.84%、2.31%、0.96%和52.28%。结论:灰兜巴治疗Ⅱ型糖尿病主要有效成分为其蛋白质成分。

关键词： Ⅱ型糖尿病灰兜巴活性成分醛糖还原酶 α-葡萄糖苷酶

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灰兜巴提取物对四氧嘧啶诱发糖尿病模型小白鼠降血糖的探索

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时珍国医国药 2013年第4期24卷 852-854页

作者：成英宋九华杨孝容刘素君乐山师范学院化学与生命科学学院天然产物研究所四川乐山614004

目的对中药灰兜巴中的有效成分进行提取,并分析提取物中多糖成分的含量,探索灰兜巴提取物降血糖的效果。方法采用浸泡水提的方法对灰兜巴中的有效成分进行提取,紫外分光光度法测定提取物中多糖成分的含量,利用四氧嘧啶诱发小白鼠糖尿病... 详细信息

目的对中药灰兜巴中的有效成分进行提取,并分析提取物中多糖成分的含量,探索灰兜巴提取物降血糖的效果。方法采用浸泡水提的方法对灰兜巴中的有效成分进行提取,紫外分光光度法测定提取物中多糖成分的含量,利用四氧嘧啶诱发小白鼠糖尿病模型,然后利用灰兜巴提取物进行降血糖试验。结果浸泡水提法提取物中总糖含量为47.64%,灰兜巴提取物有降血糖作用,其中100 mg/kg剂量组效果最好。结论浸泡水提法有效可行,灰兜巴提取物对小白鼠有降血糖效果,其中100 mg/kg剂量组效果最明显,这为灰兜巴用于治疗糖尿病提供了参考依据。

关键词：灰兜巴提取物四氧嘧啶降血糖

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灰兜巴粗多糖的提取工艺

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中国医院药学杂志 2011年第5期31卷 351-354页

作者：陈燕忠符美燕谢清春吕竹芬申楼吕锦菲黄春龙广东省药物新剂型重点实验室/广东药学院药物研究所广东广州510006 南方医科大学中医药学院广东广州510515

目的：研究民间治疗糖尿病的药物灰兜巴中粗多糖的最佳提取工艺，为该药材质量和制剂研究奠定基础。方法：以粗多糖总糖含量和粗提取物总固体质量为双重指标，苯酚-硫酸法显色后，分光光度法为检测手段，通过提取方法的筛选后，采用单... 详细信息

目的：研究民间治疗糖尿病的药物灰兜巴中粗多糖的最佳提取工艺，为该药材质量和制剂研究奠定基础。方法：以粗多糖总糖含量和粗提取物总固体质量为双重指标，苯酚-硫酸法显色后，分光光度法为检测手段，通过提取方法的筛选后，采用单因素试验和正交试验进行提取工艺的系统考察，确定灰兜巴粗多糖的最佳提取工艺。结果：选择传统的水煮回流提取法作为灰兜巴粗多糖的提取方法，最终确定的提取工艺为灰兜巴药材粗粉适量，水煮回流提取次数为2次，第1次加水10倍量，浸泡1h，回流煎煮2h，第2次加水8倍量，回流煎煮2h；药液浓缩比1：10～1：15，醇沉浓度80％，静置时间12h。结论：实验结果表明优选出的提取工艺科学、经济，可用于指导质量研究和制剂生产。

关键词：灰兜巴粗多糖提取工艺

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灰兜巴化学成分与周边环境茶叶的关系

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光谱实验室 2011年第6期28卷 3148-3152页

作者：杨孝容向清祥刘超乐山师范学院化学与生命科学学院

探讨了灰兜巴化学成分与周边环境茶叶的相关性。供试品用水超声提取,离心,取上清液,用XtimateTMC18HPLC色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),0.15%磷酸水溶液-甲醇流动相体系进行梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0mL.min-1,检测波长220nm。结果表明,灰... 详细信息

探讨了灰兜巴化学成分与周边环境茶叶的相关性。供试品用水超声提取,离心,取上清液,用XtimateTMC18HPLC色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),0.15%磷酸水溶液-甲醇流动相体系进行梯度洗脱,柱温30℃,流速1.0mL.min-1,检测波长220nm。结果表明,灰兜巴与周边环境茶叶有相同的化学成分,但相对含量相差很大,灰兜巴也有不同于茶叶的特殊成分。

关键词：灰兜巴茶叶化学成分高效液相色谱

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灰兜巴粗多糖的提取及含量测定

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中国实验方剂学杂志 2011年第6期17卷 79-82页

作者：陈燕忠符美燕谢清春吕竹芬申楼陈卉秦贞苗广东省药物新剂型重点实验室广东药学院药物研究所广州510006

目的:研究灰兜巴粗多糖的提取及含量测定,为临床糖尿病的药物治疗提供新的线索,对开发和研究治疗糖尿病的新物质,特别是从天然资源中找到既能治疗糖尿病又无明显不良反应的药物,具有特别重要的意义。方法:采用水提醇沉法从灰兜巴药材中... 详细信息

目的:研究灰兜巴粗多糖的提取及含量测定,为临床糖尿病的药物治疗提供新的线索,对开发和研究治疗糖尿病的新物质,特别是从天然资源中找到既能治疗糖尿病又无明显不良反应的药物,具有特别重要的意义。方法:采用水提醇沉法从灰兜巴药材中提取灰兜巴粗多糖;采用苯酚-硫酸法显色后用分光光度法测定多糖的总糖含量。结果:灰兜巴粗多糖总糖的浓度与吸光度在15～50 mg·L-1呈良好的线性关系,回归方程:A=0.0152C+0.019 2,r=0.999 3。采用换算因子f=3.347 3计算,灰兜巴粗多糖总糖的平均质量分数为99.92%。结论:该试验采用的苯酚-硫酸法易操作、灵敏度高、稳定性和重现性好,可行。该方法可作为灰兜巴粗多糖的含量测定方法。

关键词：灰兜巴粗多糖提取苯酚-硫酸法含量测定

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藏药灰兜巴对STZ诱导的Ⅱ型糖尿病肾病小鼠的肾脏保护作用

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中成药 2018年第3期40卷 505-511页

作者：周园里贾晓斌刘继平封亮陕西中医药大学陕西咸阳712046 江苏省中医药研究院中药释药系统重点实验室江苏南京210028

目的研究藏药灰兜巴的不同提取物对Ⅱ型糖尿病肾病(DKD)模型小鼠肾损伤的保护作用。方法实验通过STZ配合饲喂高糖高脂饲料诱导DKD小鼠模型,给予灰兜巴水提物、醇提物以及多糖不同提取物高(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)剂量8周后,对小鼠血... 详细信息

目的研究藏药灰兜巴的不同提取物对Ⅱ型糖尿病肾病(DKD)模型小鼠肾损伤的保护作用。方法实验通过STZ配合饲喂高糖高脂饲料诱导DKD小鼠模型,给予灰兜巴水提物、醇提物以及多糖不同提取物高(200 mg/kg)、低(100 mg/kg)剂量8周后,对小鼠血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、尿蛋白(mg/24 h)、糖化血清蛋白(Gsp)、终末糖基化产物(AGEs)等指标以及肾脏病理组织学改变进行检测分析,研究藏药灰兜巴对DKD的改善作用,并对肾脏损伤相关蛋白纤维连接蛋白(FN)、细胞间粘附因子(ICAM-1)、转化生长因子(TGF-β1)进行Western blot检测与分析。结果藏药灰兜巴不同提取物可降低小鼠血清血糖及AGEs含有量,降低相关靶点蛋白的表达,有效缓解肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾小管、上皮细胞变性等病理状态,改善DKD小鼠肾功能损伤。结论藏药灰兜巴3种提取物均可改善Ⅱ型DKD小鼠肾脏损伤状态。

关键词：藏药灰兜巴糖尿病肾病(DKD) 终末糖基化产物(AGES) 转化生长因子(TGF-β1)

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