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发酵乳杆菌CCFM1139缓解牙周炎的临床效果评价及机制探究

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发酵乳杆菌CCFM1139缓解牙周炎的临床效果评价及机制探究

作者：叶雨寒江南大学

学位级别：硕士

牙周炎是全球六大慢性炎症疾病之一,由于口腔微生态失调导致持续性炎症,进而造成牙槽骨质流失。我国35-44岁中年人牙周炎的发病率约33%,严重影响患病人群的口腔健康和日常生活。清除致病菌,消除过度炎症,是牙周炎治疗的关键。实验室前... 详细信息

牙周炎是全球六大慢性炎症疾病之一,由于口腔微生态失调导致持续性炎症,进而造成牙槽骨质流失。我国35-44岁中年人牙周炎的发病率约33%,严重影响患病人群的口腔健康和日常生活。清除致病菌,消除过度炎症,是牙周炎治疗的关键。实验室前期筛选到一株具有缓解牙周病潜力的发酵乳杆菌CCFM1139,体外可以显著减少牙周致病菌混菌生物膜量、调节细胞炎症因子和紧密连接蛋白的表达水平,体内能显著降低牙周致病菌定植量、大鼠牙槽骨吸收量,并抑制宿主过度免疫。本研究拟考察发酵乳杆菌CCFM1139辅助牙周基础治疗的临床效果,并探究其缓解牙周炎的作用机制。主要研究内容和结果如下:(1)首先分析了II期牙周炎患者的临床参数与口腔菌群和代谢物的相关性,确定与牙周炎进展相关的龈下菌群和唾液代谢物。卟啉单胞菌属(Porphyromonas)、密螺旋体属(Treponema 2)和普雷沃菌属(Prevotella和Prevotella 7)的细菌在牙周炎病灶区检出率更高,糖杆菌在牙周炎的发展中也发挥重要作用。与多种牙周临床参数有显著正相关的代谢物为5-氨基戊酸(5-Aminovaleric acid)、吲哚-3-乙酸甲酯(Methyl indole-3-acetate)、N6-乙酰基-L-赖氨酸(N6-Acetyl-L-lysine)和棕榈油酸乙酯(Ethyl palmitol eate)等。促进牙周炎发展的代谢物与牙周病原体之间也表现出强烈的正相关,这些菌属和代谢物可以作为预测II期牙周炎发生发展的生物标志物。(2)随后招募了II期牙周炎患者开展一项为期30天的随机双盲、安慰剂对照的临床试验。与安慰剂相比,口服CCFM1139活菌咀嚼片的受试者探诊深度和临床附着丧失相关指标有明显改善。CCFM1139灭活菌体能显著减少促炎因子(MMP8和IL-1β)的分泌,分别减少40.8%和16.9%。CCFM1139活菌组和灭活菌体组的口腔菌群与干预前相比有显著差异。CCFM1139活菌和灭活菌体通过增加口腔共生菌的相对丰度,拮抗牙周病原菌的生长,维持龈下菌群生态平衡。CCFM1139灭活菌体对多种牙周致病菌(卟啉单胞菌属、密螺旋体属和糖杆菌属)有显著抑制效果。非靶向代谢组学的结果表明,CCFM1139活菌和灭活菌体干预后,受试者唾液代谢物的组成和含量与干预前均有显著差异,且CCFM1139活菌和灭活菌体干预后富集的代谢通路很大程度上重叠,包括精氨酸合成通路、丙氨酸、天门冬氨酸和谷氨酸代谢通路和D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢通路。多维度指标评价发酵乳杆菌对牙周炎的临床效果表明,CCFM1139活菌通过维持口腔菌群稳态和调节口腔代谢环境缓解牙周炎,CCFM1139灭活菌体则通过调节宿主免疫,进而抑制牙周病原体的生长和改变唾液代谢物的组成,来减缓牙周炎进程。同时,CCFM1139活菌和灭活菌体均能减少与牙周炎相关的生物标志物的含量。CCFM1139活菌干预后,牙周致病菌丰度均大幅降低,其中普雷沃菌属有显著差异,而灭活菌体可显著降低5种牙周病原菌丰度。发酵乳杆菌CCFM1139干预后微生物分解氨基酸的代谢产物含量显著降低,CCFM1139活菌和灭活菌体抑制的代谢物分别为5-氨基戊酸和吲哚-3-乙酸甲酯。(3)最后构建了牙周炎动物模型和细胞模型,探究发酵乳杆菌CCFM1139缓解牙周炎的作用机制。结果表明,活菌能从致病菌定植、宿主免疫应答和牙槽骨变化三个方面缓解大鼠牙周炎。活菌使大鼠口腔内具核梭杆菌的定植量下降1-2个数量级,在细胞上与牙龈卟啉单胞菌竞争粘附位点并抑制其毒力基因表达;显著下调牙龈组织和血清中的促炎因子IL-1β的表达,减少牙周组织处的炎症因子募集,使大鼠牙槽骨损失减少25.6%。灭活菌体缓解牙周炎效果主要集中在对宿主过度免疫应答的调控,使牙龈组织IL-1β水平从39.54 pg/mg降低至17.95 pg/mg,使血清中IL-1β水平从28.80 pg/m L降低至12.50 pg/m L。同时,灭活菌体也能显著减少骨质流失,使大鼠牙槽骨损失减少15.9%。综上,发酵乳杆菌CCFM1139能有效缓解牙周炎,其活菌与致病菌竞争黏附位点,增加口腔共生菌丰度,调节口腔菌群稳态;灭活菌体调节宿主过度免疫,降低致病菌丰度,进而缓解牙周炎。本研究为发酵乳杆菌CCFM1139开发缓解牙周炎的益生菌产品提供了理论依据和支持。

关键词：发酵乳杆菌CCFM1139 灭活菌体牙周炎龈下菌群免疫调节唾液代谢物

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后生元研究进展及应用现状

食品科学 2024年第1期45卷 326-333页

作者：刘红霞李雪利吴秀英冯旭东郭艳荣姜云芸赖孟瑄马海然内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司内蒙古呼和浩特011500 蒙牛高科乳制品(北京)有限责任公司北京100107

后生元是对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分制剂,具有安全稳定、易于储存和生产、化学结构明确等优点。本文针对后生元主要活性成分、益生功能以及应用现状进行了综述,阐述了关于灭活的菌体细胞、菌体成分及菌体代谢产物对宿主... 详细信息

后生元是对宿主健康有益的无生命微生物和/或其成分制剂,具有安全稳定、易于储存和生产、化学结构明确等优点。本文针对后生元主要活性成分、益生功能以及应用现状进行了综述,阐述了关于灭活的菌体细胞、菌体成分及菌体代谢产物对宿主的健康益处,总结了后生元在增强免疫力、调节胃肠道功能、缓解肥胖、维护口腔健康、预防骨质疏松等方面的研究进展,列举了日本、美国、德国以及国内市场的后生元产品,并提出了后生元存在的挑战和新研究方向。

关键词：后生元灭活菌体活性成分益生功能应用现状

致病菌金黄色葡萄球菌及肺炎链球菌代谢产物及菌体成分对人呼吸道上皮细胞结构与功能的影响

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中华临床免疫和变态反应杂志 2019年第6期13卷 492-500页

作者：张鑫秦啸峰黄琼杨义然杜晓楠李琴吕喆陈彦王炜孙英首都医科大学基础医学院免疫学系

目的探究呼吸系统常见致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S. pneumonia)不同成分对人呼吸道肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)结构与功能的影响。方法 A549细胞分别与S.aureus、S. ... 详细信息

目的探究呼吸系统常见致病菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S. aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia,S. pneumonia)不同成分对人呼吸道肺泡Ⅱ型上皮细胞(A549细胞)结构与功能的影响。方法 A549细胞分别与S.aureus、S. pneumonia细菌培养上清、细菌裂解物及灭活菌体共培养,采用CCK8方法检测上述不同细菌成分对A549细胞增殖功能的影响,采用流式细胞术(flow cytometry)检测不同刺激物诱导细胞发生凋亡与坏死的作用,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定其对炎症细胞因子白细胞介素6、白细胞介素8(IL-6、IL-8)分泌的影响,利用Western blot及细胞免疫荧光染色方法探究不同刺激成分对A549细胞紧密连接蛋白ZO-1、Claudin1、Occludin表达的影响。结果两种细菌培养上清及S. pneumonia裂解物可显著抑制A549细胞增殖并诱导细胞出现凋亡和坏死现象(P灭活菌体可降低紧密连接蛋白ZO-1的表达,但其对另外两种紧密连接蛋白Claudin1和Occludin的表达无显著影响。结论两种细菌感染过程中,不同细菌及细菌的不同成分对上皮细胞作用并不完全相同。细菌培养上清和细菌裂解物主要影响上皮细胞增殖、炎症因子分泌等功能,S. aureus灭活菌体可降低紧密连接蛋白ZO-1的表达进而影响上皮细胞间紧密连接的完整性。

关键词：金黄色葡萄球菌肺炎链球菌细菌培养上清细菌裂解物灭活菌体上皮细胞

耐Cd优势菌的筛选及其去除废水中Cd2+的特性研究

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耐Cd优势菌的筛选及其去除废水中Cd2+的特性研究

作者：杨礴东湘潭大学

学位级别：硕士

重金属镉污染主要来源于颜料、电镀等工业生产过程。镉不仅会造成水体污染,还能经食物链富集于人体,危害人类健康。传统处理方法虽能去除一定浓度的镉,但存在着费用高、会产生二次污染,且难以处理低浓度含镉废水等缺陷。生物法具有廉价... 详细信息

重金属镉污染主要来源于颜料、电镀等工业生产过程。镉不仅会造成水体污染,还能经食物链富集于人体,危害人类健康。传统处理方法虽能去除一定浓度的镉,但存在着费用高、会产生二次污染,且难以处理低浓度含镉废水等缺陷。生物法具有廉价、适应性强、且可实现重金属回收等优势,在含重金属废水处理中有着广泛的应用前景,其中高效吸附重金属微生物的选育已成为研究热点之一。因此,本研究从重金属污染土壤中筛选出耐镉优势菌,选用对镉去除效果较好的2株菌,优化生长条件,考察各因素对优势菌去除废水中镉的影响;在最优条件下,探讨了两株优势菌处理单独含Cd2+以及Cu2+、Mn2+、Pb2+分别与Cd2+共存的废水时,对这些重金属离子的去除效果;还比较了活菌体与灭活菌体对镉的去除率;借助傅里叶红外及X射线光电子能谱分析,初步探讨了优势菌去除镉的作用机理。通过研究,得到以下主要结论：(1)筛选出8株对Cd2+有一定耐性的菌株,选用对镉去除效果较好的2株菌,通过形态特征、生理特征观察可知菌Ⅰ和菌Ⅷ都为革兰氏阴性菌,经16S rDNA序列和系统进化分析,初步确定菌Ⅰ属贪铜菌属,菌Ⅷ属肠杆菌属。(2)菌Ⅰ的最适生长pH为6-8,装液量为100mL培养液/150ml锥形瓶,温度为37℃;菌Ⅷ的最适生长pH为6.5-8,装液量为80mL培养液/150mL锥形瓶,温度为37℃。优势菌去除镉最佳pH为6.5,温度为37℃,反应时间为120min,于最佳条件下,当Cd2+浓度为0.1mg/L时,菌Ⅰ对其去除率达60.02%,菌Ⅷ对其去除率达62.14%。(3)在以优势菌Ⅰ构建的处理体系中,维持Cd2+浓度为0.8mg/L;处理Cu2+/Cd2+共存废水,当Cu2+浓度为0.5-7.5mg/L时,Cd2+去除率在50.99%～64.96%之间,与单独处理含Cd2+废水时相近,而Cu2+去除率可达到99.66%;处理Mn2+/Cd2+或Pb2+Cd2+共存废水,当Mm2+和Pb2+浓度分别为2-15mg/L和0.5-9mg/L时,Cd2+的去除受到明显抑制,其去除率分别低于30%和13%。(4)活菌体菌Ⅰ及菌Ⅷ对镉的去除部位以胞外为主,分别占75.9%和73.77%,其次是胞内,分别占22.09%和24.37%,膜部分仅占2.01%和1.87%。菌Ⅰ活菌体去除镉,主要与P-OH、R-OH、COOH、仲酰胺等基团有关。根据XPS,并参考标准数据库分析得知,Cd于胞内结合类型,主要为Cd(OH)2。(5)当废水中Cd2+浓度为0.6-0.75mg/L时,菌Ⅰ灭活菌体对镉去除率达87.17%,菌Ⅷ灭活菌体对镉去除率达100%。灭活菌体较活菌体去除率高,推测可能的原因是活体细菌能分泌胞外聚合物去除部分Cd2+,且抵抗大部分镉进入细胞体内,而灭活菌体不具备这种抵制机制,可能是通过细胞结构空隙去除镉。

关键词： Cd2+ 金属共存灭活菌体去除机理废水处理

大肠杆菌和ConABP对牛黄成核与核生长的影响

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大肠杆菌和ConABP对牛黄成核与核生长的影响

作者：徐瑞扬州大学

学位级别：硕士

天然牛黄产量极少,人工配制的牛黄其药理作用远不如天然牛黄,国内在牛体内、外成功培植了天然牛黄,但其质和量一直不是非常稳定,主要原因是人们集中在如何提高其产量而忽视了对牛黄形成机理的研究。我们通过牛黄发生器内成黄实验研究了... 详细信息

天然牛黄产量极少,人工配制的牛黄其药理作用远不如天然牛黄,国内在牛体内、外成功培植了天然牛黄,但其质和量一直不是非常稳定,主要原因是人们集中在如何提高其产量而忽视了对牛黄形成机理的研究。我们通过牛黄发生器内成黄实验研究了大肠杆菌、破碎菌体、灭活β-G酶的破碎菌体和ConABP对牛黄形成的作用,动态观察了胆汁主要成分在牛黄形成过程中的变化和胆汁的成黄规律。本试验包括以下三部分: 一、大肠杆菌和破碎的大肠杆菌对牛黄成核与核生长的影响耐胆汁大肠杆菌经超声破碎后,得到含菌体蛋白和β-G酶的破碎菌液,破碎菌液64℃水浴后得到灭活β-G酶的灭活菌液。在体外牛黄发生器内分别添加不同浓度的大肠杆菌活菌液（活菌组）、破碎菌液（破碎组）和灭活菌液（灭活组）进行成黄试验。结果表明,破碎组的最大可视核面积大于同浓度的活菌组和灭活组,活菌组的成核时间早于同浓度的破碎组和灭活组。二、ConABP对牛黄成核与核生长的影响通过亲和层析技术从牛胆囊壁和胆汁中提取ConABP,并对其进行电泳分析;在体外牛黄发生器内添加不同浓度的ConABP进行成黄试验。结果表明,每毫升牛胆汁可以提取0.01mg ConABP。ConABP能增加牛黄核的数量和最大可视核面积。每毫升含有0.0207mg ConABP的胆汁其最大可视核面积最大,每毫升含有0.0109mg ConABP的胆汁其牛黄核的数量最多。三、复合组对牛黄成核与核生长的影响在灭活菌液和破碎菌液中分别添加0.0207mg ConABP/mL,分别形成复合m组和复合p组,观察其在体外牛黄发生器内的成黄效果。结果表明,大肠杆菌为0.1×108cfu/mL的复合m组在成核早期和中期能增加牛黄核的数量和最大可视核面积;复合组p中各组合的牛黄核的数量均低于同浓度的复合m组。

关键词：牛黄大肠杆菌破碎菌体灭活菌体 ConABP

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一种生长抑素基因免疫的新策略研究

一种生长抑素基因免疫的新策略研究

作者：姚艳丰华中农业大学

学位级别：硕士

生长抑素是由下丘脑分泌的一种神经多肽，能抑制GH释放进而抑制动物生长。DNA疫苗由于能同时诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫反应等优点，已经成为研究者关注的焦点之一，但单独使用DNA疫苗在大动物或人体诱导的免疫反应效果不理想... 详细信息

生长抑素是由下丘脑分泌的一种神经多肽，能抑制GH释放进而抑制动物生长。DNA疫苗由于能同时诱导机体产生特异性的体液和细胞免疫反应等优点，已经成为研究者关注的焦点之一，但单独使用DNA疫苗在大动物或人体诱导的免疫反应效果不理想，必须改善现有免疫方式来增强其免疫原性，如基因枪的使用或佐剂的开发利用。基因枪尽管有其高效性，但所需装置昂贵，应用成本较高，因而限制其应用。佐剂的使用是比较理想的方式，但其大都需要特殊处理，符合特定标准，并同DNA疫苗混合后方可应用。另外，DNA疫苗也必须从工程菌中大量抽提出来，费时费力，这势必影响了实验的可操作性，也使实验的成本加大，不利于推广。因此，开发新型免疫策略已成为亟待解决的问题。本研究对一种生长抑素基因免疫的新方法进行了评估，即用含目的质粒的灭活菌体直接免疫(不用抽提质粒)来取代现行的质粒DNA免疫方法(质粒)。以纯质粒免疫组为参照组，同用灭活菌体免疫组进行比较，引用四个参数分别从不同的角度来评估，包括抗生长抑素抗体检测、生长测定、细胞免疫检测、脏器指数检测。 1抗生长抑素抗体检测灭活菌体免疫组，在实验的各个时期，抗体P／N值均极显著高于质粒组(P＜0.01)。在实验期，灭活菌体组的阳性鼠比例亦均显著高于纯质粒组，最大P／N值也出现在此组。并且灭活菌体组也使机体产生有效的免疫记忆或长期的免疫力。 2生长测定即增重检测在增重实验中，灭活菌体组免疫亦表现出比纯质粒组的优势。加免两周时，灭活菌体组增重极显著高于对照组(P＜0.01)，显著高于纯质粒组(P＜0.05)。加免四周后，两实验组增重极显著高于对照组(P＜0.01)，灭活菌体组增重极显著高于纯质粒组(P＜0.01)。实验结束时，两实验组之间差异不显著(P＞0.05)，但灭活菌体组增重高于纯质粒组。 3细胞免疫检测细胞免疫方面，进行了T细胞增殖和DTH两个实验。在T细胞增殖实验中，纯质粒免疫组和灭活菌体免疫组在诱导SS的特异性淋巴细胞增殖方面效果相似，二者差异不显著(P＞0.05)，但都优于各自对照组。DTH实验中无论是纯质粒组，还是灭活菌体组，左脚掌厚度与右脚掌厚度的比值P／N均大于1.0，且在第48h时比值达到高峰，但灭活菌体组和纯质粒组小鼠P／N之间差异不显著(P＞0.05)。 4脏器指数检测脏器指数是重要的生物学指标之一。灭活菌体免疫组同对照组在心脏指数、肝脏指数、肾脏指数、脾脏脾脏、肺脏指数上差异不显著(P＞0.05)，表明新免疫方法并不影响动物的正常生长发育。灭活菌体组在脾脏指数高于对照组和纯质粒免疫组，但差异不显著(P＞0.05)，表明灭活菌体免疫有免疫增强作用。基于以上实验结果，我们得到一种更为经济、方便、免疫效果更好、拥有独立知识产权的基因免疫方式，即这种免疫方式能刺激机体产生较强的细胞和体液免疫反应，使机体产生有效的免疫记忆或长期的免疫力，产生良好的免疫效果，是一种很有前途的基因免疫的新方式。

关键词：生长抑素基因免疫灭活菌体 T细胞增殖 DTH 脏器指数免疫策略

钩端螺旋体七日热血清型(56610)特异性单克隆抗体的研制

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浙江农业大学学报 1997年第6期23卷 655-658页

作者：陈正贤吴建强黄寿森傅桂明浙江农业大学生物技术研究所浙江省卫生防疫站

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２... 详细信息

钩端螺旋体七日热血清型（５６６１０）培养物，经甲醛灭活后免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与ＳＰ２／０骨髓瘤细胞融合获得６株阳性杂交瘤，分别定名为１Ａ９、１Ｂ８、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４、３Ｅ８，其中１Ａ９、１Ｆ９、２Ｄ１０、２Ｅ４为特异性抗５６６１０杂交瘤．抑制试验结果表明，多抗血清能够有效地抑制这些特异性单抗，这些特异性单抗被鉴定为ＩｇＧ１亚类．

关键词：钩端螺旋体七日热血清型单克隆抗体灭活菌体