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漆酶-介体体系(LMS)及其应用

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环境工程 2009年第S1期27卷 598-602,616页

作者：高千千朱启忠山东大学威海分校山东威海264209

漆酶是一种含铜多酚氧化酶,具有催化氧化酚型底物的能力,能参与木素的降解、聚合。它在工业中的应用已拓展到脱墨、漂白、制浆、纤维改性和废水处理等诸多方面。对常用介体、介体的应用及限制等几个方面进行了介绍。

关键词：漆酶-介体体系常用介体应用限制

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漆酶-介体体系催化芳基伯醇直接氧化为羧酸的研究

漆酶-介体体系催化芳基伯醇直接氧化为羧酸的研究

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作者：程爱迪华南理工大学

学位级别：硕士

羧酸是一类重要的化学品,被广泛应用于精细化学品、医药及高分子等领域。伯醇氧化为羧酸是有机化学中的一种基础化学反应。基于化学计量强氧化剂或金属催化剂的传统化学法仍然是当前伯醇氧化为羧酸的主流方式,但是其环境友好性差。O依... 详细信息

羧酸是一类重要的化学品,被广泛应用于精细化学品、医药及高分子等领域。伯醇氧化为羧酸是有机化学中的一种基础化学反应。基于化学计量强氧化剂或金属催化剂的传统化学法仍然是当前伯醇氧化为羧酸的主流方式,但是其环境友好性差。O依赖型的生物催化氧化具有反应条件温和、环境友好、选择性高等特点,符合绿色发展的理念而备受关注。多酶催化氧化体系效率较高,但相对较复杂,需要考虑各酶最适反应条件间的兼容性,而单酶催化体系更简单,但很难同时高效催化羟基和甲酰基的氧化。由此可见,构建高效的单酶催化伯醇氧化为羧酸的体系颇具挑战。2,2,6,6-四甲基哌啶氮氧化物(TEMPO)是一种催化羟基氧化的催化剂,与漆酶偶联可构建高效的醇氧化体系,该体系以分子氧为最终电子受体,无需辅因子参与。本课题组前期研究发现缓冲液体系对漆酶-TEMPO催化醛氧化的杂合活性影响显著。在本论文中,以5-羟甲基糠醛(HMF)氧化为2,5-呋喃二甲酸(FDCA)为模型反应,我们研究了各关键因素对漆酶-TEMPO体系催化FDCA合成的影响,并基于限速步骤的研究,初步阐明了缓冲液对FDCA合成的影响机制。随后,探究了有机溶剂/缓冲液双相体系中漆酶-介体催化疏水性苯甲醇氧化的反应特性。主要结果如下:1.缓冲盐及p H对漆酶-TEMPO体系催化FDCA合成影响最显著。在最优缓冲液体系(柠檬酸盐缓冲液,300 m M,p H 6.0)中,反应24 h后,漆酶-TEMPO催化HMF氧化为FDCA,产率>80%,远高于传统的醋酸盐缓冲液(50-300 m M,p H 4.5-5.0)中的相应值。基于限速步骤(5-甲酰基-2-呋喃甲酸(FFCA)氧化为FDCA)的研究,我们发现在柠檬酸盐缓冲液(>100 m M,p H 6.0)中漆酶-TEMPO催化醛氧化的杂合活性更高,因此能快速将FFCA转化为FDCA,从而显著促进FDCA的合成。在控制反应体系p H为6.0的条件下,漆酶-TEMPO能在26 h内催化200 m M HMF完全氧化为FDCA,产率达94%。该体系被成功放大到50 m L规模,30 h内积累189 m M FDCA,时空产率达1.0 g/L h;经分离纯化后,FDCA收率为90%,纯度为95%。底物谱研究表明,亲水性芳基伯醇易被氧化合成相应的羧酸,最高产率>99%。最后,我们进行了一种重要的药物中间体5-甲基吡嗪-2-羧酸(MPCA)的放大合成和分离纯化,MPCA产率达92%。2.助溶剂二甲基亚砜(DMSO)能显著提高疏水性苯甲醇在水中的溶解度,但其转化率也随之降低。与TEMPO相比,其他高活性氮氧化物介体对苯甲酸合成无显著促进作用。对漆酶友好、且底物和产物分配比合适的有机溶剂有乙酸丁酯、甲基叔丁基醚、环戊基甲醚。在乙酸丁酯/柠檬酸盐缓冲液双相体系下,漆酶-TEMPO催化苯甲醇氧化的转化率最高,仅为18%。在双相体系中,苯甲酸合成受到显著抑制,苯甲醛选择性>99%。相转移催化剂的添加对苯甲醇氧化无促进作用。本研究拓展了漆酶-TEMPO在合成化学中的应用范畴,成功构建了可高效催化亲水性芳基伯醇直接氧化为羧酸的漆酶-TEMPO催化体系,并初步阐明了缓冲液对FDCA合成的影响机制。本研究不仅丰富了该催化氧化体系的相关理论知识,而且还为芳基羧酸的大规模制备奠定技术基础。

关键词：漆酶-介体体系芳基伯醇催化氧化羧酸 2,5-呋喃二甲酸

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漆酶—介体体系对兽药抗生素降解应用及作用机理研究

漆酶—介体体系对兽药抗生素降解应用及作用机理研究

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作者：欧阳斌斌江南大学

学位级别：硕士

磺胺类及四环素类抗生素是两类广谱抗菌抗生素,被广泛使用在农畜牧业中用以预防、治疗动物疾病。但由于兽药抗生素进入动物体内后难以被代谢吸收,因此大部分以原药的形式被排泄至环境。环境中残留的兽药抗生素将会对环境中的生态系统,... 详细信息

磺胺类及四环素类抗生素是两类广谱抗菌抗生素,被广泛使用在农畜牧业中用以预防、治疗动物疾病。但由于兽药抗生素进入动物体内后难以被代谢吸收,因此大部分以原药的形式被排泄至环境。环境中残留的兽药抗生素将会对环境中的生态系统,人类的健康产生危害。目前生物酶法,尤其氧化还原酶系,被认为是一种控制环境中兽药抗生素残留的绿色工具。为适应大规模工业化控制环境中兽药抗生素残留的需求,本课题通过基因挖掘技术,筛选出一种来源于Lysinibacillus fusiformis的漆酶(Lyfu-Lac),详细研究了Lyfu-Lac的酶学性质。同时选择2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)和丁香酸(SA)作为两种介体物质与Lyfu-Lac构成新型漆酶-介体体系,并成功降解共计两类5种环境中常见兽药抗生素。通过液质联用仪器,分析了漆酶-介体体系前后物质变化,推测了漆酶-介体体系降解磺胺类及四环素类抗生素的降解机理。本课题的研究内容总结如下:基于NCBI数据库,通过探针酶在Enzyme Miner上进行同源序列搜索分析,挖掘到来源于Lysinibacillus fusiformis的潜在漆酶基因(Gen Bank:AYW03784.1)。将该潜在漆酶基因与p ET-22b(+)连接,并转化至表达载体*** BL21(DE3)产酶。通过优化IPTG浓度和诱导表达温度提高漆酶的可溶性表达,最终在0.5 mmol/L和18℃的诱导剂浓度和诱导温度条件下,Lyfu-Lac可溶性表达最好。经过镍柱亲和纯化蛋白及SDS-PAGE分析,结果显示Lyfu-Lac的蛋白单亚基分子量约为59 k Da。通过氨基酸序列比对、进化树分析,发现该潜在基因具有漆酶完全保守的HCH短肽,为一种新来源的细菌漆酶。通过同源建模,发现Lyfu-Lac的活性中心含有T1,T2,T3三个铜离子结合位点,推测该目的蛋白为一种新的三结构域细菌漆酶。以ABTS为底物,研究Lyfu-Lac的酶学性质,结果显示Lyfu-Lac的最适p H和最适温度分别在4.0和80℃。Lyfu-Lac为严格Cu依赖漆酶,并且仅在Cu存在的情况下发挥其酶活。Lyfu-Lac能够在40℃下维持长时间的稳定,保温12 h仍保持71%的残余酶活。Nano-DSC结果显示,Lyfu-Lac的T值(代表50%蛋白质解折叠时的温度)为88℃,具有较好的热力学稳定性。酶动力学研究显示,Lyfu-Lac的最大反应速率V,米氏常数K,转化常数k,二级速率常数k/K分别为0.045μmol·min,0.0317±0.0011mmol/L,249.10±0.04 s,7858.05±1.39 m M·s。选择ABTS和SA为两种介体物质与Lyfu-Lac构成漆酶-介体体系,并分别应用Lac-ABTS体系和Lac-SA体系降解磺胺类抗生素和四环素类抗生素,共计两类5种抗生素。其中,Lyfu-Lac与SA构成的Lac-SA体系分别能够降解87.5%磺胺嘧啶,92.2%磺胺二甲嘧啶,86.5%磺胺甲噁唑。Lyfu-Lac与ABTS构成的Lac-ABTS体系能够降解超过95%的四环素和83.1%的土霉素。通过液质联用分析,明确了Lyfu-Lac与ABTS、SA构成的漆酶-介体体系降解磺胺类和四环素类抗生素过程中的底物变化,并根据产物的生成,推测降解过程应分为两步反应:第一步Lyfu-Lac与介体物质(SA/ABTS)反应产生自由基(二甲氧基苯醌/ABTS·);第二步自由基与底物发生加合反应生成终产物。且反应过程中存在两种亲和力:酶-介体亲和力(E-M,决定第一步反应),以及介体-底物亲和力(M-S,决定第二步反应)。

关键词：兽药抗生素漆酶-介体体系抗生素降解产物鉴定机理

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白腐真菌漆酶基因异源表达与污染物降解研究

白腐真菌漆酶基因异源表达与污染物降解研究

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作者：袁鹏华中科技大学

学位级别：硕士

漆酶因其底物广泛性,能够有效降解木质素及多种有机污染物。白腐真菌具有丰富的漆酶基因资源,故本研究以能够高效降解木质素功能的白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC 162为出发菌株,在明确其胞外粗酶液对不同结构染料的降解的基础上,... 详细信息

漆酶因其底物广泛性,能够有效降解木质素及多种有机污染物。白腐真菌具有丰富的漆酶基因资源,故本研究以能够高效降解木质素功能的白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC 162为出发菌株,在明确其胞外粗酶液对不同结构染料的降解的基础上,以漆酶基因获取、表达及污染物降解为主要研究内容。进行了漆酶基因的克隆、异源表达、分离纯化、理化性质及其对硝基苯酚类(NPs)、氯酚类(CPs)和磺胺类(SAs)有机污染物的降解及其途径研究及其降解研究。主要研究结论如下:白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC 162胞外粗酶液能够有效降解单偶氮类,三氯甲烷类和蒽醌类的部分染料。其中,MO(100 mg/L),CV(100 mg/L),MG(100mg/L),BB(100 mg/L),RB4(800 mg/L)和RBBR(800 mg/L)在28℃,24 h后的降解率依次为81.3%、87.6%、85.1%、98.0%、64.6%和89.1%。在降解体系中添加了一定浓度的漆酶特异性抑制剂(曲酸)之后,降解效果显著下降。各合成染料在相同条件下,降解率分别降至0.1%、12.9%、11.9%、18.9%、9.3%和5.1%。表明漆酶是胞外粗酶液降解染料的重要因素。对来源于白腐真菌Pleurotus ostreatus HAUCC 162的三个漆酶基因(lacc6,lacc9和lacc10)在毕赤酵母中实现了异源表达。并通过发酵培养和分离纯化分别获得了三个具有漆酶活性的重组漆酶(rLACC6,rLACC9和rLACC10),其表观相对分子质量分别为64、75和64 kDa。通过分离纯化之后得到的重组漆酶比酶活分别为45.50、9.36和8.56 U/mg。最适反应pH分别为2.5、3.5和4.0。最适反应温度分别为60、40和40℃。对低温和偏碱性的耐受性更好。DDT和叠氮钠对三个重组漆酶的抑制效果最明显。rLACC6对金属离子和有机试剂的适应性及耐受性优于rLACC9和rLACC10。三个重组漆酶对Cu,K和Na的适应性优于其他金属离子。对丙酮,乙醇和乙腈的耐受性优于其他有机试剂。进一步研究了重组漆酶(rLACC6,rLACC9和rLACC10)以丁香酸作为介体,在漆酶-介体(LMS)下对不同类型的有机污染物的降解情况。三个重组漆酶对2-硝基苯酚(2-NP)、3-硝基苯酚(3-NP)、4-硝基苯酚(4-NP)、2-氯酚(2-CP)、3-氯酚(3-CP)、4-氯酚(4-CP)、2,4-二氯酚(2,4-DCP)、2,6-二氯酚(2,6-DCP)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺二甲嘧啶(SMZ)和磺胺甲恶唑(SMX)在60 min后的最高降解率分别为59.21%、47.91%、60.24%、41.35%、32.68%、36.72%、37.82%、35.05%、98.1%、97.5%和97.8%。降解过程均符合一级动力学方程。通过LC-MS和GC-MS检测了降解不同类型的有机污染物的过程中产生的中间产物,并推测了rLACC6对4-NP,2,4-DCP和SDZ的可能的降解途径。其中3-硝基粘康酸盐和3-氯粘康酸盐分别为4-NP和2,4-DCP降解过程中的关键中间产物。综上所述,本研究通过克隆表达及分离纯化得到了三个重组漆酶(rLACC6、rLACC9和rLACC10),该重组漆酶能够对硝基苯酚类,氯酚类和磺胺类污染物实现有效的降解。通过检测降解中间产物推测了各类型污染物可能的降解途径。为漆酶资源的获取和应用打下了良好的基础。

关键词：漆酶基因异源表达重组漆酶漆酶-介体体系污染物降解

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从黑液中分离小分子酚类化合物作为漆酶的天然介体

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中国造纸学报 2008年第3期23卷 102-106页

作者：罗小林詹怀宇付时雨刘婧华南理工大学制浆造纸工程国家重点实验室广东广州510641

浅述了LMS(漆酶-介体体系)中酶催化介体的研究进展,特别是从黑液中分离木素小分子酚类衍生物作为漆酶的天然介体,举例说明了漆酶-天然介体体系应用于染料脱色和纸浆生物漂白等方面的研究结果。

关键词：漆酶-介体体系天然介体木素小分子酚类衍生物分离

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