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漆树酸抑制组蛋白H3K9乙酰化对高果糖诱导大鼠主动脉平滑肌细胞表型转化的影响

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中华高血压杂志 2023年第11期31卷 1071-1078页

作者：李顺梅商黔惠赵国刘娟左康家赵宇遵义医科大学附属医院临床医学研究所心血管病研究所高血压研究室贵州遵义563003 遵义医科大学附属医院心内科贵州遵义563003 遵义医科大学附属医院内分泌科贵州遵义563003

目的研究漆树酸抑制组蛋白H3K9乙酰化修饰对高果糖诱导血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的影响及其可能的机制。方法组织块贴壁法培养SD大鼠主动脉VSMC,细胞计数试剂(CCK-8)法检测果糖对VSMC增殖的影响,确定果糖干预浓度,进一步检测不同... 详细信息

目的研究漆树酸抑制组蛋白H3K9乙酰化修饰对高果糖诱导血管平滑肌细胞(VSMC)表型转化的影响及其可能的机制。方法组织块贴壁法培养SD大鼠主动脉VSMC,细胞计数试剂(CCK-8)法检测果糖对VSMC增殖的影响,确定果糖干预浓度,进一步检测不同浓度漆树酸对高果糖致VSMC增殖的影响,确定漆树酸干预浓度。采用Western-blot、免疫荧光等实验方法探究漆树酸抑制组蛋白H3K9乙酰化修饰对高果糖诱导VSMC表型转化标志蛋白和核因子κB(NF-κB)/核苷酸结合寡聚结构域样受体蛋白3(NLRP3)表达的影响。结果果糖浓度在5~30 mmol/L干预48、72 h可促进VSMC增殖(P漆树酸以浓度依赖的方式抑制高果糖诱导的VSMC增殖。Spearman相关分析显示漆树酸浓度与细胞抑制率呈正相关(r_(s)=0.98,P酸乙酰化蛋白(H3K9ac)、p-NF-κBp65、NLRP3表达增加(P漆树酸可使α-SMA、SM22α、Calponin表达增加(P漆树酸抑制高果糖诱导大鼠主动脉VSMC收缩表型向合成表型转化,其机制可能与漆树酸抑制PCAF介导的H3K9乙酰化修饰和NF-κB/NLRP3表达有关。

关键词：漆树酸高果糖血管平滑肌细胞表型转化

漆树酸通过调控KAT8介导的组蛋白H4K16ac高乙酰化改善TAC小鼠心肌纤维化

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重庆医科大学学报 2023年第3期48卷 241-247页

作者：张焕婷吴书琪彭昌贵州省儿童医院/遵义医科大学附属医院小儿内科遵义563000

目的:探讨组蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)抑制剂漆树酸(anacardic acid,AA)改善胸主动脉缩窄术(tho⁃racic aortic constriction,TAC)小鼠心肌纤维化的组蛋白乙酰化调控机制,为心肌纤维化的防治提供新靶点。方法:选择6~8周SPF... 详细信息

目的:探讨组蛋白乙酰化酶(histone acetylases,HATs)抑制剂漆树酸(anacardic acid,AA)改善胸主动脉缩窄术(tho⁃racic aortic constriction,TAC)小鼠心肌纤维化的组蛋白乙酰化调控机制,为心肌纤维化的防治提供新靶点。方法:选择6~8周SPF级昆明小鼠为研究对象,按照随机数字表法将小鼠分为5组:正常(Normal)组、假手术(Sham)组、胸主动脉缩窄(TAC)组、胸主动脉缩窄+溶剂对照(TAC+Veh)组、胸主动脉缩窄+漆树酸(TAC+AA)组。12周后采用超声心动图检测各组小鼠模型构建情况;收集各组小鼠心脏组织进行以下检测:马松染色观察心肌组织纤维化情况;Western blot检测KAT8、H4K16ac、TGF-β1、SMAD3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达情况;免疫共沉淀检测KAT8与H4K16ac的相互作用关系。结果:超声心动图表明TAC模型小鼠构建成功。马松染色结果表明,TAC组小鼠心脏较Sham组增大,心肌组织中胶原沉积增多,纤维化明显,而TAC+AA组较TAC组小鼠心脏缩小,心肌组织中胶原沉积减少,纤维化程度减轻。Western blot结果发现,TAC组小鼠心肌组织中KAT8及组蛋白H4K16ac的蛋白表达水平较Sham组明显升高(均P<0.05),且TGF-β1、SMAD3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达水平较Sham组明显升高(均P<0.05)。与TAC组比较,AA明显降低TAC小鼠心肌组织中KAT8过表达及H4K16ac高乙酰化(均P<0.05)。同时,TAC+AA组TGF-β1、SMAD3、CollagenⅠ、CollagenⅢ蛋白表达较TAC组明显下降(均P<0.05)。免疫共沉淀结果显示,KAT8可以与H4K16ac相互结合。此外,AA能够明显改善TAC小鼠的生存率。结论:KAT8介导的组蛋白H4K16ac高乙酰化可能通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路参与TAC小鼠心肌纤维化,而AA能够抑制KAT8介导的组蛋白H4K16ac高乙酰化进而改善TAC小鼠心肌纤维化。

关键词：漆树酸组蛋白乙酰化心肌纤维化小鼠

漆树酸联合紫杉醇对肝癌细胞生长抑制和凋亡的影响

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实用医学杂志 2013年第7期29卷 1044-1047页

作者：黄洪标周萍赵灿国杨昌山董晓先广州医学院病理生理学教研室 510182

目的:评价漆树酸和紫杉醇联合用药对人肝癌HepG2细胞是否具有协同作用。方法:人肝癌HepG2细胞经漆树酸和(或)紫杉醇处理后,MTS法检测细胞增殖情况,流式细胞仪技术检测细胞凋亡,Westernblot方法检测Bax、Bcl-2及Caspase-3、8、9和PARP凋... 详细信息

目的:评价漆树酸和紫杉醇联合用药对人肝癌HepG2细胞是否具有协同作用。方法:人肝癌HepG2细胞经漆树酸和(或)紫杉醇处理后,MTS法检测细胞增殖情况,流式细胞仪技术检测细胞凋亡,Westernblot方法检测Bax、Bcl-2及Caspase-3、8、9和PARP凋亡相关蛋白的变化。结果:漆树酸和紫杉醇联合应用能够明显增强对HepG2细胞的增殖抑制,与单独用药组相比具有明显的协同作用。漆树酸联合紫杉醇可以明显诱导HepG2细胞凋亡。两药联合作用可以诱导Bax表达增加,Bcl-2表达减少,Bax/Bcl-2比率增加,引起Caspase-3、8、9的活化,PARP的切割。结论:漆树酸和紫杉醇联合用药具有协同作用,明显增强抑制HepG2细胞的增殖和诱导细胞凋亡,其作用机制可能与Caspase系统活化相关。

关键词：肝肿瘤漆树酸紫杉醇肝癌细胞

漆树酸对人前列腺癌细胞LNCaP细胞周期的影响及机制

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广东医学 2015年第5期36卷 657-659页

作者：刘宁宁董晓先华先良廖宇宁黄洪标广州医科大学附属第二医院广州心血管疾病研究所广州510260 广州医科大学病理生理学教研室广州510182 湖北省黄石市中心医院湖北理工学院附属医院肿瘤内科 435000

目的观察漆树酸对人前列腺癌细胞LNCa P细胞周期的影响并分析其机制。方法人前列腺癌细胞LNCa P经漆树酸处理后,MTS法观察不同时间、不同浓度的漆树酸对细胞增殖率的影响,流式细胞术分析细胞周期变化,Western blot方法观察漆树酸作用后... 详细信息

目的观察漆树酸对人前列腺癌细胞LNCa P细胞周期的影响并分析其机制。方法人前列腺癌细胞LNCa P经漆树酸处理后,MTS法观察不同时间、不同浓度的漆树酸对细胞增殖率的影响,流式细胞术分析细胞周期变化,Western blot方法观察漆树酸作用后细胞周期相关因子CDK4、CDK6、cyclin D1和P27蛋白水平的表达变化。结果 (1)漆树酸时间和浓度依赖性地抑制细胞增殖;(2)经漆树酸处理后的细胞出现生长抑制,细胞主要阻滞在G0/G1期;(3)漆树酸作用细胞后,CDK4、CDK6、cyclin D1蛋白表达水平低于溶剂对照组,而P27蛋白表达水平高于溶剂对照组。结论漆树酸可抑制LNCa P细胞增殖,其机制可能是与细胞周期相关蛋白P27的上调,CDK4、CDK6、cyclin D1表达下调有关,导致细胞阻滞在G0/G1期。

关键词：漆树酸前列腺癌细胞周期

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漆树酸抗包虫病的体内药效及机制研究

漆树酸抗包虫病的体内药效及机制研究

作者：宋晓霞兰州大学

学位级别：硕士

目的:探索漆树酸对包虫病的治疗效果及其可能的机制。方法:建立小鼠包虫病模型,漆树酸治疗后通过以下方法评价其药效:(1)称量棘球蚴组织湿重;(2)观察细粒棘球蚴组织超微结构变化;(3)观察泡球蚴组织病理变化;(4)FCM检测脾脏淋巴细胞;(5)E... 详细信息

目的:探索漆树酸对包虫病的治疗效果及其可能的机制。方法:建立小鼠包虫病模型,漆树酸治疗后通过以下方法评价其药效:(1)称量棘球蚴组织湿重;(2)观察细粒棘球蚴组织超微结构变化;(3)观察泡球蚴组织病理变化;(4)FCM检测脾脏淋巴细胞;(5)ELISA法检测血清中IL-4和IFN-γ的水平。通过以下方法研究漆树酸抗包虫机制:(1)ELISA法检测血清中VEGF的浓度;(2)IHC检测泡球蚴及其周围肝脏织中CD34的表达水平。结果:1.漆树酸对棘球蚴体内生长有明显的抑制作用。与模型组相比,漆树酸组棘球蚴组织湿重明显降低,呈现较强的抗包虫效果(P漆树酸对棘球蚴组织的生发层结构破坏明显,生发层细胞完全脱落。2.漆树酸可影响细粒棘球蚴病及泡球蚴病小鼠免疫功能。与细粒棘球蚴模型组相比,IL-4的表达水平明显升高(P漆树酸组CD4T细胞和CD8T细胞的比例显著升高(P漆树酸可抑制泡球蚴组织血管生长。与模型组相比,漆树酸组VEGF的表达水平显著降低(P漆树酸具有明显的抗包虫作用,对细粒棘球蚴组织和泡球蚴组织的生发层均具有明显的损伤作用,有望作为临床治疗包虫病的药物。2.漆树酸可以通过调节IL-4和IFN-γ的表达水平,诱导CD4T细胞和CD8T细胞增殖,下调T细胞表面负调节分子PD-1的表达等机理,改善包虫病模型小鼠的免疫功能。3.漆树酸可抑制小鼠血清中VEGF的表达,同时对泡球蚴及其周围肝脏组织的CD34的表达具有抑制作用,从而影响泡球蚴组织表面血管新生。

关键词：漆树酸细粒棘球蚴泡球蚴 VEGF CD34

漆树酸抑制肿瘤血管新生及早产儿视网膜病变模型的建立

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漆树酸抑制肿瘤血管新生及早产儿视网膜病变模型的建立

作者：吴媛媛华东师范大学

学位级别：硕士

1.漆树酸通过Src/FAK信号通路抑制肿瘤生长及肿瘤血管新生血管新生是指已经存在于组织的成熟血管内皮细胞通过增殖、迁移以出芽或者嵌入的方式形成新的子代血管的过程。通常情况下只发生在胚胎发育期,生殖周期和伤口愈合期,但在很多病... 详细信息

1.漆树酸通过Src/FAK信号通路抑制肿瘤生长及肿瘤血管新生血管新生是指已经存在于组织的成熟血管内皮细胞通过增殖、迁移以出芽或者嵌入的方式形成新的子代血管的过程。通常情况下只发生在胚胎发育期,生殖周期和伤口愈合期,但在很多病理条件下,如实体肿瘤,糖尿病性视网膜病变,类风湿性关节炎,银屑病和动脉粥样硬化等,疾病与血管新生密切相关。漆树酸,即6-+五烷基水杨酸,提取于银杏和腰果,是组蛋白乙酰转移酶的抑制剂,己被证明具有消炎、抗癌、抗氧化及杀菌等功效。然而,关于漆树酸是否能够调控血管内皮细胞生物学功能以及抑制血管新生的报道鲜见。在本研究中,我们发现漆树酸不仅能在体外细胞水平上抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移、粘附及成管,而且能够在体内水平上显著抑制鸡胚尿囊膜血管形成(n=10)和小鼠角膜血管新生(n=10)。分子机理研究揭示,漆树酸能够浓度梯度依赖性和时间依赖性地抑制Src、FAK激酶的活性,调控Rho-GTPases活性(抑制Rac1-GTPases和Cdc42-GTPases)。每天按2mg/kg的剂量连续皮下给药处理荷瘤裸鼠30d(n=6-7),漆树酸能明显抑制前列腺PC-3肿瘤的体积及重量,但用药处理不影响荷瘤鼠正常体征指标。肿瘤组织免疫组织化学分析发现,给药组肿瘤中CD31和Ki67表达明显降低,提示漆树酸能有效抑制实体肿瘤血管新生和肿瘤细胞增殖。因此,我们的研究结果表明漆树酸能通过抑制Src/FAK信号通路明显抑制肿瘤的生长及肿瘤血管新生。2.早产儿视网膜病变模型的建立糖尿病性视网膜病变(DR)、老年性黄斑变性(AMD)和早产儿视网膜病变(ROP)这三种常见的眼科疾病严重致盲。致盲的主要原因则是病理性的视网膜血管新生和脉络膜血管新生。为了进一步补充和发展本课题组的血管新生疾病模型,本人参考相关文献,在本实验室条件下,建立了早产儿视网膜病变模型。方法如下,将出生7天后的C57BL/6小鼠用75%的高浓度氧气连续处理5天,再在正常条件下饲养5天并此时行药物处理。将葡聚糖荧光素通过心脏灌流的方式注射到血液中,使周身血管染成绿色。取出眼睛,4%多聚甲醛固定,并在解剖镜下剥离视网膜,荧光显微镜下观察、拍照并统计。结果发现,本方法可成功建立早产儿视网膜病变模型,待测药物藤黄酸和冬凌草甲素等能显著抑制视网膜新生血管的形成。目前该模型已在本研究所内部推广使用。

关键词：漆树酸血管新生肿瘤早产儿视网膜病变动物模型

漆树酸通过调控KAT8-HAT改善TAC小鼠心肌纤维化及心功能

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漆树酸通过调控KAT8-HAT改善TAC小鼠心肌纤维化及心功能

作者：张焕婷遵义医科大学

学位级别：硕士

目的:探讨组蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases,HATs）抑制剂漆树酸（anacardic acid,AA）改善胸主动脉缩窄术（Thoracic aortic constriction,TAC）致小鼠心肌纤维化的组蛋白乙酰化酶KAT8（K（Lysine）acetyltransferase 8,KAT8）介导的H4K16ac乙酰化的修饰情况,以及小鼠心肌纤维化过程中纤维化相关蛋白的表达水平。方法:选择6-8周SPF级昆明小鼠为研究对象,按照乱数表法将实验动物进行分组:正常（Normal）组、假手术（Sham）组、胸主动脉缩窄（TAC）组、胸主动脉缩窄术后溶剂对照组（TAC+Veh）组、胸主动脉缩窄+漆树酸（TAC+AA）组小鼠。TAC组采取横向主动脉缩窄（TAC）手术以构建压力过载诱导的心肌纤维化模型。Sham组对小鼠胸主动脉只分离,不结扎。TAC+AA组在TAC术后1周开始给予腹腔注射AA（5 mg/kg,,3次/周）,持续至术后12周。TAC+Veh组在TAC术后腹腔注射同AA等剂量和等次数的DMSO至术后12周。在术后12周取材小鼠心脏组织进行以下实验:（1）超声多普勒评估手术效果,观察结扎部位情况、检测主动脉直径及血流流速;（2）马松染色（Masson’s trichrome,Masson）观察心脏形态与心肌组织的纤维化情况;（3）Western blot（WB）检测KAT8、H4K16ac、TGF-β1、SMAD3、Collagen I、CollagenⅢ蛋白表达情况;（4）免疫共沉淀检测KAT8与H4K16ac的相互作用关系。结果:（1）超声心动图表明,TAC组小鼠无名、左颈动脉和主动脉之间结扎部位出现狭窄。同时经测量TAC组主动脉弓结扎处的直径较Sham组明显减小（P＜0.05）,TAC组血流速度较Sham组显著增快（P＜0.05）。（2）Masson染色结果表明,TAC组小鼠心脏较Sham组增大,心肌组织中胶原增多,纤维化增加,而TAC+AA组较TAC组小鼠心脏减小,心肌组织中胶原减少,纤维化减轻。而Sham组与Normal组相比、TAC组与TAC+Veh组相比上述指标无明显变化。（3）WB结果发现,TAC组的组蛋白乙酰化酶KAT8及H4K16ac乙酰化的蛋白表达水平较Sham组显著升高（P＜0.05）,且TGF-β1、SMAD3、Collagen I、CollagenⅢ的蛋白表达水平较Sham组显著升高（P＜0.05）。而与TAC组比较,AA降低了TAC小鼠心脏中KAT8的蛋白过表达及H4K16ac的高乙酰化（P＜0.05）。同时,TAC+AA组中TGF-β1、SMAD3、Collagen I、CollagenⅢ的蛋白表达较TAC组下降（P＜0.05）。而Sham组与Normal组相比、TAC+Veh组相比上述指标无统计学差异（P＞0.05）。（4）免疫共沉淀结果显示,组蛋白乙酰化酶KAT8可以与H4K16ac相互结合。结论:（1）KAT8介导的组蛋白H4K16ac高乙酰化可能通过调控TGF-β1/SMAD3信号通路参与TAC小鼠心肌纤维化。（2）AA可能通过抑制KAT8介导的组蛋白H4K16ac高乙酰化影响TGF-β1/SMAD3信号通路进而改善TAC小鼠心肌纤维化。目的:探讨通过AA对组蛋白乙酰化的调控作用改善TAC致小鼠心肌收缩功能障碍及对TAC小鼠生存率的影响。方法:选择6-8周SPF级昆明小鼠为研究对象,按照乱数表法将实验动物进行分组:正常（Normal）组、假手术（Sham）组、胸主动脉缩窄（TAC）组、胸主动脉缩窄术后溶剂对照组（TAC+Veh）组、胸主动脉缩窄+漆树酸（TAC+AA）组小鼠。TAC组采取横向主动脉缩窄（TAC）手术以构建压力过载诱导的心肌纤维化模型。Sham组对小鼠胸主动脉只分离,不结扎。TAC+AA组在TAC术后1周开始给予腹腔注射AA（5 mg/kg,3次/周）,持续至术后12周。TAC+Veh组在TAC术后腹腔注射同AA等剂量和等次数的DMSO至术后12周。在术后12周取材小鼠心脏组织进行以下实验:（1）小鼠心脏超声检测小鼠心脏心室壁的厚度与左心室腔的大小,采用M型胸骨旁短轴视图测量三个心动周期的左心室收缩的相关指标。（2）Western blot检测心肌组织中核心转录因子GATA4及心脏收缩舒张的相关调节蛋白c Tn I、β-MHC蛋白表达情况。（3）Co IP检测H4K16与GATA4的相互作用关系。（4）观察各组小鼠生存率。结果:（1）心脏彩色超声结果表明,TAC组小鼠舒张期左室后壁及收缩期前壁后壁厚度较Sham组均明显变薄,左室容积明显增加（P＜0.05）,而经AA干预后舒张期左室后壁及收缩期前壁厚度较TAC组增厚,左室容积下降（P＜

关键词：漆树酸组蛋白乙酰化心肌纤维化 GATA4 心功能组蛋白乙酰化酶8

RP-HPLC测定银杏叶提取物中银杏酸和漆树酸的含量

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中成药 2005年第5期27卷 597-598页

作者：冯定军帅秋娟周海滨宁波立华制药有限公司浙江宁波315000 宁波天衡制药有限公司浙江宁波315000

银杏叶提取物(EGb)及其制剂已成为国内外预防和治疗心脑血管疾病广泛应用的天然药物,但EGb中的有害成分烷基酚酸类化合物却限制了其制剂的进一步开发及临床应用.其中银杏酸和漆树酸是银杏叶制剂引起临床不良反应的主要成分,具有致敏性... 详细信息

银杏叶提取物(EGb)及其制剂已成为国内外预防和治疗心脑血管疾病广泛应用的天然药物,但EGb中的有害成分烷基酚酸类化合物却限制了其制剂的进一步开发及临床应用.其中银杏酸和漆树酸是银杏叶制剂引起临床不良反应的主要成分,具有致敏性和致突变毒性.因此,银杏酸和漆树酸的限量是评价银杏叶制剂质量的关键指标之一[1].

关键词：银杏酸漆树酸 RP-HPLC 含量测定

漆树酸诱导ATF4依赖的内质网应激引起肿瘤细胞凋亡

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漆树酸诱导ATF4依赖的内质网应激引起肿瘤细胞凋亡

作者：华先良广州医科大学

学位级别：硕士

漆树酸（Anacardic acid, AA)是一种从传统中药材收敛两翼木中提纯天然化合物，研究表明它具有抗肿瘤活性。然而，漆树酸抗肿瘤作用的祀点尚不明确。我们发现，漆树酸能够诱导人肝癌细胞HepG2和人骨髓瘤细胞U266调亡，是一种有效的内质... 详细信息

漆树酸（Anacardic acid, AA)是一种从传统中药材收敛两翼木中提纯天然化合物，研究表明它具有抗肿瘤活性。然而，漆树酸抗肿瘤作用的祀点尚不明确。我们发现，漆树酸能够诱导人肝癌细胞HepG2和人骨髓瘤细胞U266调亡，是一种有效的内质网应激的诱导剂。漆树酸可以浓度和时间依赖增加HepG2和U266细胞中内质网应激信号通路中关键分子的表达，葡萄糖调节蛋白（glucose-regiilated protein, GRP)78、磷酸化的真核翻译起始因子2的a亚单位（eIF2a)、活化的转录因子4(ATF4)和生长停滞及DNA损伤基因153(CHOP/GADD153);小分子干扰RNA (siRNA)沉默ATF4的表达可以部分逆转漆树酸诱导的细胞调亡，沉默CHOP/GADD153的表达则会加重细胞的死亡;漆树酸能够在体抑制HepG2细胞异种移植瘤的生长，并诱导裸鼠肿瘤组织产生内质网应激。以上结果表明漆树酸能够通过诱导ATF4依赖的内质网应激引起肿瘤细胞调亡。方法与结果1、MTS法检测细胞生长抑制率用MTS (购于美国Promega公司）法检测细胞生长抑制率⑴。取对数生长期的细胞，按2500个细胞/lOOmL接种于96孔板，总体积lOOul。细胞贴壁24小时之后更换培养基，按需要给予不同的药物处理相应的时间，每孔加入20ul的MTS,在37DC温箱里继续經育3h，用酶标仪(Sunrise, Tecan)读取每孔的光密度值（OD=490nm)。溶剂对照组作为对照，计算药物对细胞生长的抑制率（IR)，IR=(1-给药组吸光度值/对照组吸光度值）xlOO。/。，实验重复3次。结果证实漆树酸浓度和时间依赖性抑制HepG2和U266细胞的增殖。2、克隆形成实验克隆形成实验的实验方法如前所述[2]。将药物处理12h的HepG2和U266细胞重悬在含30%琼脂糖、20%的胎牛血清和50%RPMI-1640培养基的6cm dish中，在37°C含5%C02的培养箱中培养7天，用0.3%结晶紫染色后在光学显微镜下计数，实验重复3次。结果表明漆树酸完全抑制HepG2和U266细胞的集落形成。3、流式细胞仪检测细胞调亡通过流式细胞仪检测Annexin V-FITC和PI双染的细胞调亡情况。将HepG2、U266和16HBE细胞离心收集后用PBS洗两次，再用结合缓冲液重悬后加入AnnexinV-FITC和PI，4奶1光經育15min-30min内流式细胞仪检测分析。结果发现HepG2和U266细胞中Annexin V-FITC和PI双染的细胞数明显增多，而16HBE细胞中Annexin V-FITC和PI双染的细胞数没有明显变化。表明漆树酸能够诱导肿瘤细胞调亡而对正常细胞诱导调亡不明显。4、细胞调亡的形态学变化用活细胞动态显微镜拍照，观察药物处理后Annexin V-FITC和PI染色的HepG2和U266细胞形态改变，双染的阳性细胞数明显增多，并有典型细胞调亡的形态学改变。5、siRNA的转染为了沉默CHOP或ATF-4在HepG2和U266细胞中的表达，用Lipofectamine2000做载体将干扰RNA转入细胞中，6h后换培养基。结果表明，漆树酸诱导的HepG2和U266细胞调亡中，CHOP不是最关键的调节分子，而ATF4依赖的内质网应激起了重要的作用。6、裸鼠荷瘤实验的建立SPF级雄性、5周龄的Balb/c裸鼠购于广东省动物中心并按照SPF级词养。以IxlO6个细胞/只在裸鼠的左侧背部皮下接种HepG2细胞，当肿瘤体积达50-75^mm时随机分成两组（每组6只），荷瘤裸鼠分别用对照溶剂和漆树酸（2mg/kg/day)给药14天。游标卡尺测量肿瘤的长度和宽度，肿瘤的体积=长度/2X宽度2。比起对照组来，给药组肿瘤体积被抑制了68%，肿瘤体重被抑制了41%。两组体重没有明显的差异。免疫组化发现漆树酸可以上调BiP、CHOP、ATF4和活化的Caspase-3的表达。结果说明漆树酸可以在体内诱导内质网应激并抑制肿瘤生长。7、蛋白印迹实验蛋白印迹实验的方法如前所述[3]。具体步骤是：给药后处理细胞、裂解细胞、提取总蛋白，测蛋白浓度，调成一致的浓度，每孔上相同的蛋白量，12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白后转到PVDF膜。5%脱脂牛奶在室温經育Ih，一抗4°C經育过夜，PBST洗膜3次，加入二抗室温經育Ih。再用PBST洗膜3次，使用增强化学发光（ECL)试剂盒通过X射线胶片曝光显影。结果表明，HepG2和U266细胞经漆树酸处理后，不仅可以诱导GRP78/BiP和CHOP的表达，这与之前的报道一致[4]，而且还剌激磷酸化的eIF2a和ATF4的表达增

关键词：漆树酸内质网应激 ATF4 调亡