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基于滚环转录方法构建的RNA自组装纳米结构的siRNA递送研究

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基于滚环转录方法构建的RNA自组装纳米结构的siRNA递送研究

作者：赵晓然齐鲁工业大学

学位级别：硕士

RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应。siRNA(small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中。目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送。... 详细信息

RNA干扰(RNA interference,RNAi)作为转录后调节机制,可靶向mRNA进行剪切降解从而发挥基因沉默效应。siRNA(small interference RNA)因其高效性和特异性而被广泛应用于药物研究中。目前,研究者们已开发了多种阳离子载体用于siRNA递送。但由于siRNA双链结构具有相对较强的刚性结构,且阴离子电荷密度较低,无法与阳离子载体形成稳定、致密的复合物,使得siRNA的应用仍面临诸多挑战,如细胞摄取率低、靶向特异性差、递送过程不稳定、潜在的细胞毒性以及易诱发免疫反应等。近年来,核酸自组装纳米结构由于其结构灵活且负电荷密度较高而受到广泛关注,有望实现siRNA药物的高效递送和基因沉默。本文致力于开发一种新的转录模板来构建核酸自组装纳米微球,并对纳米微球的结构特征、细胞摄取以及基因调控功能进行研究。(1)本研究设计并合成了哑铃型环状DNA模板,利用滚环转录(rolling circle transcription,RCT)技术,合成poly-RNA。通过碱基互补配对,poly-RNA进一步自组装,并与转录过程中形成的焦磷酸镁晶体结合,形成海绵状RNA纳米微球(RNA nanoparticles,RNP)。琼脂糖凝胶电泳分析实验初步验证了poly-RNA的形成。(2)本研究对纳米微球的组成、粒径、表面电势、结构及稳定性等进行了一系列表征。纳米微球呈海绵微孔球状结构。粒子大小与转录过程中的Mg浓度有关,Mg浓度由6 mM提高至15 mM时,纳米微球的粒径由2μm.5μm降至1μm左右。根据Zeta电位测量结果,纳米微球的表面电势为-1214 mV。血清稳定性实验表明相比天然的siRNA,纳米微球具有更好的稳定性。随着时间的延长,对照组siRNA在6小时内降解到20%左右,24小时内几乎降解完全,而RNP降解速度相对于siRNA更慢,24小时后仍有40%未被降解。(3)siRNA的细胞摄取与溶酶体逃逸过程是其发挥有效的基因沉默调控的关键过程。因此,本课题研究了HepG2细胞对纳米微球的摄取过程,以及纳米微球进入细胞后的溶酶体逃逸过程。相比天然的siRNA,纳米微球的细胞摄取效率更高,且在转染12小时后能够从溶酶体中逃逸出来。最后我们证实了纳米微球实现了对绿色荧光蛋白基因的表达沉默调控。

关键词：滚环转录核酸自组装纳米微球小干扰RNA递送基因沉默

基于变构转录因子的重金属纸基芯片检测技术研究

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基于变构转录因子的重金属纸基芯片检测技术研究

作者：张永康军事科学院

学位级别：硕士

目的目前,随着工农业的快速发展,我国重金属的污染状况日益严峻。重金属污染与其他有机化合物的污染不同,它不能够在环境中降解,并且具有富集性,可以通过食物链在人体内发生蓄积,对人民群众的健康安全造成了严重的威胁。广泛存在于原核... 详细信息

目的目前,随着工农业的快速发展,我国重金属的污染状况日益严峻。重金属污染与其他有机化合物的污染不同,它不能够在环境中降解,并且具有富集性,可以通过食物链在人体内发生蓄积,对人民群众的健康安全造成了严重的威胁。广泛存在于原核生物体内负责调控小分子代谢的变构转录因子(Allosteric transcription factors,a TFs)作为新型的分子识别元件被用于生物传感器的构建。基于变构转录因子的无细胞生物传感器具有制备简单、反应快速、特异性强的优点,以变构转录因子为识别元件开发设计新的传感技术来检测水中重金属离子具有一定的实用价值。此外,纸基材料作为无细胞生物传感器的载体具有成本低、便于储存、易于携带的优势,便于现场检测的开展。本研究以水中常见的有毒重金属汞、铅、镉、砷作为研究对象,以变构转录因子为识别元件,依据变构转录因子与双链DNA的相互作用特点,结合无细胞体外转录(in vitro transcription,IVT)体系,构建了重金属无细胞合成检测技术,并且通过滚环转录(Rolling circle transcription,RCT)信号放大技术,进一步提高对于重金属检测的灵敏度。此外,设计开发包含有多个反应室的纸基芯片,以实现在现场条件下对于多种重金属离子的同时检测。本论文的主要研究内容如下:方法1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究。基于变构转录因子为分子识别元件结合表达荧光RNA的无细胞体外转录体系,设计了一种新的针对水中重金属离子的检测技术。首先构建以包含T7启动子、变构转录因子结合位点、3WJd B表达基因和T7终止子的双链DNA为反应模板的无细胞体外转录体系;而后运用表面等离子体共振实验(Surface plasmon resonance,SPR)和凝胶迁移实验(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)对变构转录因子进行筛选和表征;接下来向无细胞体外转录体系中加入适当浓度的变构转录因子构建无细胞合成检测技术体系;随后设计DNA逻辑电路消除信号串扰;最后通过对实际水样的检测以验证该方法的实用性。方法2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究。运用RCT的信号放大手段设计了基于变构转录因子用于水中重金属离子的超灵敏检测方法。首先设计制备了包含局部双链的单链环状DNA模板以同时满足变构转录因子的结合和RCT反应进行的需求;而后通过EMSA实验和荧光测量表征该方法检测原理的可行性;接下来进行正交实验以优化检测体系内变构转录因子的含量;最后设计DNA逻辑电路消除信号串扰。方法3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究。运用设计的微流控芯片搭载冻干的纸基生物传感器实现在现场条件下对于4种重金属的同时检测。首先通过改变变构转录因子的添加量来调整无细胞合成检测技术的检测限;随后对纸基材料及其孔径进行筛选;接下来将无细胞合成检测技术体系通过冷冻干燥的方法固定到纸基材料上构成纸基生物传感器;最后将检测不同重金属离子的检测体系放置到设计的微流控芯片上建成纸基芯片。结果1.基于变构转录因子的重金属无细胞合成检测技术研究:在最佳条件下,通过肉眼对于荧光结果的判读即可实现对0.5 nmol/L Hg、0.1 nmol/L Pb、10 nmol/L Cd及1 nmol/L As的检出。通过DNA逻辑电路的引入成功解决了Cd检测体系中Pb的信号串扰问题。重金属离子在河水中的加标回收率为91.09-123.24%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)不大于6.71%,表明该传感技术在实际应用中的潜力。结果2.基于变构转录因子的重金属RCT超灵敏检测技术研究:在最佳检测条件下,该检测方法产生的荧光值与重金属离子浓度的对数存在良好的线性关系,其线性方程分别为Hg:Y=217.5*X+534.6(R=09918),Pb:Y=161.5*X+617.7(R=09856),Cd:Y=183.8*X+463.6(R=09908),As:Y=177.3*X+549.3(R=09821),其中Y为荧光值,X为重金属离子的浓度对数,其检测限分别为0.034、0.006、0.135和0.016 nmol/L(3σ/S),与之前构建的无细胞合成检测技术相比,检测限要低2-3个数量级。结果3.水中重金属现场快速多重检测纸基芯片的研究:确定了以孔径为0.2μm的醋酸纤维素膜为纸基材料,将Hg、Pb、Cd、As的检测限根据我国生活饮用水卫生标准分别调整为5 nmol/L、48 nmol/L、45 nmol/L及128 nmol/L,在现场检测的条件下实现了4种重金属离子的定性检测。结论本研究以变构转录因子为分子识别元件,分别与无细胞体外转录体系和RC

关键词：变构转录因子重金属荧光RNA 滚环转录纸基生物传感器

基于转录因子调控和级联信号放大的小分子生物传感新方法研究

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基于转录因子调控和级联信号放大的小分子生物传感新方法研究

作者：王如佳湖南大学

学位级别：硕士

近年来,小分子污染物所造成的环境问题日益凸显,因此亟需开发出新的环境分析监测方法,以满足对环境污染治理的需求。基于生物传感的小分子检测方法具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点,在环境污染物检测应用中发挥了重要的作用。... 详细信息

近年来,小分子污染物所造成的环境问题日益凸显,因此亟需开发出新的环境分析监测方法,以满足对环境污染治理的需求。基于生物传感的小分子检测方法具有快速、简便、灵敏度高、特异性强等优点,在环境污染物检测应用中发挥了重要的作用。然而,为了实现更高的检测灵敏度和满足更广泛的小分子检测范围需求,仍然需要结合更加强大的信号识别元件和信号放大策略,开发出高效的小分子生物传感分析方法。转录因子通过与配体小分子结合发生构象变化,进而改变与操纵子序列的结合亲和力,来实现转录调控功能。转录因子在自然界中的种类丰富,具有广泛的小分子识别范围,并作为小分子的信号识别元件广泛应用于生物传感领域。在信号放大策略中,基于T7 RNA聚合酶的滚环转录能够围绕特殊的环状模板循环扩增,转录出数千个碱基长度的RNA长链,具有强大的核酸放大功能;CRISPR-Cas12a系统是由RNA引导的DNA核酸内切酶,在目标DNA的作用下激活特异性切割活性和高效的非特异性切割活性,已发展成为一种强大的信号放大工具,应用于高灵敏度的分子诊断中。在本文中,我们利用转录因子别构转录调控的性质,结合滚环转录和CRISPR-Cas12a系统的信号放大功能,开发出了基于转录因子调控和信号放大的小分子生物传感分析新方法,并证实了该方法能够实现对于四环素的高灵敏度和特异性检测。本文主要包括如下内容:(1)基于转录因子TetR与滚环转录信号放大的小分子检测方法。该方法利用转录因子TetR对四环素分子的特异性识别以及别构调控的性质,对滚环转录过程进行调控。并利用滚环转录的核酸放大功能实现对四环素分子响应信号的放大,以达到对四环素分子的高灵敏度和特异性检测目的。我们设计了T7p-tetO-Pepper环状模板,并探究了转录因子TetR与环状模板的结合效率以及对滚环转录的抑制效率。同时验证了该方法能够以较高的灵敏度和特异性响应四环素,解除对滚环转录的抑制扩增出大量具有优良荧光性能的荧光RNA适配体Pepper序列。最终以放大的荧光信号作为信号输出,实现对四环素分子的定性与定量检测。对四环素分子的检测限为46 nM,检测线性范围大约在0.08-0.6μM之间。(2)基于转录因子TetR和级联信号放大的小分子检测方法。该方法利用转录因子TetR对四环素分子的特异性识别以及对滚环转录过程的调控功能,并结合滚环转录的核酸放大功能和CRISPR-Cas12a系统的信号放大功能,实现响应四环素分子的级联信号放大,从而达到更高的四环素分子检测灵敏度。我们设计了T7p-tetO-crRNA环状模板,并探究了转录因子TetR与环状模板的结合效率,对比了在一步法和两步法中转录因子TetR对荧光信号的抑制效率。最后我们验证了该方法能够以更高的灵敏度响应四环素,在四环素分子的作用下解除对滚环转录的抑制,扩增产生大量crRNA序列实现第一重信号放大,并进一步激活CRISPR-Cas12a系统的反式切割活性实现第二重信号放大。最终以双重放大后的荧光信号作为输出,对四环素分子的检测限达到4.7 nM,检测的线性范围大约在0.02-0.6μM之间。为小分子的生物传感分析方法提供了新思路。

关键词：小分子检测生物传感转录因子滚环转录 CRISPR-Cas12a 信号放大

分层自解密CRISPR-Cas13a定制的RNA纳米茧用于空间可控基因编辑和精准癌症治疗

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分层自解密CRISPR-Cas13a定制的RNA纳米茧用于空间可控基因编辑和...

作者：凡宁可重庆医科大学

学位级别：硕士

CRISPR-Cas13a是一种强大的RNA引导的沉默平台,被认为是RNA干扰的革命性替代方案;然而,在将其靶向且有效地递送至病变部位的设计中仍然存在巨大障碍。在这项研究中,一种多功能的Cas13a定制的RNA纳米茧（RNCOs-D）载体具有自解密层次结构... 详细信息

CRISPR-Cas13a是一种强大的RNA引导的沉默平台,被认为是RNA干扰的革命性替代方案;然而,在将其靶向且有效地递送至病变部位的设计中仍然存在巨大障碍。在这项研究中,一种多功能的Cas13a定制的RNA纳米茧（RNCOs-D）载体具有自解密层次结构,用于高效可控的货物释放和精准的协同基因治疗/化疗。该载体由外层纳米胶囊（NCs）和内层RNA纳米海绵（RNSs）组成,通过基于隐藏/解锁的Cas13a/cr RNA核糖核蛋白（RNP）和化学治疗药物的封闭/去封闭机制运行。在体外和体内成功沉默胶质母细胞癌的EGFR变体III（EGFRv III）m RNA,而且实现了协同治疗胶质母细胞瘤（GBM）。滚环转录（RCT）自组装形成的RNA纳米海绵作为RNCOs-D的支架,由多价串联EGFR适配体（Apt）、胆固醇和Cas13a反式切割底物组成,有助于它们有效地传递到胶质母细胞瘤中。肿瘤内酸性内/溶酶体微环境刺激外层纳米胶囊的部分裂解并伴随Cas13a/cr RNA释放,而内部分解由单位点顺式识别和切割EGFRv III m RNA而引发的RNA纳米海绵的多位点反式切割发生。RNA纳米海绵的工程化以及对Cas13a RNA酶功能的充分利用,为开发用于治疗平台的货物定制交付提供了深入的见解,并在多模式和协同癌症治疗方面具有巨大的前景。

关键词： Cas13a/crRNA RNA纳米茧滚环转录协同治疗

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酶法合成RNA的相关技术研究进展

生物技术通报 2016年第3期32卷 44-51页

作者：王静潘孝明刘宇梁兴国中国海洋大学食品科学与工程学院青岛266003

近些年来RNA相关研究发展迅速,从质和量两方面对RNA合成技术提出了更高的要求。RNA合成方法包括化学合成和酶法合成两种。目前已商业化的RNA化学合成法能够实现长度小于90个碱基的RNA合成,但合成费用相对较高,使许多研究难以展开。相对... 详细信息

近些年来RNA相关研究发展迅速,从质和量两方面对RNA合成技术提出了更高的要求。RNA合成方法包括化学合成和酶法合成两种。目前已商业化的RNA化学合成法能够实现长度小于90个碱基的RNA合成,但合成费用相对较高,使许多研究难以展开。相对于化学合成,酶法合成具有效率高、条件温和的特性,能够合成长序列,是一种高效、低耗的RNA合成方案。酶法合成的技术流程包括转录和加工两步,其中转录的模型主要分为线性转录和滚环转录两种,不同的模型产生的初始转录产物特性不同,需要采用相应的加工方式对其进行处理才能获得准确的目的 RNA产物。近年来研究者们不断地研究探索RNA的酶法合成,发现并构建了多种转录模型和初始转录物的加工方案,将从酶法合成RNA的转录模型和加工技术的原理、特点和问题等方面进行概述,以期为后续酶法合成RNA的进一步研究和选择性应用提供参考。

关键词： RNA 酶法合成线性转录滚环转录特异位点剪切

基于表面增强拉曼光谱法的新型高灵敏度核酸传感器

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基于表面增强拉曼光谱法的新型高灵敏度核酸传感器

作者：郑福卫青岛科技大学

学位级别：硕士

本文构建了几种新型的核酸放大策略,并与高灵敏度的表面增强拉曼散射分析方法结合,构建了三种新型的SERS放大检测方法：基于DNA滚环聚合和滚环转录的循环放大方法、基于DNA自组装引发的非线性杂交的SERS放大方法、基于熵驱动引发的转录... 详细信息

本文构建了几种新型的核酸放大策略,并与高灵敏度的表面增强拉曼散射分析方法结合,构建了三种新型的SERS放大检测方法：基于DNA滚环聚合和滚环转录的循环放大方法、基于DNA自组装引发的非线性杂交的SERS放大方法、基于熵驱动引发的转录和非线性树枝状杂交联合的DNA循环放大方法,实现了对miRNA的高灵敏度、高选择性检测。主要内容包括以下几个方面：1、构建滚环聚合和滚环转录联用的复合核酸反应放大机制,表面增强拉曼的方法检测miRNA,实现了miRNA的高灵敏度、高选择性、快速检测。滚环聚合和滚环转录各提供一个层次的放大,设计了一个单链环状DNA结构作为探针,该探针包括以下功能片段：“引发位点”：特异性识别目标miRNA;"引物结合位点”：动态的与引物互补的片段,在初始阶段是被“锁住”的,与“识别位点”互补配对;“识别位点”：后面序列的打开会引起前面序列的打开;“孔雀石绿适体模板”：与孔雀石绿的RNA适体互补的DNA片段;“剪切位点”：切克内切酶剪切序列的单链,与其互补的序列结合后,形成功能化的双链剪切位点;“启动位点”：功能化双链T7启动子的单链。靶标miRNA由“引发位点”特异性识别,并利用环形单链探针的各功能片段,引发滚环聚合阶段、中间阶段、滚环转录阶段一系列放大反应依次发生,产生实现了靶miRNA的循环利用和滚环聚合和滚环转录的联合放大,检测限可达10-16M。中间阶段被证明是产生低检测限所必需的。该方法具备区分靶标miRNA序列以及序列相近的其他miRNA序列的选择性,并可用于检测不同的肿瘤细胞或其他的肿瘤标志物。2、将基于核酸引发的非线性的杂交链式反应的放大策略与表面增强拉曼检测方法联用,以Trigger DNA引发,使预先制备的两种双链结构DNA组装单元连续自发地组装成带有罗丹明信号的树枝状结构,再通过金纳米粒子的增强,实现了对罗丹明的拉曼散射信号的放大。本方法的原料仅为DNA和杂交缓冲液,无需任何酶的参与,相比于滚环聚合和滚环转录联合SERS信号放大系统,其反应操作更加简单、快捷,且其本身具有较高的灵敏度。3、本章在第3章开发的新型树枝状杂交放大表面增强拉曼产生信号的检测方法的基础上,进一步结合基于熵驱动的靶循环放大方法,构建了复合放大检测体系。该方法利用miRNA引发制备好的探针的熵驱动的杂交,再通过聚合产生RNA转录的DNA模板链,结合RNA聚合酶、NTPs及其缓冲液,产生引发树枝状杂交的引发链,引发罗丹明修饰的DNA的链的自发杂交组装,再通过杂交附着纳米金颗粒,来实现罗丹明的拉曼信号的放大,力图实现靶miRNA信号的高灵敏度、高选择性检测。

关键词： miRNA 滚环聚合滚环转录非线性树枝状杂交表面增强拉曼散射肿瘤标志物