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中国寄生虫学与寄生虫病杂志 2019年第5期37卷 563-567页

作者：李润花关丽殷国荣太原师范学院生物系晋中030619 临汾市第四人民医院微生物科临汾041000 山西医科大学医学寄生虫学研究所太原030001

目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物... 详细信息

目的克隆、原核表达刚地弓形虫滑行相关蛋白45(TgGAP45)基因,检测重组蛋白rTgGAP45的免疫反应性。方法提取刚地弓形虫RH株速殖子总RNA,逆转录合成cDNA。根据TgGAP45基因全长编码序列的开放阅读框设计引物,PCR扩增TgGAP45基因。扩增产物经双酶切后连接入pET30a(+)载体,重组质粒转化至大肠埃希菌(***)DH5α,阳性菌落经PCR、双酶切和测序鉴定。将重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45转化至*** BL21(DE3)感受态细胞,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)结合考马斯亮蓝染色检测表达产物,分别以抗His标签抗体、人抗弓形虫血清或小鼠抗弓形虫可溶性速殖子抗原(STAg)血清为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)鉴定重组蛋白免疫反应性。结果刚地弓形虫GAP45基因的cDNA开放式阅读框全长为738 bp,PCR扩增结果显示,在750 bp处有一条特异性扩增条带(带His标签),与预期大小相符。菌落PCR、双酶切以及测序结果均表明重组质粒pET-30a(+)-TgGAP45构建成功。SDS-PAGE结果表明,经IPTG诱导获得相对分子质量(Mr)约35000的可溶性重组蛋白。Western blotting分析结果显示,诱导表达的蛋白为带His标签的重组蛋白,可分别被His标签抗体、人抗弓形虫血清和小鼠抗弓形虫STAg血清识别。结论刚地弓形虫RH株TgGAP45基因片段可在原核表达系统中高效可溶性表达,该重组蛋白rTgGAP45具有免疫反应性。

关键词：刚地弓形虫滑行相关蛋白45 基因克隆原核表达免疫反应性

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刚地弓形虫滑行相关蛋白45基因的生物信息学分析、克隆表达及重组...

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作者：关丽山西医科大学

学位级别：硕士

目的生物信息学分析刚地弓形虫滑行相关蛋白45（TgGAP45）的基因及蛋白质序列。克隆、表达TgGAP45基因，纯化rTgGAP45并且分析可能具备的抗原性质。观察不同剂量rTgGAP45不同途径免疫小鼠诱导的免疫应答及抵抗弓形虫慢性和致死性感染... 详细信息

目的生物信息学分析刚地弓形虫滑行相关蛋白45（TgGAP45）的基因及蛋白质序列。克隆、表达TgGAP45基因，纯化rTgGAP45并且分析可能具备的抗原性质。观察不同剂量rTgGAP45不同途径免疫小鼠诱导的免疫应答及抵抗弓形虫慢性和致死性感染的能力，为弓形虫疫苗提供理论依据。方法第1部分：对刚地弓形虫TgGAP45的基因序列和蛋白质序列进行生物信息分析，使用生物信息学在线分析流程，如ProtParam、WoLFPSORT、PSORTⅡ等，预测其理化性质、跨膜区、空间结构以及潜在的抗原表位等。第2部分：根据TgGAP45基因开放阅读框（GenBank:AF453384.1）设计引物，并引入EcoRI和XhoI酶切位点，以RH株刚地弓形虫速殖子反转录的cDNA为模板，PCR扩增编码TgGAP45）的基因片段，扩增产物经双酶切后，连接到原核表达质粒pET30a(+)中，重组质粒被转入大肠埃希菌（***）DH5α中，用菌液PCR、双酶切和基因测序判定阳性克隆;阳性重组质粒pET30a(+)-TgGAP45转染***21（DE3），IPTG诱导表达重组蛋白，SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色法检测表达产物。用Ni-NTA层析法纯化rTgGAP45，免疫印迹法鉴定重组蛋白的免疫原性。第3部分：40只雌性BALB/c小鼠被随机分成4组，分别为30μg蛋白滴鼻免疫组、30μg蛋白皮下注射组、60μg蛋白皮下注射组、20μlPBS滴鼻组，其中滴鼻组和皮下注射组的rTgGAP45分别溶于总体积为20μl和100μl的PBS中。第0、14和21d各滴鼻免疫1次。末次免疫后14d，眼后静脉丛采血，收集血清。无菌取脾并制备单细胞悬液，分别用rTgGAP45、ConA刺激脾淋巴细胞，CCK-8法测定淋巴细胞的增殖指数，收集小肠、鼻咽、阴道冲洗液，并刮取肠黏膜。ELISA测定血清IgG和IgA、3种清洗液中sIgA和脾淋巴细胞培育上清和肠黏膜细胞中IL-2、IL-4、IL-5、IFN-γ水平。第4部分：64只雌性BALB/c小鼠随机分为4组，分别为30μgrTgGAP45（溶于20μlPBS）滴鼻组、30μg或60μgrTgGAP45（溶于100μlPBS）皮下注射组，对照组20μlPBS滴鼻，于第0、14和21d各免疫1次。末次免疫后14d，分别用1×104速殖子（慢性感染，每组6只）或4×104速殖子（致死性感染，每组10只）灌胃攻击每只小鼠。攻击后30d，处死慢性感染实验组小鼠，分离出肝和脑组织，并计数组织内的速殖子数。攻击后观测和记录致死性感染实验组的小鼠健康状况，计算小鼠的30d存活率。结果 TgGAP45基因编码蛋白由245个氨基酸组成，分子式C1122H1860N362O409S11，分子质量27317.9，等电点理论值为5.05，半衰期为30h，不稳定系数为54.3，溶液中性质不稳定。亚细胞定位于细胞内膜中，有4个潜在的抗原表位。PCR扩增产物的大小738bp，菌液PCR、双酶切和基因测序结果表明重组质粒pET30a(+)-TgGAP45的载体构建成功。SDS-PAGE结果表明，目的基因TgGAP45在表达菌***21中高效表达，相对分子量（Mr）约35kDa，为可溶性蛋白。免疫印迹（WB）结果表示，该重组蛋白能被抗HIS标签抗体、人抗弓形虫免疫血清所识别。速殖子抗原能被抗重组滑行相关蛋白45所识别。 30μg滴鼻组、30μg和60μg皮下组血清IgG和IgA明显高于对照组且差异有统计学意义，其中30μg滴鼻组显著高于30μg皮下组（P45增殖指数显著高于对照组（P<0.01和P<0.05）。3个免疫组肠冲洗液、鼻咽冲洗液IgA水平与对照组差异有统计学意义，其中30μg滴鼻组肠冲洗液和鼻咽冲洗液IgA水平均显著高于30μg和60μg皮下组（P<0.01和P<0.01）;30μg滴鼻组和60μg皮下组阴道冲洗液IgA水平显著高于对照组（P<0.01和P<0.01）。3个免疫组脾淋巴细胞上清IL-2、IFN-γ水平高于对照组,且差异有统计学意义，30μg滴鼻组和60μg皮下组脾淋巴细胞上清IL-5、IL-4水平高于对照组(P<0.01和P<0.05;P<0.01和P<0.01)。30μg滴鼻组和60μg皮下组空肠、回肠、十二指肠黏膜细胞上清中IL-2、IFN-γ水平与对照组比较差异有统计学意义,其中30μg皮下组回肠黏膜细胞上清中IL-2水平与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05和P<0.05)。 30μg滴鼻组和30μg、60μg皮下组(慢性感染)肝和脑虫荷均显著低于对照组(均为P<0.01),减虫率分别为(49.

关键词：刚地弓形虫生物信息学基因克隆滑行相关蛋白45 免疫保护

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