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南方医科大学学报 2015年第6期35卷 801-806,811页

作者：范超傅鸣宇肖中举唐杰南方医科大学基础医学院生理学教研室广东广州510515

目的构建能在HEK-293细胞膜上表达的溶质转运体26a家族(SLC26a)的蛋白质粒,并对其生理功能进行检测。方法构建多种人类SLC26a转运体-绿色荧光蛋白的融合质粒,并使用瞬时转染技术将其表达在人胚肾293细胞(HEK-293)中。用全细胞膜片钳技... 详细信息

目的构建能在HEK-293细胞膜上表达的溶质转运体26a家族(SLC26a)的蛋白质粒,并对其生理功能进行检测。方法构建多种人类SLC26a转运体-绿色荧光蛋白的融合质粒,并使用瞬时转染技术将其表达在人胚肾293细胞(HEK-293)中。用全细胞膜片钳技术记录表达有SLC26a蛋白的HEK-293细胞的膜电容。结果每个SLC26a转运体均能在HEK-293细胞的细胞膜上表达,并表现出和离子相互作用的生理功能。SLC26a转运体与离子结合的数目与其在细胞膜上的表达程度正相关并具有一定的离子选择性。结论 SLC26a转运体家族能够在HEK-293细胞上表达并具有与转运离子结合的生理功能。在HEK-293细胞系中表达SLC26a转运体家族的研究方法,为进一步研究此家族成员转运功能及其转运机制提供了可能。

关键词：人胚肾293细胞溶质转运体26a家族全细胞膜片钳非线性膜电容

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SLC26a家族的电压依赖性

SLC26A家族的电压依赖性

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作者：范超南方医科大学

学位级别：硕士

哺乳动物的听觉具有高度的灵敏度和精确性,这是因为它内耳的耳蜗具有放大功能,而驱动耳蜗放大的基础就是外毛细胞的电致运动。哺乳动物的外毛细胞可以在电刺激下改变其自身的长度此即为电致运动。电致运动的分子马达是外毛细胞的膜组成... 详细信息

哺乳动物的听觉具有高度的灵敏度和精确性,这是因为它内耳的耳蜗具有放大功能,而驱动耳蜗放大的基础就是外毛细胞的电致运动。哺乳动物的外毛细胞可以在电刺激下改变其自身的长度此即为电致运动。电致运动的分子马达是外毛细胞的膜组成蛋白prestin。当电压改变时,外毛细胞胞内的氯离子受电压驱动而进出prestin蛋白,导致prestin发生构象变化,最终使得外毛细胞出现伸缩运动。与电致运动相联系的电记号是电压依赖性的膜电容也称为非线性膜电容（Nonlinear capacitance, NLC）。根据核苷酸序列分析可以将prestin归为溶质转运体26a家族（SLC26a）, prestin是其第五个成员。现已发现SLC26a家族有11个成员（A1-A11）,它们分布在不同组织的上皮细胞上且均为膜蛋白。它们的结构非常相似包括：胞质内的N-端、C-端以及结构未知的跨膜区域。结构的相似性也预示着它们的功能可能非常相似。在哺乳动物中,SLC26a家族成员的功能分为两类,一类是转运阴离子的功能,一类是prestin （A5）所特有的运动功能。而在非哺乳类脊椎动物中prestin （A5）与其它成员类似只具有转运功能。因此,我们推测prestin（A5）的运动功能可能是进化而来的。另外,哺乳动物prestin （A5）运动功能的产生与其电压依赖性密切相关,它是先感受膜电位的变化再产生运动的,也就是说电压依赖性是其产生运动功能的基础。那么,prestin （A5）的电压依赖性是其特有的还是整个SLC26a家族所共有的呢?为了解决这一问题,我们需要研究SLC26a家族其它成员的电压依赖性。我们用已知的SLC26a家族成员的蛋白序列做了一个无根的系统进化树并从系统进化树的每个分支中选择一个成员（A2, A4, A6, A7, A9, A11）作为研究对象。本实验选取人胚肾293细胞（HEK-293）转染所选取的SLC26a家族基因的,使其表达后,用全细胞膜片钳技术记录其膜电容,以了解SLC26a家族的电压依赖性。实验的第一步是构建并提取目的质粒。我们首先将目的基因与绿色荧光蛋白载体连接,然后通过质粒转化和质粒提取步骤获得目的质粒。第二步是将目的质粒用Lipofectamine2000转染进HEK-293细胞中。转染成功的HEK-293细胞其细胞膜会发出绿色荧光。第三步是采用单细胞膜片钳全细胞记录技术,给予转染成功的HEK-293细胞两个正弦波电压刺激（峰值为10mV,频率为390.6和781.2赫兹）,记录其膜电容,然后分析比较各成员的膜电容,以了解其电压依赖性。同时,我们通过改变细胞内外液的离子成分,来了解膜电容的变化与离子的关系。我们将A5（prestin）作为阳性对照而把只转染有绿色荧光蛋白的HEK-293细胞作为阴性对照。实验中在细胞内外液均含C1-的情况下记录到的细胞数如下：A2为13个,A4为8个,A5（prestin）为9个,A6为15个,A7为11个,A9为10个,A11为8个。在分别表达有A2,A4,A6,A7,A9或A11的HEK-293细胞上均记录到非线性膜电容（NLC）,即本实验所选取的SLC26a家族成员都有电压依赖性。对NLC用Boltzmann方程拟合并将所得到的参数进行比较后发现：标准化的NLC （NLC/Clin）最大的是A5（prestin）,为7.80±3.27（mean±SD）;最小的是A2,为1.65±0.70;与A5（prestin）最接近的是A6,为6.94±2.30。而标准化的最大电荷移动（Qmax/Clin）,峰值电压（W1/2）以及z值（曲线斜率）与A5（prestin）比较接近的也是A6（A5:12.72±4.61fC/pF,-69.79±8.30mV和0.70±0.07;A6:12.02±3.28fC/pF,-41.74±17.12mV和0.55±0.08）。从以上结果可以得出A6与A5（prestin）的电压依赖性最为相似,这与系统进化树所显示的A5（prestin）与A6的亲缘关系最近是相一致的。由于A5（prestin）和A6在电压依赖性方面具有相似性,而A6与其它SLC26a家族成员在功能方面具有相似性,因此A6作为连接A5（prestin）与SLC26a家族的桥梁值得我们重点研究。对于prestin （A5）来说,胞内的C1-是其主要的电压感受性的离子,其NLC是由于胞内C1-在电压驱动下在蛋白内移动而产生的。如果将细胞内液中的C1-用戊烷磺酸钠替换掉其NLC会减少甚至消失。我们用同样的方法处理并记录表达有A6的HEK-293细胞,观察其NLC的变化,发现：用戊烷磺酸钠替换C1-后A6的NLC并没有出现显著的变化。而且从Boltzmann方程拟合得到的参数V

关键词： Prestin 溶质转运体26a家族电压依赖性非线性膜电容

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