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南方农业学报 2023年第9期54卷 2692-2701页

作者：胡聂文唐仪阳冯孟哲周泽军省部共建淡水鱼类发育生物学国家重点实验室/湖南师范大学生命科学学院湖南长沙410081

【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Prot... 详细信息

【目的】克隆湘云鲫2号肠道干细胞标志物LGR6(3nLGR6)并制备多克隆抗体,为从肠道干细胞角度揭示湘云鲫2号的抗病机制提供技术支持。【方法】通过PCR扩增3nLGR6基因开放阅读框(ORF)序列,采用InterProScan、TMHMM Server 2.0、ExPASy Proteomics Server、SignalP 5.0、PSORTⅡPrediction、SoftBerry-Psite、SWISS-MODEL及MEGA 11.0等在线软件进行生物信息学分析;利用原核表达系统表达融合蛋白,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c雌性小鼠制备多克隆抗体,基于免疫组织化学分析3nLGR6在湘云鲫2号肠组织中的分布情况。【结果】3nLGR6基因ORF序列全长2874 bp,共编码957个氨基酸残基;3nLGR6蛋白理论分子量约105.4 kD,理论等电点(p I)为5.44,在其N端有1个亮氨酸重复序列结构域,C端存在1个7次跨膜结构的GPCR结构域,且在18Gly与19Ser间存在信号肽切割位点(Sec信号肽)。3nLGR6与其他硬骨鱼类的LGR6氨基酸序列高度同源,其中与二倍体斑马鱼的相似性为92.28%。与鱼类LGR6作用密切的基因有LGR4、RNF43、RSPO2、CTNNB1、APC和CTNNA1,主要涉及Wnt信号通路和Adherens junction信号通路。以纯化得到的融合蛋白3nLGR6免疫BALB/c雌性小鼠,能成功制备出小鼠抗3nLGR6多克隆抗体,且免疫组化试验结果显示该抗体可特异性识别湘云鲫2号肠道组织中的3nLGR6。【结论】3nLGR6与其他物种的LGR6氨基酸序列高度同源,其结构和功能相对较保守。制备获得的小鼠抗3nLGR6多克隆抗体能特异性识别湘云鲫2号肠道内源性3nLGR6,为后续深入研究LGR6在硬骨鱼组织中的表达情况及揭示LGR6在肠道黏膜稳态中的作用机制提供了技术支撑。

关键词：湘云鲫2号异源三倍体鱼肠道干细胞 LGR6 原核表达多克隆抗体

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不同倍性鲫鲤gnih/gnihr3基因克隆及表达研究

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作者：袁柳娇湖南师范大学

学位级别：硕士

红鲫(Carassius auratus red var.)(2n=100,♀)与鲤鱼(Cyprinus carpio L.)(2n=100,♂)通过远缘杂交和遗传选育获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤(4n=200,简称为4nAT)。以雄性改良4nAT为父本,二倍体红鲫为母本,通过染色体倍性操作技术获... 详细信息

红鲫(Carassius auratus red var.)(2n=100,♀)与鲤鱼(Cyprinus carpio L.)(2n=100,♂)通过远缘杂交和遗传选育获得了两性可育的异源四倍体鲫鲤(4n=200,简称为4nAT)。以雄性改良4nAT为父本,二倍体红鲫为母本,通过染色体倍性操作技术获得了异源三倍体鲫(湘云鲫2号)。不育的湘云鲫2号为研究鱼类性腺发育调控提供了很好的实验材料。促性腺激素抑制激素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)已经在鸟类、哺乳类动物中被证实为一种负调控生殖轴的下丘脑神经肽,GnIH与其受体(gonadotropin-inhibitory hormone receptor,GnIHR)结合,共同抑制促性腺激素(gonadotropin hormone,GTH)的合成;目前关于Gn IH/GnIHR系统的表达及作用机制在鱼类中的研究较少。本文以可育二倍体红鲫和不育三倍体湘云鲫2号为研究对象,对gnih和gnihr3基因进行了分子克隆,并采用实时荧光定量PCR方法(qPCR)及组织原位杂交技术,对gnih和gnihr3在红鲫及湘云鲫2号中的表达差异进行了研究,为鱼类生殖生理学研究及繁殖育种提供理论依据。主要研究结果如下:1.红鲫和湘云鲫2号gnih/gnihr3基因克隆及序列分析本研究获得的红鲫和湘云鲫2号gnih基因的cDNA全长均为765bp,其中5’非编码区(untranslated region,UTR)为27bp,3’UTR为144bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)为594bp,编码197个氨基酸。获得的红鲫gnihr3基因的cDNA全长为1678bp,其中5’UTR为130bp,3’UTR为186bp,ORF为1362bp,编码453个氨基酸;获得的湘云鲫2号gnihr3基因的全长为1670bp,其中5’UTR为130bp,3’UTR为178bp,ORF为1362bp,编码453个氨基酸。红鲫和湘云鲫2号GnIH的氨基酸序列均含有Gn IH肽典型的LPXRF(X=L or Q)标志,GnIHR3为含有7个跨膜区的G蛋白偶联受体。氨基酸序列多重比对及进化树分析结果显示,红鲫和湘云鲫2号Gn IH/GnIHR3蛋白与其它鱼类Gn IH/GnIHR3蛋白同源性很高,进化关系较亲密;与鸟类及哺乳类GnIH/Gn IHR3蛋白进化距离较远。***/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的组织差异表达研究利用qPCR技术对两种鱼(♀、♂)共32个组织样本中gnih/gnihr3基因mRNA表达水平进行了检测,结果表明:(1)gnih基因在两种鱼的下丘脑中表达最高,在雌雄红鲫下丘脑中的表达没有显著差异;而gnih基因在湘云鲫2号雌鱼下丘脑中的表达水平显著高于雄鱼。(2)gnihr3基因在雌雄红鲫的下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)都有明显表达,特别是在精巢中表达非常高;而gnihr3基因在雌雄湘云鲫2号的性腺中高表达。由此可见,gnih主要存在于下丘脑,与广泛分布在HPG轴的受体结合,通过多条途径起作用。***/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的生殖轴差异表达研究利用qPCR技术对gnih/gnihr3基因在雌性二倍体红鲫和三倍体湘云鲫2号生殖轴表达进行了比较研究,研究结果表明:(1)gnih基因在红鲫下丘脑中的表达水平高于湘云鲫2号,但在两种鱼的卵巢和垂体中的表达水平较低,且无显著差异;(2)gnihr3基因在红鲫下丘脑和垂体中的表达水平高于湘云鲫2号,相反,gnihr3基因在红鲫卵巢中的表达水平低于湘云鲫2号。已有研究表明,gnrh2在非繁殖期湘云鲫脑中的表达水平比红鲫高,这可能与这一时期异源三倍体鲫gnih及其受体表达水平较低有关。***/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的组织定位利用组织原位杂交技术,研究了gnih/gnihr3基因在红鲫和湘云鲫2号的脑和垂体中的定位情况。gnih基因在红鲫和湘云鲫2号脑中主要分布在Dc、Dld、Dd、Npp、Npo、NLT区,且ghih在湘云鲫2号的杂交信号比红鲫弱;gnihr3基因主要在红鲫和湘云鲫2号垂体的PPD、RPD区,NH和PI区杂交信号较弱,且gnihr3基因在湘云鲫2号杂交信号比红鲫弱得多。

关键词： gnih gnihr3 湘云鲫2号生殖轴

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不同倍性鱼骨骼肌肌纤维的比较研究

不同倍性鱼骨骼肌肌纤维的比较研究

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作者：梁向阳湖南师范大学

学位级别：硕士

以改良二倍体红鲫(♀)为母本,改良四倍体鲫鲤(♂)为父本,通过倍间杂交获得了具有显著改良性状的三倍体鲫鱼—湘云鲫2号。湘云鲫2号不仅具有生长速度快、不育等特点,而且还具有含肉率高、脂肪含量低、氨基酸种类丰富等优点。本研究首次... 详细信息

以改良二倍体红鲫(♀)为母本,改良四倍体鲫鲤(♂)为父本,通过倍间杂交获得了具有显著改良性状的三倍体鲫鱼—湘云鲫2号。湘云鲫2号不仅具有生长速度快、不育等特点,而且还具有含肉率高、脂肪含量低、氨基酸种类丰富等优点。本研究首次通过石蜡切片和电镜切片对改良二倍体红鲫、湘云鲫2号和改良四倍体鲫鲤骨骼肌肌纤维的显微和亚显微结构进行了比较研究,并对这三种鱼的肌肉生长抑制素基因(MSTN)进行克隆测序,研究它在不同倍性鱼肌肉组织中的表达差异。本论文获得的主要研究结果如下：1、采用石蜡切片技术对改良二倍体红鲫、湘云鲫2号以及改良四倍体鲫鲤骨骼肌肌纤维的显微结构进行了比较分析。结果表明：3种不同倍性鱼的骨骼肌肌纤维横切面均呈多角形。对同一倍性鱼不同年龄段的骨骼肌肌纤维横切面直径进行比较,发现同一倍性鱼骨骼肌肌纤维横切面直径均随年龄的增加而增大。对同龄的不同倍性鱼骨骼肌肌纤维密度和横切面直径进行比较,发现湘云鲫2号的肌纤维密度小于改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤,改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤之间无明显差异,且湘云鲫2号骨骼肌肌纤维横切面直径显著大于改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤,改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤之间无明显差异,这为湘云鲫2号生长速度快、个体大提供了肌肉方面的细胞生物学依据。此外,不同倍性鱼的骨骼肌肌纤维平均核体积的大小随倍性的增高而增大。2、为了对湘云鲫2号骨骼肌肌纤维横切面直径显著大于同龄的改良四倍体鲫鲤、改良二倍体红鲫的现象进行更深入的研究,我们采用透射电子显微镜对同龄的改良二倍体红鲫、湘云鲫2号以及改良四倍体鲫鲤骨骼肌肌纤维横切面的亚显微结构进行了比较研究。结果发现：3种不同倍性鱼的骨骼肌肌纤维横切面均由两种不同形态的肌原纤维组成,即位于外层的呈带状的肌原纤维和位于中心的呈多角形的肌原纤维。位于肌纤维中心的呈多角形的肌原纤维直径在三种不同倍性鱼中无明显差异,而位于肌纤维外层的呈带状的肌原纤维横切面长径在这三种鱼中存在着显著差异,表现为湘云鲫2号显著大于改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤,而改良二倍体红鲫和改良四倍体鲫鲤之间无明显差异。这与不同倍性鱼骨骼肌肌纤维横切面直径的石蜡切片比较结果一致。3、肌肉生长抑制素基因(MSTN)是一个重要的影响骨骼肌生长发育的负调控因子,具有抑制肌肉生长的作用。对三种不同倍性鱼MSTN进行克隆测序,获得了MSTN基因cDNA部分序列。对比分析发现MSTN基因在这三种不同倍性鱼之间的同源性高达97%,具有高度的保守性。对MSTN基因在不同倍性鱼中的表达进行半定量PCR研究,发现MSTN基因的转录水平在湘云鲫2号中最低。湘云鲫2号含肉率高、脂肪含量低的特点可能与MSTN基因在湘云鲫2号表达量低有关。总之,上述研究结果表明湘云鲫2号的肌原纤维与其父母本的肌原纤维存在明显的差异性,为证明湘云鲫2号的肉质特殊性提供了重要的生物学依据。该研究结果在鱼类遗传育种和生物进化研究方面具有重要意义。

关键词：改良二倍体红鲫湘云鲫2号改良四倍体鲫鲤骨骼肌肌纤维肌原纤维肌肉生长抑制素基因

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多倍体鲫鲤线粒体调控基因的遗传变异比较分析

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作者：赵玉玲湖南师范大学

学位级别：硕士

线粒体不仅是细胞重要的能源工厂,而且参与多种重要的生命代谢活动如细胞凋亡,细胞分化和细胞信息传递等,同时线粒体功能异常会导致整个细胞功能障碍,从而导致机体病变。线粒体虽然是一个半自主的细胞器,自身能进行蛋白编码,然而其主要... 详细信息

线粒体不仅是细胞重要的能源工厂,而且参与多种重要的生命代谢活动如细胞凋亡,细胞分化和细胞信息传递等,同时线粒体功能异常会导致整个细胞功能障碍,从而导致机体病变。线粒体虽然是一个半自主的细胞器,自身能进行蛋白编码,然而其主要还是受到核基因调控及其相互作用。线粒体的复制和转录也是由核基因进行调控的,主要调控基因包括线粒体RNA聚合酶(RNA polymerase,Polrmt)线粒体转录因子 A(MitochondrialTranscription Factors A,tfam),线粒体转录因子 B1(Mitochondrial Transcription Factors B1,tfb1m)或者线粒体转录因子 B2(Mitochondrial Transcription Factors B2,tfb2m)等。因而这些调控基因的变异对线粒体DNA的转录和复制有着直接的关系,从而影响细胞和组织的生命活动。本研究主要对多倍体鲫鲤线粒体调控基因的遗传变异比较分析,以异源四倍体鲫鲤(4nAT,4n=200)、鲤鱼(Cyprinus carpio L,CC,2n=100)、红鲫(Carassius auraius red var,RCC,2n=100)、湘云鲫2号(3nRC,3n=150)为研究对象,来探讨线粒体转录因子tfam,tfb1m和tfb2m在几种不同鲤科鱼中的进化情况,对其部分编码序列进行分析、蛋白结构进行了预测,同时还探讨了几种转录因子在几种不同倍性鱼的肝、肾、脑、精巢、卵巢组织中的表达情况,为后续关于鱼类线粒体调控因子对mtDNA的作用以及mtDNA的进化方面的研究奠定良好的基础。本论文的主要结果如下:1.测得了四种鱼的部分编码序列,对序列采用BioEdit软件分析比对,通过DNASTAR中的Editseq及Protean对各种鱼的tfam蛋白结构进行预,测得出结果:多倍体鱼既遗传了父母本的基因特点同时又发生了遗传变异。2.利用实时荧光定量PCR(QPCR)对几种鱼的不同组织进行线粒体拷贝数检测。发现在三种倍性鱼的卵巢中:伴随着倍性的增加线粒体拷贝数减少,而在精巢和脑中发现:伴随着鱼的倍性的增加线粒体拷贝数增加,在RCC中,卵巢中的mtDNA的拷倍数最多,在4nAT中,精巢的mtDNA拷贝数最高。3nRC和4nAT精巢中的mtDNA的拷贝数都是大于各自卵巢中的,而RCC中精巢的mtDNA拷贝数反而小于卵巢中。在卵巢、精巢、脑中随着倍性的变化成一定趋势,结果说明了 mtDNA的拷贝数可能与鱼类的倍性相关,而3nRC同时还具有组织特异性。3.采用RT-PCR和QPCR技术对tfam、tfb1m、tfb2m三个线粒体转录因子在RCC、4nAT、3nRC三种鱼的几种组织分别进行了表达分析,发现tfam在不同组织中对线粒体拷贝数存在主要的调控作用。在tfb2m的研究中发现tfb2m在肝脑肾中的表达几乎与tfam的表达一致,tfb2m和线粒体拷贝数对于线粒体基因cox3的转录都存在一定的影响。在tfb1m的研究中发现:tfb1m的表达量几乎伴随着倍性的增加而增加,说明了tfb1m在不同倍性组织中表达稳定。总结:每个调控因子都有其侧重点:线粒体拷贝数主要受转录因子tfam的调控,同时还受其他因子调控。tfb2m的主要侧重于调控mtDNA的转录,tfb1m在几种倍性的鱼的各种组织中表达比较稳定。

关键词：线粒体DNA 线粒体转录调控因子异源四倍体鲫鲤湘云鲫2号荧光定量PCR

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