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MeDIP-seq检测游离sio2所致肺成纤维细胞转分化的DNA甲基化

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MeDIP-seq检测游离SiO2所致肺成纤维细胞转分化的DNA甲基化

作者：侯建永郑州大学

学位级别：硕士

目的尘肺病是我国职业病中占比例最多的疾病,一直以来影响着发病者的生活质量和社会的经济发展,而游离sio2粉尘致肺纤维化作用最强,矽肺也是尘肺中进展最快、死亡率最高的一种之一。长期以来,人们对矽肺进行了大量研究,但是其发病机制... 详细信息

目的尘肺病是我国职业病中占比例最多的疾病,一直以来影响着发病者的生活质量和社会的经济发展,而游离sio2粉尘致肺纤维化作用最强,矽肺也是尘肺中进展最快、死亡率最高的一种之一。长期以来,人们对矽肺进行了大量研究,但是其发病机制仍不清楚,因而缺乏有效的早期诊断、动态观察的生物标志,也不能消除或逆转肺组织纤维化。随着表观遗传学的研究和发展,表观遗传学调控可能是矽肺形成中成纤维细胞转分化的重要机制。本课题组前期研究在建立细胞共培养的矽肺体外模型基础上,通过高效液相色谱法对矽肺中肺成纤维细胞DNA甲基化进行了研究,发现整体甲基化程度降低,因此认为DNA甲基化改变可能是矽肺发生发展的一种调控方式。但并未进行甲基化特异性位点的探索和研究,而相关研究也尚未见报道。因此,该研究采用DNA甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术对sio2所致肺成纤维细胞转分化过程中可能存在的DNA甲基化差异基因进行检测,并探讨其可能的机制,为进一步研究其表观遗传学调控机制提供实验基础。方法本次实验中采取组织块法提取雄性SD大鼠的肺成纤维细胞进行原代培养,培养至6-8代时转移至6孔板中。采用肺泡灌洗术提取雄性SD大鼠的肺泡巨噬细胞。使用transwell对肺成纤维细胞和肺泡巨噬细胞进行共培养,肺成纤维细胞在下层,巨噬细胞在transwell之上,建立矽肺体外模型。使用100μg/ml的sio2的工作液对共培养模型的巨噬细胞进行染毒处理,分别在0h(A1)、24h(A2)、48h(A3)收取成纤维细胞。采用QIAamp DNA Mini Kit试剂盒提取成纤维细胞的DNA。采用DNA甲基化免疫共沉淀测序(MeDIP-seq)技术对不同组的DNA进行DNA甲基化的检测,测序所得到的数据经过初步的筛选和处理之后用于后续的分析。分别对测序所得reads和高甲基化区域扫描peak进行统计描述和基因元件分布的描述。进一步的对差异甲基化区域和差异基因进行统计,并使用DAVID工具对DNA甲基化差异基因进行GO和KEGG pathway的生物信息学分析。使用亚硫酸氢盐测序的方法对MeDIP-seq的结果进行验证。结果***-seq数据分析发现分别有26,048,428(60.90%)、34,162,578(61.53%)、33,314,252(60.18%)个reads比对到了大鼠的参考基因组上,进一步的分析发现,分别有22,192,364、28,930,222、28,256,146个reads比对到参考基因组的唯一位置上。基因组功能原件的分布分析发现,集中在基因间区的reads最多,其次是内含子和外显子等。2.扫描显著性的甲基化peak区域,分析结果发现,总共308,723个peak被扫描发现,在各组分别有208,253、206,685和232,504个peak扫描获得,分别有208,253、206,685、232,504个peak定位在了基因的功能元件上。在不同的功能元件上,在基因间区的peak数量最多,内含子次之。***甲基化差异区域对应的唯一差异基因有16,292个,其中a1与a2的比较组中有13,311个,a2与a3的比较组中有13,753个,a1与a3的比较组中有13,381个,更深入的分析发现总共有8,791个基因被发现在三个差异组中都存在。***甲基化差异基因的go分析发现这些差异基因主要集中在生物学过程、构成细胞的组分,实现的分子功能三个大的分类中。其中4,402个基因分类在生物学过程中,3,920个基因分类在细胞组成成份,4,290个基因分类在分子功能中。***甲基化差异基因的keggpathway分析发现,这些差异甲基化基因主要富集在37个通路中,这37个通路按照其特征又归化为了5个大类的通路,包括新陈代谢、环境信息加工、细胞过程、生物体系统和人类疾病相关的通路。结论成纤维细胞转分化过程中涉及的dna甲基化改变的位点主要分布在基因的基因间区和内含子、外显子区域,启动子和基因下游区域很少。成纤维细胞转分化过程中存在大量dna甲基化程度发生改变的基因,这些基因的功能主要集中在与磷代谢相关的生物学过程、质膜相关的细胞组成成份和离子通道相关的分子功能中。成纤维细胞转分化过程可能与线粒体的能量活动有关;成纤维细胞转分化后形成肺纤维化的主要形式是成纤维细胞与细胞外基质的连接形成粘着斑;成纤维细胞转分化过程中有与突触形成相关基因的功能变化变化;成纤维细胞转分化过程与癌症形成有许多相似的过程,其中的MAPK、Wnt、ErbB、p53和TGF-β等通路可能在矽肺的形成中起到重要作用,值得进行进一步研究。

关键词： MeDIP-seq 游离sio2 肺成纤维细胞转分化 DNA甲基化

游离sio2粉尘对大鼠循环成纤维细胞胶原和α-平滑肌肌动蛋白的作用

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大家健康(学术版) 2014年第7期 24-24页

作者：李举四川科技职工大学职业安全健康与环保工程系

目的:观察、探讨不同浓度的游离sio2刺激巨噬细胞(AM)的上清液对循环成纤维细胞(circulating fibrocytes,cFb)的影响作用。方法:构建大鼠外周血cFb、大鼠腹腔AM体外原代培养模型,用一些列浓度游离sio2(0、20、40、60、80、100、120μg/... 详细信息

目的:观察、探讨不同浓度的游离sio2刺激巨噬细胞(AM)的上清液对循环成纤维细胞(circulating fibrocytes,cFb)的影响作用。方法:构建大鼠外周血cFb、大鼠腹腔AM体外原代培养模型,用一些列浓度游离sio2(0、20、40、60、80、100、120μg/ml)刺激AM 24h,离心后取上清液,用上清液刺激cFb 24h。对不同sio2浓度刺激cFb后,采用PCR法测其对Ⅰ型、Ⅲ型胶原、α-SMA mRNA的相对表达水平。结果:20、40、60、80μg/ml浓度差异有统计学意义(P游离sio2刺激AM的培养上清液再刺激cFb后随sio2浓度增大表现对Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA mRNA表达增加

关键词：游离sio2 循环成纤维细胞 Collagen-Ⅰ、Collagen-Ⅲ、α-SMA

抑制PPARγ对游离sio_2诱导肺泡巨噬细胞CD36表达及脂质蓄积的调节作用

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环境与职业医学 2018年第1期35卷 55-59页

作者：候晓敏陈紫莺田盈崔洁马景景张秀峰郝小慧郭灵丽刘和亮王宏丽华北理工大学公共卫生学院河北唐山063210 华北理工大学实验研究中心河北唐山063210

[目的]探讨在游离sio_2诱导大鼠肺泡巨噬细胞泡沫化过程中抑制过氧化物酶增殖体激活性受体(PPARγ)对CD36表达以及脂质蓄积的调节作用。[方法]常规体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞,给予PPARγ特异性抑制剂GW9662阻断PPARγ信号通... 详细信息

[目的]探讨在游离sio_2诱导大鼠肺泡巨噬细胞泡沫化过程中抑制过氧化物酶增殖体激活性受体(PPARγ)对CD36表达以及脂质蓄积的调节作用。[方法]常规体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞,给予PPARγ特异性抑制剂GW9662阻断PPARγ信号通路,观察细胞的泡沫化情况;细胞分为抑制剂组(GW9662)、溶剂对照组(DMSO)、实验组(GW9662+sio_2+ox-LDL)、模型组(DMSO+sio_2+ox-LDL),培养36 h。油红O染色镜下观察脂质蓄积情况;酶法测定细胞中总胆固醇、游离胆固醇表达情况,计算胆固醇酯占总胆固醇的比例,鉴定泡沫细胞的形成;应用Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应技术分别检测PPARγ和CD36的蛋白和基因表达情况。[结果]实验结果显示,与模型组[(31.41±1.36)mg/g]比较,实验组[(8.78±0.49)mg/g]、抑制剂组[(6.23±0.27)mg/g]和溶剂对照组[(6.99±0.30)mg/g]细胞内总胆固醇含量明显降低(P28.43%)、抑制剂组(27.02%)和溶剂对照组(24.92%)的胆固醇酯占总胆固醇比例均小于50%,3组之间差异没有统计学意义(P>0.05);与模型组相比,实验组泡沫细胞数目明显减少。实验组CD36蛋白(0.55±0.13)和m RNA(1.30±0.39)表达也较模型组[分别为(1.08±0.31)和(3.38±0.70)]明显降低(P游离sio_2所诱导的CD36表达可能是由PPARγ介导所致。

关键词：游离sio2 脂质蓄积过氧化物酶增殖体激活性受体 CD36 巨噬细胞泡沫细胞

粉尘游离sio_2含量检测中加标回收的应用及质控要点

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中国工业医学杂志 2011年第2期24卷 142-144页

作者：汝玲张炯王海椒四川省疾病预防控制中心职业与辐射卫生所四川成都610041

以焦磷酸质量法测定粉尘中游离S iO2含量,其过程时间长、步骤多,极易导致误差。为提高方法的准确度,控制检测质量,通过向基底尘中加入标准石英尘进行加标回收检测,分析影响检测结果的关键控制环节,为评价及日常检测工作提供更加规范、... 详细信息

以焦磷酸质量法测定粉尘中游离S iO2含量,其过程时间长、步骤多,极易导致误差。为提高方法的准确度,控制检测质量,通过向基底尘中加入标准石英尘进行加标回收检测,分析影响检测结果的关键控制环节,为评价及日常检测工作提供更加规范、准确的保障。

关键词：粉尘游离sio2 加标回收检测质量控制

工作场所粉尘中游离sio_2测定方法的优化

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煤矿机械 2016年第9期37卷 64-66页

作者：张伟杰张嘉琪徐庆天津理工大学环境科学与安全工程学院天津300384 首都经济贸易大学安全与环境工程学院北京100070

为了更好地测定工作场所中游离Si O2的含量,基于焦磷酸法,采用准确度、精密度、回收率与时效性指标的方法,对实验的过滤部分就设备动力和过滤溶液水量进行了优化。结果表明:过滤时的溶液水量大约在250 m L时耗时最少,结果准确,优化后的... 详细信息

为了更好地测定工作场所中游离Si O2的含量,基于焦磷酸法,采用准确度、精密度、回收率与时效性指标的方法,对实验的过滤部分就设备动力和过滤溶液水量进行了优化。结果表明:过滤时的溶液水量大约在250 m L时耗时最少,结果准确,优化后的焦磷酸法提高了粉尘中游离Si O2含量测定实验效率。

关键词：游离sio2 焦磷酸法回收率准确度优化

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蔺草染土粉尘的特性及职业危害

工业卫生与职业病 2002年第3期28卷 133-136页

作者：马藻骅王仁元肖国兵展明符徐来荣周承来马磊张幸岸本卓已森永谦二神山宣彦浙江省宁波市卫生防疫站浙江宁波315010 浙江省鄞县卫生防疫站浙江宁波315040 浙江省医学科学院浙江杭州310013 日本冈山劳灾病院日本大阪府立成人病院日本国产业医学综合研究所

目的　研究蔺草染土粉尘的特性及其对作业场所环境污染的特点。方法　按GB5 74 8— 85和GB16 2 2 5— 1996规定的方法在同一作业点同时测定总粉尘和呼吸性粉尘浓度 ;分别用焦磷酸重量法和X射线衍射法测定粉尘中游离sio2 含量 ,X射线衍... 详细信息

目的　研究蔺草染土粉尘的特性及其对作业场所环境污染的特点。方法　按GB5 74 8— 85和GB16 2 2 5— 1996规定的方法在同一作业点同时测定总粉尘和呼吸性粉尘浓度 ;分别用焦磷酸重量法和X射线衍射法测定粉尘中游离sio2 含量 ,X射线衍射法测定粉尘矿物学结构。结果　总粉尘浓度几何均数为(2 7 90± 2 82 )mg/m3 ,呼吸性粉尘浓度几何均数为 (6 78± 2 5 2 )mg/m3 ,两者呈正相关 ,r =0 873,P 游离sio2 含量分别为 4 5 87%和 2 1 37% ;构成染土粉尘的矿物主要有石英、高岭土、叶腊石、云母。结论　蔺草染土是一种混合性矿物粉尘 ,其中呼吸性粉尘约占 2 5 % ;由于环境中粉尘浓度很高 ,长期接触可引起尘肺。

关键词：呼吸性粉尘游离sio2 尘肺蔺草染土粉尘特性职业危害

X射线衍射里特沃尔德全谱图拟合法与焦磷酸法测定锡冶炼粉尘中游离二氧化硅水平比较

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中国职业医学 2013年第1期40卷 45-46页

作者：李小萍麦志丹梁德新葛宪民王力珩曾令民广西壮族自治区职业病防治研究院广西南宁530021 广西大学 530021

目的探讨X射线衍射里特沃尔德(Rietveld)全谱图拟合法和焦磷酸法测定锡冶炼粉尘中游离二氧化硅(sio2)水平的差异。方法应用X射线衍射Rietveld全谱图拟合法和焦磷酸法测定同一锡冶炼粉尘中游离sio2水平,采用配对t检验对2种方法的检测结... 详细信息

目的探讨X射线衍射里特沃尔德(Rietveld)全谱图拟合法和焦磷酸法测定锡冶炼粉尘中游离二氧化硅(sio2)水平的差异。方法应用X射线衍射Rietveld全谱图拟合法和焦磷酸法测定同一锡冶炼粉尘中游离sio2水平,采用配对t检验对2种方法的检测结果进行比较分析。结果焦磷酸法的重现性测定相对标准偏差大于X射线衍射Rietveld全谱图拟合法;焦磷酸法测得的粉尘中游离sio2水平高于X射线衍射Rietveld全谱图拟合法的测定结果(P游离sio2时,可能会导致结果产生较大偏差,应辅以全谱图拟合法进行分析。

关键词：锡冶炼粉尘焦磷酸法 X射线衍射Rietveld全谱图拟合法游离sio2

粉尘中游离二氧化硅检测的透滤问题及解决对策

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工业卫生与职业病 2012年第2期38卷 126-127页

作者：孙玉凤徐彦顾竹琳鞍山钢铁集团公司劳动卫生研究所辽宁鞍山114044

粉尘是最为严重的职业病危害因素,且粉尘中的游离二氧化硅（sio2）是引发矽肺病的主要原因。因此,监测粉尘中游离sio2含量是职业卫生工作的一项重要内容。为更好地提高粉尘监测质量,近几年卫生部在职业卫生技术服务机构进行了多次粉尘... 详细信息

粉尘是最为严重的职业病危害因素,且粉尘中的游离二氧化硅（sio2）是引发矽肺病的主要原因。因此,监测粉尘中游离sio2含量是职业卫生工作的一项重要内容。为更好地提高粉尘监测质量,近几年卫生部在职业卫生技术服务机构进行了多次粉尘中游离sio2含量的检测能力考核。我们在参加卫生部主办的粉尘中游离二氧化硅含量的检测能力实验中遇到了样品透滤问题,发现透滤现象与粉尘粒度分布有一定的关系,现将问题与对策报告如下。

关键词：游离二氧化硅检测能力粉尘职业卫生技术服务机构游离sio2 职业病危害因素职业卫生工作监测质量

PPARγ-CD36信号通路对矽肺肺泡巨噬细胞脂质代谢调控的作用研究

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PPARγ-CD36信号通路对矽肺肺泡巨噬细胞脂质代谢调控的作用研究

作者：候晓敏华北理工大学

学位级别：硕士

目的通过体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞,建立二氧化硅(sio2)刺激后的泡沫细胞模型,探讨过氧化物酶增殖体激活性受体(PPARγ)-CD36通路在矽肺肺泡巨噬细胞脂质代谢调控中的作用机制,为延缓矽肺的发病进程、治疗矽肺提供新的思路... 详细信息

目的通过体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞,建立二氧化硅(sio2)刺激后的泡沫细胞模型,探讨过氧化物酶增殖体激活性受体(PPARγ)-CD36通路在矽肺肺泡巨噬细胞脂质代谢调控中的作用机制,为延缓矽肺的发病进程、治疗矽肺提供新的思路。方法常规体外培养大鼠肺泡巨噬细胞株NR8383细胞,经细胞增殖毒性检测试剂盒(MTS)确定sio2和氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激浓度;将细胞随机分为对照组(常规培养的细胞)、sio2组(50μg/ml sio2刺激)、氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)组(50μg/ml ox-LDL刺激)以及模型组(50μg/ml sio2和ox-LDL刺激),分别培养36h。采用MTS法检测ox-LDL对细胞存活率的影响;油红O染色观察细胞内脂质蓄积;总胆固醇(TC)和游离胆固醇(FC)试剂盒检测细胞中TC和FC的表达情况,并计算胆固醇酯(CE)含量;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测PPARγ和CD36基因和蛋白的表达情况;激光共聚焦显微镜观察PPARγ和CD36荧光强度;大鼠细胞生长转化因子(TGF-β)酶联免疫试剂盒(ELISA)检测细胞上清液TGF-β的表达量。巨噬泡沫细胞模型建立好后,给予磺基-N-琥珀酰亚胺基油酸酯(SSO)抑制剂阻断CD36通路,细胞随机分为以下四组:SSO抑制剂组(5μM SSO)、溶剂对照组(等体积DMSO)、SSO实验组(SSO+sio2+ox-LDL)以及模型组(DMSO+sio2+ox-LDL),分别培养36h。采用以上实验方法观察细胞CD36和PPARγ表达以及泡沫化情况。随后加入PPARγ特异性抑制剂GW9662阻断PPARγ信号通路;主要分为GW9662抑制剂组(5μM GW9662)、溶剂对照组(等体积DMSO)、GW9662实验组(GW9662+sio2+ox-LDL)以及模型组(DMSO+sio2+ox-LDL),孵育36h;同样采用以上实验方法进行观察检测。结果1 MTS确定sio2和ox-LDL刺激浓度:sio2刺激细胞36h后,发现浓度在50μg/ml后,细胞存活率开始显著降低(Psio2刺激浓度为50μg/ml;细胞加入不同ox-LDL刺激,发现与对照比较,细胞存活率在50μg/ml时达到最大,且差异具有统计学意义(Psio2组、ox-LDL组和模型组中细胞胞浆内出现大量的红色脂滴,以及吞噬的sio2颗粒,其中以模型组较为明显。3模型组TC和FC均较对照组、sio2组和ox-LDL组显著升高(Psio2组和ox-LDL组细胞内PPARγ和CD36的蛋白和基因表达均显著低于模型组(Psio2组和ox-LDL组细胞内PPARγ和CD36表达的荧光强度均较弱。6 ELISA法检测得出,模型组细胞释放TGF-β的量均高于对照组、sio2组和ox-LDL组,且差异均具有统计学意义(P0.05);激光共聚焦显微镜下观察发现,与模型组比较,SSO实验组CD36荧光强度明显减弱,PPARγ表达无明显差异;SSO实验组细胞内TC和CE含量显著低于模型组(P0.05),且CE/TC均小于50%;此外SSO实验组较模型组泡沫阳性细胞数目明显减少,细胞上清液中TGF-β表达显著降低(Psio2可以促使巨噬细胞脂质代谢紊乱,加剧细胞泡沫化,同时释放细胞因子TGF-β。2 PPARγ可能参与介导游离sio2所诱

关键词：游离sio2 泡沫细胞 PPARγ CD36 TGF-β