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温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

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中华中医药杂志 2023年第5期38卷 2073-2078页

作者：吴承杰郭杨石磊陈思娴潘娅岚刘孟敏王礼宁马勇南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室南京210023 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院南京210023 南京中医药大学慢性病中医护理干预实验室南京210023

目的:探究温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的影响及其作用机制。方法:采用改良A11en’s法制备脊髓损伤小鼠模型,1、3、7d后通过HE染色和尼氏染色观察损伤脊髓的病理改变。利用ELISA法检测损伤脊髓和血清中MCP-1... 详细信息

目的:探究温肾通督方对脊髓损伤后微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的影响及其作用机制。方法:采用改良A11en’s法制备脊髓损伤小鼠模型,1、3、7d后通过HE染色和尼氏染色观察损伤脊髓的病理改变。利用ELISA法检测损伤脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的表达水平,通过3D激光共聚焦观察损伤脊髓中MECs吞噬髓鞘碎片情况,采用多重免疫荧光染色检测脊髓损伤后MECs中HDAC6、LC3B、NLRP3表达。结果:与模型组比较,温肾通督方明显减少脊髓损伤后炎症细胞的浸润和神经元的固缩坏死;显著降低脊髓和血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α的水平(P温肾通督方可能通过抑制HDAC6促进MECs吞噬髓鞘碎片,并能同时阻断NLRP3通路的信号转导,共同改善炎性微环境,促进脊髓损伤修复。

关键词：温肾通督方脊髓损伤微血管内皮细胞髓鞘碎片炎症反应

温肾通督方对脊髓损伤模型小鼠脾脏B细胞影响的蛋白组学研究

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中医杂志 2023年第22期64卷 2329-2338页

作者：石磊吴承杰陈思娴潘娅岚王礼宁赵瑞华吴毛马勇郭杨南京中医药大学中医学院·中西医结合学院 210023 南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室南京中医药大学无锡附属医院

目的探讨温肾通督方对脊髓损伤的影响及可能机制。方法36只C57BL/6雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通督方组,每组12只。模型组、温肾通督方组小鼠采用改良Allen's法建立小鼠脊髓损伤模型,假手术组仅进行脊髓暴露。温肾通督方组... 详细信息

目的探讨温肾通督方对脊髓损伤的影响及可能机制。方法36只C57BL/6雌性小鼠随机分为假手术组、模型组、温肾通督方组,每组12只。模型组、温肾通督方组小鼠采用改良Allen's法建立小鼠脊髓损伤模型,假手术组仅进行脊髓暴露。温肾通督方组从术后第1天按50 g/(kg·d)给予温肾通督方溶液灌胃,假手术组及模型组给予生理盐水20 ml/(kg·d)灌胃,各组均连续灌胃14天。在术前及术后第1、7、14天,利用斜板试验及后肢运动功能(BMS)评分对小鼠运动功能进行评估;术后第3天通过肌电图及运动诱发电位检测小鼠神经电生理,测量各组小鼠脾脏长度,利用磁珠分选脾脏中的B细胞,通过蛋白组学技术分析蛋白差异表达情况,采用Western blot法检测脾脏B细胞中线粒体外膜转运孔蛋白20(Tom20)及下游剪切化半胱氨酸蛋白酶3(Cleaved Caspase-3)蛋白表达;术后第14天采用核磁共振观察小鼠脊髓恢复情况。结果与假手术组同时间比较,模型组在术后1、7、14天BMS主评分、副评分及斜板试验角度均降低,术后3天小鼠肌电图和运动诱发电位峰峰值降低、脾脏长度减少,脾脏B细胞中Tom20和Cleaved Caspase-3表达量升高(P温肾通督方组小鼠术后14天时BMS副评分及术后7、14天时斜板试验角度升高,术后3天小鼠肌电图和运动诱发电位峰峰值升高、脾脏长度增加,Tom20和Cleaved Caspase-3表达量降低(P温肾通督方组与模型组相比共有100个差异蛋白,其中37个上调,63个下调。GO富集显示差异蛋白主要在氧结合、外源性凋亡负反馈、锌离子相应、氧输送等方面发挥作用。KEGG富集显示差异蛋白主要集中在代谢途径、亨廷顿病、氧化磷酸化等通路。亚细胞定位显示差异蛋白与线粒体相关。术后14天磁共振成像显示,假手术组小鼠脊髓结构完整,节段清晰,脊髓信号无异常;模型组小鼠脊髓损伤区域低信号区域增加,脊髓明显变细;温肾通督方组损伤节段有明显凹陷,但较模型组结构要完整。结论温肾通督方可能通过调节免疫功能促进脊髓损伤修复,其机制可能与抑制脾脏B细胞焦亡等相关。

关键词：脊髓损伤免疫功能蛋白组学线粒体外膜转运孔蛋白20 细胞焦亡温肾通督方

基于HDAC6介导的自噬-溶酶体途径探究温肾通督方对微血管内皮细胞吞噬髓鞘碎片的影响

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中国中西医结合杂志 2022年第5期42卷 589-596页

作者：吴承杰马勇郭杨潘娅岚刘孟敏涂鹏程杨光露杨一麟南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室南京210023 南京中医药大学中医学院·中西医结合学院南京210023 南京中医药大学慢性病中医护理干预实验室南京210023

目的基于组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)6介导的自噬-溶酶体途径,探究温肾通督方影响微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的作用机制。方法通过CCK-8法检测温肾通督方冻干粉干预后MECs的增殖状态,筛选其最佳干预浓度;构建体外类血管结构,并建... 详细信息

目的基于组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)6介导的自噬-溶酶体途径,探究温肾通督方影响微血管内皮细胞(MECs)吞噬髓鞘碎片的作用机制。方法通过CCK-8法检测温肾通督方冻干粉干预后MECs的增殖状态,筛选其最佳干预浓度;构建体外类血管结构,并建立髓鞘碎片与类血管结构共培养模型;将实验分为空白组(MECs)、模型组(MECs与髓鞘碎片共培养)、Tubastatin-A组(MECs与髓鞘碎片共培养+HDAC6抑制剂Tubastatin-A)以及温肾通督方组(MECs与髓鞘碎片共培养+温肾通督方冻干粉),通过免疫荧光染色法检测MECs吞噬髓鞘碎片的情况,并利用激光共聚焦进行拍照分析;通过Western Blot法检测MECs微管稳定系统(HDAC6、Kinesin5、Dynein)及自噬-溶酶体途径(LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、p62、Beclin1)相关蛋白的表达。结果免疫荧光结果表明,与模型组比较,Tubastatin-A组和温肾通督方组都可显著促进MECs吞噬髓鞘碎片(P温肾通督方组HDAC6的蛋白表达显著降低,而Kinesin5、Dynein、Beclin1、p-ULK1/ULK1的蛋白表达显著增高(P温肾通督方组HDAC6、Kinesin5、Dynein、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、p-ULK1/ULK1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 MECs吞噬髓鞘碎片会导致HDAC6的表达上调,但并不会影响MECs微管稳定系统及自噬-溶酶体途径;Tubastatin-A及温肾通督方均可通过抑制HDAC6的表达增强MECs微管系统的稳定,进而激活自噬-溶酶体途径,促进MECs吞噬髓鞘碎片。

关键词：脊髓损伤温肾通督方微血管内皮细胞组蛋白脱乙酰基酶自噬-溶酶体髓鞘碎片

基于NgR/RhoA/ROCK通路探究温肾通督方促进脊髓损伤修复的机制

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基于NgR/RhoA/ROCK通路探究温肾通督方促进脊髓损伤修复的机制

作者：吴承杰南京中医药大学

学位级别：硕士

目的:观察损伤神经元Nogo受体（NgR）的动态表达变化及温肾通督方（脊髓康）对脊髓损伤的干预作用,探究温肾通督方通过调控NgR/RhoA/ROCK信号通路促进脊髓损伤修复的机制。方法:第一部分:以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响... 详细信息

目的:观察损伤神经元Nogo受体（NgR）的动态表达变化及温肾通督方（脊髓康）对脊髓损伤的干预作用,探究温肾通督方通过调控NgR/RhoA/ROCK信号通路促进脊髓损伤修复的机制。方法:第一部分:以浸泡时间、加水量、煎煮时间、煎煮次数为影响因素,通过正交试验进行分组。采用高效液相色谱法测定黄芪甲苷、丹参酮ⅡA,并结合出膏率分析各因素对温肾通督方水提工艺的影响。第二部分:大鼠神经元体外分离后,进行纯化培养,使用免疫荧光法对其神经核抗原（NeuN）进行鉴定。采用谷氨酸制备神经元损伤模型,并使用TUNEL法进行鉴定。实验分为1d、3d、7d、14d、对照组,使用NgR与NeuN免疫荧光双重标记染色、Western blot、qPCR观察损伤神经元表达NgR的情况;采用PC12细胞替代神经元,制备损伤模型后分别使用大鼠含药血清（空白对照组、强的松组、温肾通督方组）干预,并于1d、3d、7d进行NgR免疫荧光标记染色、qPCR观察NgR的表达情况。第三部分:采用改良Allen’s法制备SD大鼠脊髓损伤模型,将实验分为模型组、强的松组、温肾通督方组、假手术组。大鼠的运动功能采用BBB评分和斜板试验评价,高尔基染色和透射电镜观察神经组织的微观结构,TUNEL与NeuN的荧光双标法检测神经元的凋亡。第四部分:制备大鼠脊髓损伤模型,将实验分为模型组、强的松组、温肾通督方组、假手术组。采用NeuN与NgR的荧光双标法检测局部NgR的表达与定位,免疫组化、Western blot、qPCR检测损伤区NgR、RhoA、ROCK 的表达。结果:第一部分:温肾通督方的最佳水提工艺为浸泡时间1h,加12倍水量,煎煮3次,每次1h。第二部分:免疫荧光、Western blot、qPCR结果均表明损伤神经元在1d时NgR表达最高,与对照组相比具有明显差异（P＜0.05）,3d、7d、14d逐渐下降;免疫荧光、qPCR结果均表明温肾通督方组的PC12细胞在7d时NgR表达减少,与空白对照组相比具有明显差异（P＜0.05）。第三部分:在28d与模型组相比,BBB评分和斜板试验均表明温肾通督方可促进脊髓损伤大鼠运动功能的恢复（P＜0.05）;高尔基染色和透射电镜均提示温肾通督方可改善脊髓损伤大鼠神经元的微观结构（线粒体、内质网、树突棘等）;TUNEL与NeuN的荧光双标表明温肾通督方可降低脊髓损伤大鼠神经元的凋亡率（P＜0.05）。第四部分:NeuN与NgR的荧光双标法表明温肾通督方可抑制脊髓损伤大鼠神经元NgR的表达（P＜0.05）;免疫组化、Western blot、qPCR表明温肾通督方可抑制脊髓损伤大鼠损伤区NgR、RhoA和ROCK的表达（P＜0.05）。结论:温肾通督方的最佳水提工艺为浸泡时间1h,加12倍水,煎煮3次,每次1h;温肾通督方可通过抑制NgR/RhoA/ROCK通路促进神经元轴突再生,进而改善脊髓损伤大鼠的运动功能。

关键词：脊髓损伤温肾通督方 NgR/RhoA/ROCK通路神经再生

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温肾通督方通过减轻铁过载促进脊髓损伤修复

中国中西医结合杂志 2024年

作者：陈思娴马勇石磊吴承杰赵瑞华郭杨潘娅岚吴毛刘孟敏南京中医药大学中医学院·中西医结合学院南京中医药大学骨伤修复与重建新技术实验室南京中医药大学无锡附属医院江苏省中医退行性骨关节病临床医学创新中心

目的探究温肾通督方通过减轻脊髓损伤后铁过载现象促进微血管内皮细胞（MECs）吞噬和清理髓鞘碎片，进而改善脊髓损伤后炎症微环境的作用机制。方法 50只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为5组，即：假手术组、模型组、甲磺酸去铁胺（DF... 详细信息

目的探究温肾通督方通过减轻脊髓损伤后铁过载现象促进微血管内皮细胞（MECs）吞噬和清理髓鞘碎片，进而改善脊髓损伤后炎症微环境的作用机制。方法 50只C57BL/6小鼠采用随机数字表法分为5组，即：假手术组、模型组、甲磺酸去铁胺（DFO）组、温肾通督方组、温肾通督方+DFO组，每组各10只。采用改良Allen’s法制备脊髓损伤小鼠模型，通过HE染色和尼氏染色观察脊髓的病理改变；采用铁离子比色法检测试剂盒测定血清中铁离子含量；利用ELISA法检测脊髓匀浆和血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达水平；通过3D激光共聚焦观察脊髓中MECs吞噬和清理髓鞘碎片情况。结果实验过程中模型组、DFO组及温肾通督方组各死亡1只。与模型组比较，HE染色结果表明，DFO组和温肾通督方组能够减少脊髓空洞和神经纤维排列紊乱现象；尼氏染色分析显示，DFO组和温肾通督方组可改善尼氏体形态和神经元固缩现象；铁离子比色法检测发现，DFO组和温肾通督方组小鼠血清中铁离子浓度显著减少（P温肾通督方组能够显著降低血清中MCP-1、IL-6、IL-1β、TNF-α浓度（P温肾通督方+DFO组可显著降低血清中MCP-1和IL-1β浓度（P温肾通督方组比较，温肾通督方+DFO组显著提高MCP-1、IL-6及IL-1β的浓度（P温肾通督方、温肾通督方+DFO组能够显著降低脊髓组织中MCP-1、IL-6、IL-1β（除温肾通督方组）和TNF-α浓度（P温肾通督方组可促进MECs吞噬和清理髓鞘碎片。结论温肾通督方可能通过减轻铁过载促进MECs吞噬髓鞘碎片，改善炎性微环境，促进脊髓损伤修复。

关键词：脊髓损伤温肾通督方微血管内皮细胞髓鞘碎片铁过载中药复方

温肾通督方通过短链脂肪酸调控小胶质细胞活化促进脊髓损伤修复的机制研究

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温肾通督方通过短链脂肪酸调控小胶质细胞活化促进脊髓损伤修复的...

作者：石磊南京中医药大学

学位级别：硕士

目的验证脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)后小鼠体内GH-IGF1轴相关指标会发生变化,GH-IGF1轴、SCFAs与SCI后小胶质细胞组蛋白乙酰化及其活化相关;阐明温肾通督方可通过恢复肠道菌群稳态调控短链脂肪酸生成、增强GH-IGF1轴活力,进而影... 详细信息

目的验证脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)后小鼠体内GH-IGF1轴相关指标会发生变化,GH-IGF1轴、SCFAs与SCI后小胶质细胞组蛋白乙酰化及其活化相关;阐明温肾通督方可通过恢复肠道菌群稳态调控短链脂肪酸生成、增强GH-IGF1轴活力,进而影响小胶质细胞组蛋白乙酰化促进小胶质细胞活化以促进修复。方法(1)实验选用C57BL/6小鼠,改良Allen's法被用于建立脊髓损伤模型,将实验分为假手术组、模型组、苦鬼臼毒素组(IGF1R酶抑制剂组)。BMS评分法以及斜板实验被用于评估小鼠后肢运动功能的康复情况,同时HE染色用于评价小鼠脊髓的病理结构状况。伊文思蓝染色观察血-脊屏障修复状况,ELISA检测小鼠体内GH、IGF1含量,通过q-PCR和Western blot检测IGF1R、Trem2、AQP4表达量,蛋白免疫印迹法检测H3K27、H3、H4K8、H4蛋白表达量,免疫荧光多标染色法检测Iba1、H4K8、H3K27蛋白表达量。(2)实验分为假手术组、模型组、帕比司他组、短链脂肪酸组。BMS评分法以及斜板实验被用于评估小鼠后肢运动功能的康复情况,尼氏染色被用来检测小鼠脊髓神经元状况,伊文思蓝染色观察血-脊屏障修复状况,蛋白免疫印迹法检测H3K27、H3、H4K8、H4蛋白表达量,免疫荧光多标染色法检测H4K8、H3K27、Iba1蛋白表达量。通过q-PCR和Western blot检测IGF1R、Trem2表达量,ELISA检测小鼠肝脏、血、脑脊液中IGF1、血浆中GH含量。(3)实验分为假手术组、模型组、抗生素组、益生菌组、温肾通督方组。小鼠肠道菌群状况采用大肠杆菌培养结果展示,BMS评分法以及斜板实验被用于评估小鼠后肢运动功能的康复情况,小鼠脊髓和神经修复状况通过HE染色和尼氏染色观察,伊文思蓝染色观察血-脊屏障修复状况,蛋白免疫印迹法检测H3K27、H3、H4K8、H4蛋白表达量,免疫荧光多标染色法检测H4K8、H3K27、Iba1蛋白表达量。通过q-PCR和Western blot检测IGF1R、Trem2表达量,ELISA检测小鼠肝脏、血、脑脊液中IGF1、血浆中GH含量。结果(1)BMS评分法、斜板实验、HE染色结果均显示:苦鬼臼毒素可导致小鼠后肢运动功能及脊髓结构的恢复障碍,延缓血-脊屏障修复,降低血浆、肝脏中IGF1含量,显著降低脑脊液中IGF1含量。血浆中GH含量也随之降低。脊髓中小胶质细胞H4K8 水平升高,H3K27水平降低。(2)短链脂肪酸可改善脊髓神经修复状况、促进小鼠后肢运动功能的恢复,同时可促进血-脊屏障修复,提高脊髓组织中H3K27水平,降低H4K8 水平,提高Trem2表达,同时可提高脊髓组织中小胶质细胞H3K27水平、降低H4K8水平,提高肝脏、血浆、脑脊液中IGF1含量,提高血浆中GH含量。(3)BMS评分法和斜板实验均表明温肾通督方可促进小鼠后肢运动功能的恢复。温肾通督方干预可促进血-脊屏障的修复,提高脊髓组织中H3K27水平,降低H4K8水平。同时提高脊髓组织中小胶质细胞H3K27水平、降低H4K8水平。提高肝脏、血浆、脑脊液中IGF1含量,提高血浆中GH含量,增强小胶质细胞活性。结论温肾通督方可通过恢复肠道菌群稳态调控短链脂肪酸生成、增强GH-IGF1轴活力,进而影响组蛋白乙酰化促进小胶质细胞活化以促进脊髓损伤修复。

关键词：脊髓损伤温肾通督方短链脂肪酸肠道菌群组蛋白乙酰化 GH-IGF1轴

温肾通督方治疗肾虚督寒型强直性脊柱炎的临床观察

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温肾通督方治疗肾虚督寒型强直性脊柱炎的临床观察

作者：张馥涵黑龙江中医药大学

学位级别：硕士

目的:观察肾虚督寒型AS(ankylosing spondylitis,强直性脊柱炎)采用温肾通督方治疗之前、治疗之后的实验室检查及中、西医症候积分表变化结果,以证实温肾通督方在缓解症状、改善相关的实验室指标等方面有效性和安全性,为治疗AS提供可靠... 详细信息

目的:观察肾虚督寒型AS(ankylosing spondylitis,强直性脊柱炎)采用温肾通督方治疗之前、治疗之后的实验室检查及中、西医症候积分表变化结果,以证实温肾通督方在缓解症状、改善相关的实验室指标等方面有效性和安全性,为治疗AS提供可靠的办法和途径。方法:选择和研究标准相符合的60例肾虚督寒型AS样本病例,且基于随机分组原则将所选样本病人随机、均分成对照组与治疗组,将柳氮磺吡啶肠溶片(前7日0.25克,tid,po,以后每周增加0.25g,直到0.75g,tid,po)+温肾通督方(饭后口服,2次/天,150ml)给予治疗组样本病例;柳氮磺吡啶肠溶片(前7日0.25克,tid,po,以后每周增加0.25g,直到0.75g,tid,po)+旭痹片(4片/次,tid,po)给予对照组样本病例。共观察12周,并对其进行临床观察。基于软件对治疗组与对照组样本病人治疗之前与治疗之后的ESR、CRP等实验室指标与中、西医症候积分等变化进行分析。进而评判两种实验方案的临床有效率。结果:1、主要中医症状比较:从病人脊柱活动受限、脊背疼痛、腰骶疼痛等改善上来看,治疗组优于对照组,具有统计学意义2、生化指标比较:从ESR、CRP等水平降低结果上来看,治疗组优于对照组,具有统计学意义。3、两组总体有效率比较:治疗组总有效率90.00%;对照组总有效率86.67%,治疗组优于对照组,具有统计学意义。4、两组ASAS20有效率比较:治疗组总有效率为86.67%,对照组总有效率为76.67%,治疗组优于对照组,具有统计学意义。结论:1、温肾通督方联合柳氮磺砒啶治疗肾虚督寒型强直性脊柱炎,在临床总体疗效方面,效果显著。2、温肾通督方联合柳氮磺吡啶治疗肾虚督寒型强直性脊柱炎,在改善中医症状和体征方面,效果显著。3、温肾通督方联合柳氮磺砒啶治疗肾虚督寒型强直性脊柱炎,在改善急性期反应物水平(ESR\CRP)方面,效果显著。

关键词：温肾通督方柳氮磺吡啶肾虚督寒型强直性脊柱炎(AS)

中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄的效果及对免疫水平的影响

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颈腰痛杂志 2018年第5期39卷 645-647页

作者：谢添武汉市中医医院湖北武汉430000

目的探讨中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄的临床疗效及对患者免疫状态的影响。方法收集2014-01-2016-01我院接受保守治疗的腰椎管狭窄患者74例,按照随机数字表法分为观察组与对照组各37例。对照组应用腰痹通胶囊治疗,观察组应用中医温肾... 详细信息

目的探讨中医温肾通督方治疗腰椎管狭窄的临床疗效及对患者免疫状态的影响。方法收集2014-01-2016-01我院接受保守治疗的腰椎管狭窄患者74例,按照随机数字表法分为观察组与对照组各37例。对照组应用腰痹通胶囊治疗,观察组应用中医温肾通督方治疗,比较两组临床疗效及治疗前后视觉疼痛量表(VAS)评分、日本整形外科学会(JOA)腰痛疾病评分、免疫功能指标。结果治疗后两组的VAS评分均较治疗前明显降低,JOA评分均较治疗前显著提高,T淋巴细胞亚群(CD4+、CD4+/CD8+)均显著升高,CD8+均显著降低(P温肾通督方治疗腰椎管狭窄疗效显著,能够缓解临床症状、改善腰部功能状态并增强机体免疫,有一定的临床应用价值。

关键词：腰椎管狭窄温肾通督方中医药疗法临床疗效免疫功能