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肉源大肠杆菌与假单胞菌混合生物被膜形成分析

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食品科学 2023年第20期44卷 107-118页

作者：季君珂宓晓雨袁杨洋程宇张文栋张晨江芸南京师范大学食品与制药工程学院江苏南京210023

为研究肉源大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成,首先采用微孔板结晶紫染色法评估肉源分离株生物被膜形成能力,进而探讨两种菌代表菌株组合混合被膜形成过程,分析被膜量、微观结构和胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)组... 详细信息

为研究肉源大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成,首先采用微孔板结晶紫染色法评估肉源分离株生物被膜形成能力,进而探讨两种菌代表菌株组合混合被膜形成过程,分析被膜量、微观结构和胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)组成的动态变化,并采用实时聚合酶链式反应绝对定量方法分析相关成膜基因表达差异。结果表明,大肠杆菌与假单胞菌被膜形成能力均存在显著的菌株差异(P混合生物被膜的形成过程不同,并且在不同成膜时间两种菌的相互作用发生变化。共聚焦激光扫描显微镜观察发现微观结构也发生类似变化。混合被膜形成时EPS中蛋白质和多糖的分泌受到抑制,与两种单菌被膜的总EPS之和相比,混合成膜72 h和168 h蛋白质含量分别减少31%和48%,多糖含量分别减少38%和56%。基于单位菌数基因表达水平发现,浮游菌形成生物被膜后相关成膜基因的表达均显著上调(P生物被膜相比,混合成膜时大肠杆菌papC和csgA基因表达水平在72 h和168 h极显著上调(P混合成膜时基因绝对表达量相比于单菌被膜发生不同程度变化。本研究可为揭示肉源腐败微生物混合被膜形成规律提供科学基础,为肉类生产加工中微生物风险评估及污染控制提供科学依据。

关键词：肉源大肠杆菌肉源假单胞菌混合生物被膜交互作用基因表达

肉源大肠杆菌与假单胞菌混合生物被膜形成研究

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食品科学 2022年

作者：季君珂宓晓雨袁杨洋程宇张文栋张晨江芸南京师范大学食品与制药工程学院

为研究肉源大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成，本文首先采用微孔板结晶紫染色法评估肉源分离株生物被膜形成能力，进而探讨两种菌代表菌株组合混合被膜形成过程，包括被膜量、微观结构和胞外聚合物（extracellular polymeric substances... 详细信息

为研究肉源大肠杆菌与假单胞菌混合被膜形成，本文首先采用微孔板结晶紫染色法评估肉源分离株生物被膜形成能力，进而探讨两种菌代表菌株组合混合被膜形成过程，包括被膜量、微观结构和胞外聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）组成的动态变化，并采用反转录荧光定量PCR（reverse transcription real time PCR，RT-real time PCR）绝对定量方法分析相关成膜基因表达差异。结果显示大肠杆菌与假单胞菌被膜形成能力均存在明显菌株差异（P混合生物被膜的形成过程不同，并且在不同成膜时间两种菌的相互作用发生变化。共聚焦激光扫描显微镜（confocal laser scanning microscope，CLSM）微观结构也发生类似变化。混合被膜形成时EPS中蛋白质和多糖的分泌受到抑制，与两单菌被膜总EPS之和相比，混合成膜72和168 h时蛋白质分别减少31%和48%，多糖分别减少38%和56%。基于单位菌数基因表达发现，浮游菌形成生物被膜后相关成膜基因的表达均显著上调（P生物被膜相比，混合成膜时大肠杆菌papC和csgA基因在72 h和168 h极显著上调（P混合成膜时基因绝对表达量相比于单菌被膜发生不同程度的变化。本研究可为揭示肉源腐败微生物混合被膜形成规律提供科学基础，为肉类生产加工中微生物风险评估及污染控制提供科学依据。

关键词：肉源大肠杆菌肉源假单胞菌混合生物被膜交互作用基因表达

异绿原酸联合抗生素对铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物被膜的体外协同抑菌作用

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中华微生物学和免疫学杂志 2020年第10期40卷 763-767页

作者：李更森涂荣祖洪训宇孔晋亮宁波市妇女儿童医院内科 315000 广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症学科南宁530021

目的研究金银花活性成分异绿原酸及联合伏立康唑+头孢他啶对早期铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的体外协同抑菌作用。方法体外构建早期24 h静止铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物被膜模型并建立不同浓度(250、500、1000μg/ml)的异绿原... 详细信息

目的研究金银花活性成分异绿原酸及联合伏立康唑+头孢他啶对早期铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的体外协同抑菌作用。方法体外构建早期24 h静止铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物被膜模型并建立不同浓度(250、500、1000μg/ml)的异绿原酸组及联合抗生素组(1μg/ml伏立康唑+16μg/ml头孢他啶)分别作用24 h,扫描电镜(SEM)观察生物被膜形态学改变;结晶紫染色法定量生物被膜;XTT减低法测混合生物被膜内烟曲霉及铜绿假单胞菌的总代谢活性。结果电镜观察证实异绿原酸可破坏早期混合生物被膜结构使胞外基质减少;且异绿原酸联合抗生素组较单纯抗生素联合组对混合菌体的抑制作用更加明显,使载体上生物被膜的量明显降低。结晶紫染色法提示:250、500、1000μg/ml异绿原酸组总被膜定量与250、500、1000μg/ml异绿原酸联合伏立康唑+头孢他啶组、伏立康唑+头孢他啶组、空白对照组及组间两两比较,差异均有统计学意义(P混合生物被膜,异绿原酸联合抗生素组与空白组、异绿原酸组相比,联合用药组的代谢活性明显减低(抑制率达50%)。结论异绿原酸在体外不能杀死铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物被膜内菌体,但对早期铜绿假单胞菌-烟曲霉混合生物被膜具有破坏作用,使得异绿原酸联合伏立康唑+头孢他啶对早期混合生物被膜的破坏作用明显强于伏立康唑联合头孢他啶组,且均呈浓度依赖性。

关键词：铜绿假单胞菌烟曲霉混合生物被膜异绿原酸伏立康唑头孢他啶

副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程研究

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微生物学报 2018年第10期58卷 1808-1816页

作者：董旭日柴旭锋檀玲齐家伟刘海泉潘迎捷赵勇上海海洋大学食品学院上海201306 农业部水产品贮藏保鲜质量安全风险评估实验室上海201306 上海水产品加工及贮藏工程技术研究中心上海201306

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌... 详细信息

【目的】研究副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibriocholera,VC)混合生物被膜的形成过程。【方法】在4、8、12、24、36、48、60、72 h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过荧光原位杂交(FISH)观察混合生物被膜形成。【结果】虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御不适应环境中起重要作用,通过FISH可观察到不同时期生物被膜的变化过程。【结论】VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。研究混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。

关键词：副溶血性弧菌霍乱弧菌混合生物被膜荧光原位杂交

铜绿假单胞菌密度感应系统对铜绿假单胞菌-烟曲霉菌早期混合生物被膜的体外作用研究

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中华医院感染学杂志 2019年第7期29卷 961-965,970页

作者：李更森孔晋亮罗劲包崇喜丁雨迪王可蔡双启广西医科大学第一附属医院呼吸与危重症医学科广西南宁530021

目的探讨铜绿假单胞菌密度感应系统(QS)对早期铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜(BF)的体外影响。为临床相关混合微生物感染的治疗提供依据。方法体外建立野生型铜绿假单胞菌(PAO1)和铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株(P.aΔlasI/rhlI)分... 详细信息

目的探讨铜绿假单胞菌密度感应系统(QS)对早期铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜(BF)的体外影响。为临床相关混合微生物感染的治疗提供依据。方法体外建立野生型铜绿假单胞菌(PAO1)和铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株(P.aΔlasI/rhlI)分别与临床分离的烟曲霉菌株(A.f)形成混合BF,及单独野生型铜绿假单胞菌(PAO1)、铜绿假单胞菌密度感应缺陷菌株(P.aΔlasI/rhlI)、烟曲霉菌生物被膜,pH为7.0的RPMI-1640组作为空白对照组,于孵育24h,用结晶紫染色法半定量检测生物被膜形成能力;二甲氧唑黃(XTT)比色法评价生物被膜体外生长动力学;正置电子显微镜及扫描电镜观察生物被膜表面形态。结果结晶紫染色法半定量检测24h生物被膜形成能力提示,P.aΔlasI/rhlI+A.f混合生物被膜厚度大于其他各组(P混合生物被膜厚度与单纯烟曲霉生物被膜组比较差异无统计学意义;XTT比色法生长动力学检测显示,P.aΔlasI/rhlI+A.f混合组活力强于PAO1+A.f组(P生物被膜表面形态提示,镜下P.aΔlasI/rhlI+A.f混合生物被膜中可见烟曲霉菌丝密度大于PAO1+A.f组,PAO1+A.f组菌丝密度较单独A.f组减少。结论 QS对野生型铜绿假单胞菌(PAO1)+烟曲霉菌株(A.f)早期混合生物被膜的形成起抑制作用。

关键词：铜绿假单胞菌烟曲霉菌密度感应系统混合生物被膜

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副溶血性弧菌和霍乱弧菌混合生物被膜的形成

副溶血性弧菌和霍乱弧菌混合生物被膜的形成

作者：董旭日上海海洋大学

学位级别：硕士

细菌生物被膜(Bacterial Biofilm)是许多细菌粘附在生物或非生物表面后,分泌胞外多糖(EPS)、蛋白质、脂质和DNA等复合物,并将细菌包裹其中而形成的膜状物,是细菌为了适应自然环境、利于自身生存的一种存在形态。自然界中的细菌大多能形... 详细信息

细菌生物被膜(Bacterial Biofilm)是许多细菌粘附在生物或非生物表面后,分泌胞外多糖(EPS)、蛋白质、脂质和DNA等复合物,并将细菌包裹其中而形成的膜状物,是细菌为了适应自然环境、利于自身生存的一种存在形态。自然界中的细菌大多能形成生物被膜,形成的生物被膜以混合生物被膜状态存在。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)和霍乱弧菌(Vibrio cholera,VC)是海产品中的重要食源性致病菌,。副溶血性弧菌和霍乱弧菌常常在水产品中共存,并能在水产品表面形成混合生物被膜,容易引起食品交叉污染,导致食品腐败或疾病传播的隐患,给食品安全带来极大威胁。因此研究副溶血性弧菌和霍乱弧菌形成的混合生物被膜,对食品中的有害生物被膜的控制具有重大意义。本研究以VC菌和VP菌为研究对象,首先,研究单培养VC菌、VP菌和混合菌生物被膜的形成过程,分别在4、8、12、24、36、48、60、72h测量生物被膜的形成;其次,研究了不同温度(4、15、25、37℃)和不同盐度(1、2、3、4、5、6、7%)条件下单培养VC菌、VP菌和混合菌的生物被膜形成;最后通过荧光定量PCR、荧光原位杂交研究电解水处理对单培养VC菌、VP菌和混合菌的生物被膜形成的影响,为有效控制VC菌、VP菌形成的混合生物被膜提供基础。1.副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜形成过程的研究在4h、8h、12h、24h、36h、48h、60h、72h测定单独条件下VP、VC及其混合后生物被膜的形成情况,通过结晶紫染色法、平板菌落计数法、测定胞外多糖、胞外蛋白,通过激光共聚焦显微镜(CLSM)观察单培养及混合条件下生物被膜的形成。虽然形成的混合生物被膜量介于VC和VP之间,但混合生物被膜在形成过程中,成熟期后生物被膜量的变化较小,对环境的抗性增强。混合生物被膜中拥有更多的活菌,混合生物被膜形成过程中胞外蛋白和胞外多糖的变化体现出其可能在对抵御逐渐不适应环境中起重要作用。VC与VP共同形成生物被膜的过程中,混合生物被膜总量虽然减少,但混合生物被膜中拥有更多的活菌,这可能引起更大的危害。混合生物被膜混合生物被膜形成过程中被膜的变化,可为有害生物被膜的控制提供基础。2.环境因素对副溶血性弧菌和霍乱弧菌生物被膜形成的影响通过研究不同温度(4、15、25、37 ℃)和不同盐度(1、2、3、4、5、6、7%)条件下单培养VC菌、VP菌和混合菌的生物被膜形成。结果表明,混合生物被膜在37 ℃条件下生物被膜的形成能力和生物被膜中的活菌数比单培养的VC菌和VP菌更多。在5%的盐度条件下混合菌形成的生物被膜同单培养的VC菌和VP菌相比,表现出了对高盐度的较强的抗性。混合生物被膜不仅生物被膜量更多,而且拥有更多的活菌。3.副溶血性弧菌-霍乱弧菌混合生物被膜的清除通过荧光定量PCR和荧光原位杂交(FISH)技术,研究电解水处理对单培养VC菌、VP菌及混合菌形成的生物被膜的影响。结果表明,同单培养的生物被膜相比,混合生物被膜对电解水的处理表现出了较强的抵抗力。荧光定量PCR的结果表明了混合生物被膜同单培养的生物被膜相比,在经过电解水处理后,混合生物被膜中细菌总量减少较少,未像单培养的VC菌和VP菌那样表现出显著性的减少。通过FISH观察混合生物被膜,结果表明混合生物被膜同单培养的生物被膜相比,未出现生物被膜显著性减少且未出现较大的孔洞状结构。表明混合生物被膜电解水处理是具有抗性的。

关键词：混合生物被膜环境因素副溶血性弧菌霍乱弧菌激光共聚焦荧光定量PCR 荧光原位杂交

副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜形成及光动力杀菌研究

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副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜形成及光动力杀菌研究

作者：檀利军上海海洋大学

学位级别：硕士

混合生物被膜在自然界和食品工业中广泛存在且难以清除,全世界每年因混合生物被膜的污染造成巨大的经济损失。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)与腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是海产品中常见的致病菌与腐败菌,容易在海... 详细信息

混合生物被膜在自然界和食品工业中广泛存在且难以清除,全世界每年因混合生物被膜的污染造成巨大的经济损失。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)与腐败希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)是海产品中常见的致病菌与腐败菌,容易在海产品表面共存形成混合生物被膜。因此迫切需要开发一种新型高效的杀菌技术来保障食品安全与公众健康。本文首先建立了一种高效的光动力(photodynamic inactivation,PDI)杀菌技术,研究了PDI分别对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌浮游态与被膜态的杀菌效果,进一步探究了副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜的形成,并评估了其对PDI的敏感性。结果表明混合生物被膜对PDI的敏感性较弱,因此在最后开发出一种提高PDI清除混合生物被膜效率的方法。本文各章节研究内容及对应结果如下所示:1.姜黄素介导的PDI分别对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的杀灭效果研究为了开发新型抗菌技术,本研究建立了一种高效的姜黄素介导的PDI技术。通过表征PDI处理前后的菌落总数、再生长能力、细菌表面形态变化、活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生以及定量生物被膜、细胞活力,并进一步分析生物被膜的结构参数等。结果表明,当姜黄素浓度分别为3.0μM与10μM,光照时间为8 min时,副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的菌落总数能降低7 Log CFU/m L以上。同时,姜黄素介导的PDI抗菌机制是通过产生大量的ROS,并最终导致细胞壁破损进而裂解死亡。此外,当姜黄素终浓度分别为30μM与50μM,光照时间为60 min时,对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌生物被膜的清除率分别为70%与62%。本研究为食品工业中新型PDI的设计开发提供了新的思路。2.副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜形成及其对PDI的敏感性研究在自然界和食品工业中,混合生物被膜是细菌的常见形式,物种间的相互作用决定了它们的结构功能和对外界环境压力的敏感性。因此,本研究在上一章的基础上,首先通过探究副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜的动态形成过程、微观形态观察、空间结构分布、胞外聚合物(Extracellular polymeric substances,EPS)与相关化学键的差异表达水平,并进一步阐明了其相互作用形成机制。最后评估了单一与混合生物被膜对PDI的敏感性差异。结果表明,副溶血性弧菌和腐败希瓦氏菌混合生物被膜间产生协同性相互作用。与单一生物被膜相比,混合生物被膜的总生物量、细胞活力、活菌数等显著高于单物种生物被膜。此外,空间定位结果表明:副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌共存于相互交织融合的空间分布,这种空间结构有利于微生物群落间的交流与互利共生,从而促进协同相互作用。较高的EPS和相关化学键的表达也是两者发挥协同作用的另一个重要原因。最后还发现混合生物被膜对PDI的敏感性显著弱于单一生物被膜,这与其存在协同相互作用密切相关。因此,本研究加深了对食源性致病菌与腐败菌混合生物被膜形成及其对PDI敏感性的了解,有助于进一步制定控制混合生物被膜的有效策略。3.PDI协同碱性电解水高效清除混合生物被膜的研究在上一章的结论中我们发现,副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜对PDI的敏感性较低。因此,迫切需要开发一种新型的PDI清除混合生物被膜的有效策略。本研究首次将PDI与电解水相结合,通过表征PDI结合碱性电解水处理前后混合生物被膜的总生物量、菌落总数、活菌数、再生能力与生长动力学等宏观层面分析;通过激光共聚焦显微镜观察并分析被膜的结构参数、原子力显微镜观察并分析其表面粗糙度等微观层面验证。结果发现:PDI结合碱性电解水对混合生物被膜的清除效率显著提高。紧接着探究了两者结合协同清除混合生物被膜机制与作用靶点,结果表明:PDI结合碱性电解水后表面张力增大利于光敏剂与生物被膜结合,产生更多的单线态氧从而提高杀菌效率。另外,PDI结合碱性电解水能有效破坏EPS与DNA。最后,将该技术应用到不锈钢与鱼鳞表面,结果同样表明该技术清除混合生物被膜的高效性。因此PDI结合碱性电解水是一种高效且实用的新型抗菌策略。综上所述:本研究首先建立了一种高效清除海产品中副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的新技术——姜黄素介导的光动力杀菌技术,为该技术的应用提供了理论依据;又因为在自然界和食品工业中混合生物被膜是细菌的主要存在形式,因此进一步探究了副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜形成并评估了其对光动力的敏感性,为制定控制混合生物被膜的有效策略提供了新的思路;最后开发出一种新型环保且能显著提高光动力清除混合生物被膜的新方法,从而为开发食品工业中有害菌的控制策略奠定了基础。本研究的结论未来有望在食品工业中大规模应用,彻底根除有害菌的污染,从而保证食品安全和公众健康。

关键词：光动力杀菌混合生物被膜相互作用碱性电解水

副溶血性弧菌-单增李斯特菌共培养下混合生物被膜形成及种间关系的研究

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副溶血性弧菌-单增李斯特菌共培养下混合生物被膜形成及种间关系...

作者：陈萍上海海洋大学

学位级别：硕士

生物被膜(biofilm)被定义为微生物黏附于固体表面并嵌入于自身分泌的胞外聚合物基质(Extracellular Polymeric Substances,EPS)所构成的微生物群落结构。该基质为内部细胞提供了保护作用,并有助于微生物吸收养分及粘附表面。生物被膜形... 详细信息

生物被膜(biofilm)被定义为微生物黏附于固体表面并嵌入于自身分泌的胞外聚合物基质(Extracellular Polymeric Substances,EPS)所构成的微生物群落结构。该基质为内部细胞提供了保护作用,并有助于微生物吸收养分及粘附表面。生物被膜形成是一种社会行为,细胞通过分泌小信号分子来调节细胞密度的变化,并通过负责初始黏附靶位点、生物被膜的生长和成熟的细胞功能的表达来做出反馈调节。在食品工业中,食品表面和设备表面(食品接触和非食品接触)容易形成生物被膜,腐败菌或病原菌生物被膜的形成能加速食品的腐败、增大设备损耗及导致食品安全问题,降低了食品品质和食品安全性。并且,在大多数情况下由两种或多种微生物混合存在,不同菌种之间存在的相互关系不同,形成的混合生物被膜特性也不同,因此不可以使用同一套控制策略,这对食品工业带来了极大的挑战和负担。因此研究混合生物被膜势在必行。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)是常见的水产源致病菌,人类感染了致病性的副溶血性弧菌后容易导致急性肠胃炎,甚至休克死亡。单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,LM)简称单增李斯特菌,广泛存在于各类食品种,人和动物感染后可导致脑膜炎、败血症,孕妇流产、死胎等疾病,发病者病死率高达30%～70%。中国的多项监测报告显示,中国沿海地区市售的水产品及市售冷冻鱼糜制品中能同时检测出高检出率副溶血性弧菌和较低检出率单增李斯特菌,这说明研究水产品中副溶血性弧菌的同时,单增李斯特菌也不可忽略。本研究主要以副溶血性弧菌(标准菌株ATCC17802和三文鱼中的分离菌株VP24)和单增李斯特菌(标准菌株ATCC19115和三文鱼中的分离菌株LM5)为研究对象,研究其非生物表面混合生物被膜的形成特性以及两种细菌间的相互关系。本研究能对未来制定预防水产品微生物源食品安全问题的策略提供理论参考。本文主要研究内容及研究结果如下:1.副溶血性弧菌和单增李斯特菌在冷藏温度(4℃)、常温(25℃)和人体温度(37℃)下的单、混合生物被膜形成本研究采用结晶紫染色法、q PCR绝对定量法、激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)和XTT还原法分析不同温度环境下形成单、混合生物被膜的能力、被膜中细胞数量的变化及被膜活性的差异。结果发现,单、混合生物被膜成熟的快慢受温度影响如下:37℃>25℃>4℃(副溶血性弧菌);25℃>37℃>4℃(单增李斯特菌);37℃>25℃>4℃(混合生物被膜)。当两物种混合培养形成混合生物被膜时,在25℃和37℃下均表现出混合生物被膜生物量减少,代谢活性降低,并且在成熟的混合生物被膜中副溶血性弧菌的活细胞数比单增李斯特菌活细胞数多出10倍。但是在4℃下,混合生物被膜形成与单增李斯特单物种生物被膜有类似的趋势。2.常温下副溶血性弧菌-单增李斯特菌混合生物被膜的结构特性及被膜基因表达本研究采用CLSM法(ISA-2软件分析)、荧光原为杂交(FISH)、扫描电镜(SEM)、RT-q PCR、Raman光谱分析和化学分析法研究常温下混合生物被膜的结构特点和相关基因表达分析。结构参数结果显示,相对于单物种生物被膜,混合生物被膜的生物体积减小约2倍,平均厚度低于单物种生物被膜的1/2,孔隙率增大约30%。通过荧光原位杂交观察到,在混合生物被膜中,大部分副溶血性弧菌能覆盖在单增李斯特菌上方,且由副溶血性弧菌形成的生物被膜体积比单增李斯特菌的多大约4х10μm,胞外多糖和蛋白显著减少;在副溶血性弧菌中被膜形成的相关基因aph A,opa R,oxy R基因表达下调,msh A无显著差异,单增李斯特菌的fla E,mot B,deg U,fla A基因显著下调。说明两菌共存时存在竞争相互关系,不利于混合生物被膜的形成,并且副溶血性弧菌对混合生物被膜的贡献率较大。3.单增李斯特菌上清培养液对副溶血性弧菌的生物被膜形成及细胞增殖的影响本研究采用结晶紫染色法、Biosreen测生长曲线、CLSM法、扫描电镜(SEM)、XTT还原法和RT-q PCR研究上清培养物中单增李斯特菌代谢物对副溶血性弧菌生物被膜形成及细胞增殖的影响。通过采用单增李斯特菌和副溶血性弧菌上清培养液对两细菌进行独立互养生物被膜,结果发现,单增李斯特菌的上清培养液有利于副溶血性弧菌生物被膜形成和细胞增殖,表现在副溶血性弧菌生物被膜生物量的显著增多、代谢活性增强,被膜孔隙率非常小,最大比生长速率增大,群体感应基因msh A基因上调25倍,伴有aph A、Opa R基因略微下调;而副溶血性弧菌上清培养液液却抑制单增李斯特菌生物被膜的形成。

关键词：混合生物被膜副溶血性弧菌单增李斯特菌种间关系

异绿原酸对烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜体外作用研究

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异绿原酸对烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜体外作用研究

作者：李更森广西医科大学

学位级别：硕士

一烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜体外模型建立目的收集临床分离的烟曲霉菌株,与野生型铜绿假单胞菌混合制备成体外混合生物被膜,模型制备成功。为后续实验研究做准备。方法收集临床分离的烟曲霉菌株,并由广西医科大学第一附属医院临... 详细信息

一烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜体外模型建立目的收集临床分离的烟曲霉菌株,与野生型铜绿假单胞菌混合制备成体外混合生物被膜,模型制备成功。为后续实验研究做准备。方法收集临床分离的烟曲霉菌株,并由广西医科大学第一附属医院临床微生物检验中心鉴定。以RPMI-1640作为培养基,无菌玻璃细胞爬片作为载体。于混合生物被膜建立前16-18小时调制烟曲霉孢子悬液置于24孔板中,之后用磷酸盐缓冲液冲洗孔板洗掉浮游菌,将野生型铜绿假单胞菌増菌过夜后调制1×10ml-1等体积加入各孔。建立体外混合生物被膜。于建模24小时后取出载体,混合生物膜用扫描电镜观察表面结构。结果烟曲霉临床菌株可以与野生型铜绿假单胞菌形成体外混合生物被膜。结论烟曲霉菌株在适当条件下可以与野生型铜绿假单胞菌形成混合生物被膜,通过扫描电镜观察:野生型铜绿假单胞菌黏附于烟曲霉菌丝上,可以在体外成功构建两者混合生物被膜且用于后续研究。二铜绿密度感应系统对烟曲霉-铜绿混合生物膜的体外作用研究目的通过野生型铜绿假单胞菌及两种密度感应缺陷菌株分别与烟曲霉菌株形成的混合生物被膜的比较,探讨铜绿密度感应系统对混合生物被膜的体外作用。方法收集临床分离的烟曲霉菌株,以RPMI-1640作为培养基,无菌玻璃细胞爬片作为载体。于混合生物被膜建立前16-18小时调制烟曲霉孢子悬液浓度为1×106 ml-1置于24孔板中,其中一组作为对照组(不加铜绿),之后用磷酸盐缓冲液冲洗孔板洗掉浮游菌,将野生型铜绿假单胞菌(PAO1)、及两种密度缺陷菌株P.aΔLas I/Rhl I、P.aΔLas R/Rhl R増菌过夜后均调制浓度为1×106 ml-1等体积加入各孔。建立体外烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜模型。于建模24小时后取出载体,通过结晶紫半定量原位染色法测四组载体上生物总量;激光共聚焦及扫描电镜观察四组混合生物被膜表面形态。结果两种密度感应缺陷菌株与烟曲霉菌形成的混合生物被膜的总量及镜下所见混合后菌丝密度均明显高于野生型铜绿假单胞菌与烟曲霉形成的混合生物被膜量。结论铜绿假单胞菌相关的QS密度感应系统能够影响铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜的形成总量及菌丝的生长,且在其中起到了一定的抑制作用。三异绿原酸对烟曲霉-铜绿混合生物被膜的体外破坏作用目的探讨异绿原酸及其联合两性霉素B、美罗培南对烟曲霉-铜绿假单胞菌混合生物被膜的体外破坏作用,为进一步研究针对能破坏铜绿假单胞菌、烟曲霉菌混合感染患者的药物治疗奠定基础。方法96孔板微量液基稀释法分别测定异绿原酸、美罗培南、两性霉素B对野生型铜绿假单胞菌浮游菌、烟曲霉孢子悬液的最低抑菌浓度、最低杀菌浓度、最低杀真菌浓度;微量棋盘格法测两性霉素B联合美罗培南对烟曲霉-野生型铜绿假单胞菌混合生物被膜的最有效抑菌浓度时两两联合的药物组合剂量;24孔板测定不同剂量的异绿原酸联合两性霉素B、美罗培南对混合生物被膜的抑制率。试验分为空白组(仅含有培养液)、阴性对照组(混合生物被膜不加药物)、异绿原酸组(250μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L)、异绿原酸(250μg/m L、500μg/m L、1000μg/m L)联合两性霉素B、美罗培南组、两性霉素B联合美罗培南组。结晶紫半定量法检测载体上生物总量;XTT减低法测定各组混合生物被膜的代谢活性;激光共聚焦显微镜及扫描电镜观察各组混合生物被膜表面形态。结果各实验组药物作用于混合生物被膜24小时后结晶紫半定量检测结果显示:1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组的OD590比单用1000μg/m L异绿原酸组及两性霉素B+美罗培南组低,差异具有统计学意义(P﹤0.05)。XTT减低法结果显示:1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组分别与对阴性照组组、两性霉素B联合美罗培南组、1000μg/m L异绿原酸组相比,明显减低了混合生物被膜的代谢活性。激光共聚焦显微镜观察:1000μg/m L异绿原酸作用时,混合BF无论胞外基质还是菌丝密度、活力均较阴性对照组有轻度减少;1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组较阴性对照组比较混合生物被膜菌丝密度及活力以及胞外多糖较阴性对照组明显减少,可见较多死亡菌丝,菌丝密度变得稀疏,菌丝数量减少。扫描电镜观察:1000μg/m L异绿原酸单用时混合生物被膜的胞外基质、菌丝密度较阴性对照组略减少;1000μg/m L异绿原酸联合两性霉素B+美罗培南组较阴性对照组混合生物被膜的菌丝密度、附着的铜绿假单胞菌密度及胞外基质均明显减少,残存的菌丝变瘪。结论异绿原酸对于体外构建的野生型铜绿假单胞菌-烟曲霉菌混合生物被膜具有减少其胞外基质产生的作用。联合应用异绿原酸与两性霉素B+美罗培南,对混合生物被膜内烟曲霉生长出的菌体和所形成的菌丝的杀真菌作用及对混合生物被膜中铜绿假单胞菌的杀细菌作用都会明显增强。异绿原酸与两性霉素B及美罗培南对烟曲霉-

关键词：烟曲霉铜绿假单胞菌混合生物被膜形态学 QS密度感应系统烟曲霉菌异绿原酸两性霉素B 美罗培南