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S1P通过S1PR1/IκBα/NF-κB途径促炎症诱导HLEC管形成

S1P通过S1PR1/IκBα/NF-κB途径促炎症诱导HLEC管形成

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作者：郑治南华大学

学位级别：硕士

【背景、目的】炎症诱导的淋巴管生成是一种被广泛接受的概念。在健康的成年人中,淋巴管系统是稳定的。然而,在炎症条件下淋巴管发生急性扩张。动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程。在动脉粥样硬化的早期阶段,外膜淋巴管的密度随着疾病的... 详细信息

【背景、目的】炎症诱导的淋巴管生成是一种被广泛接受的概念。在健康的成年人中,淋巴管系统是稳定的。然而,在炎症条件下淋巴管发生急性扩张。动脉粥样硬化是一种慢性炎症过程。在动脉粥样硬化的早期阶段,外膜淋巴管的密度随着疾病的程度加重而增加,但具体机制尚不清楚。随着研究的进展,淋巴管功能的激活一方面不仅干预着炎症过程。另一方面,斑块胆固醇的逆向转运也依赖于淋巴管运输。近期研究表明鞘氨醇-1-磷酸(S1P)不仅与动脉粥样硬化的慢性炎症过程密切相关,而且还影响血管生成。因此,本论文的目的是探究S1P是否通过炎症影响淋巴管的生成及其机制。【实验方法】(1)将人原代淋巴内皮细胞(HLECs)放在含有10%胎牛血清(FBS)的DMEM中生长(5%CO,37℃),并在第2代和第8代之间使用。在用试剂处理细胞之前,先将细胞放在含有1%FBS的DMEM中饥饿培养10 h。然后再将细胞与不同浓度的S1P(0、50、100、200和400 nM)共同孵育24 h。使用CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕法检测细胞迁移以及基质胶小管形成法检测细胞小管形成。(2)不同浓度的S1P(0、50、100、200和400 nM)与细胞共同孵育24 h。同一浓度的S1P(200 nM)孵育HLECs不同时间(0 h、6 h、12 h和24 h)。ELISA检测IL-1β和TNF-α的分泌水平。此外,Western blot检测IL-1β和TNF-α的蛋白表达水平。接下来,用不同浓度的S1P(0、50、100、200和400nM)处理细胞,Western blot和ELISA检测VEGF-C和VEGF-D的蛋白表达水平。(3)使用DharmaFECT 3 Transfection Reagent将靶向IL-1βsiRNA和TNF-αsiRNA转染到HLECs中。转染24 h后用S1P处理细胞相应时间,使用CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕法检测细胞迁移以及基质胶小管形成法检测细胞管形成。同时,使用IL-1β(10 ng/ml)或TNF-α(10 ng/ml)单独处理细胞,划痕实验检查细胞迁移、基质胶小管形成法检测细胞管形成。(4)Real-time PCR和Western blot检测常态下细胞中S1P受体的表达模式。(5)分别用W146(S1PR1的选择性拮抗剂)、CAY-10444(S1PR3的特异性拮抗剂)、VPC23019(S1PR1/S1PR3的特异性拮抗剂)、S1PR1 siRNA以及S1PR3 siRNA预处理细胞,再与S1P共孵育。ELISA检测IL-1β和TNF-α的分泌水平。此外,Western blot检测IL-1β和TNF-α的蛋白水平。(6)培养HLECs,分别用S1PR1拮抗剂(W146)或NF-κB抑制剂(BAY11-7082)处理细胞30分钟后,再与S1P一起共温育。Western blot检测IκBα、p-IκBα、NF-κB P65和p-P65蛋白水平,免疫荧光检测NF-κB核移位。(7)分别用W146或BAY11-7082处理细胞,细胞划痕法检测细胞迁移,基质胶小管形成法检测细胞管形成。ApoE小鼠高脂肪饮食(HFD)制造动脉粥样硬化模型。治疗组小鼠每天腹腔注射5 mg/kg芬戈莫德(FTY720,S1P的类似物)、W146组每天腹腔注射22.4 mg/kg、BAY11-7082组每天腹腔注射5mg/kg。三个月后处死小鼠,取出小鼠的主动脉(升主动脉),免疫组织化学检测升主动脉外膜淋巴管数量。【结果】(1)S1P促进淋巴内皮细胞增殖、迁移和小管形成,并在200 nM观察到最佳效应。(2)S1P以剂量和时间方式促进HLECs中TNF-α和IL-1β水平增加,并且在200 nM和12 h时观察到最大效应。S1P不影响HLECs中VEGF-C和VEGF-D蛋白水平变化。(3)S1P诱导HLEC增殖、迁移和管形成,转染TNF-αsiRNA或IL-1βsiRNA后,发现S1P诱导的HLEC增殖、迁移和管形成能力减弱。单独使用TNF-α或IL-1β后,发现细胞增殖、迁移以及管形成能力减弱。(4)HLECs主要表达S1PR1和S1PR3,不表达S1PR2。(5)用W146(S1PR1拮抗剂)、VPC23019(S1PR1/S1PR3拮抗剂)和S1PR1 siRNA处理HLECs可显著抑制S1P诱导的TNF-α和IL-1β释放,但CAY-10444(S1PR3特异性拮抗剂)对TNF-α和IL-1β的释放无明显影响。(6)S1P显著增加HLECs中IκBα和NF-κB P65磷酸化水平。另外,W146或S1PR1 siRNA阻断S1P处理的细胞中NF-κB P65的磷酸化。使用W146或NF-κB抑制剂(BAY11-7082)来处理细胞发现HLECs中

关键词：鞘氨醇-1-磷酸淋巴内皮细胞管形成炎症动脉粥样硬化

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