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酚化合物对胰岛素淀粉样纤维化的抑制作用

高等学校化学学报 2015年第7期36卷 1310-1314页

作者：张玉洁曹娜曾成鸣陕西师范大学化学与化工学院西安710119

采用牛胰岛素作为模型多肽分子,对几种结构相近的简单多酚的抗多肽淀粉样纤维化作用进行了研究.结果表明,邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化具有抑制作用,并通过形成醌中间体对多肽链进行修饰,与对苯醌作用类似;而苯酚和间二苯酚在相同... 详细信息

采用牛胰岛素作为模型多肽分子,对几种结构相近的简单多酚的抗多肽淀粉样纤维化作用进行了研究.结果表明,邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化具有抑制作用,并通过形成醌中间体对多肽链进行修饰,与对苯醌作用类似;而苯酚和间二苯酚在相同条件下,既不能修饰多肽也无抑制纤维化作用.在无氧条件下,邻苯二酚和对苯二酚对胰岛素纤维化的抑制作用明显降低,说明酚化合物经氧化形成的醌中间体是其抗胰岛素纤维化的主要活性结构.

关键词：酚化合物胰岛素淀粉样纤维化醌醌修饰肽

盐酸小檗碱对牛血清白蛋白淀粉样纤维化聚集的影响作用及机制研究

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徐州工程学院学报（自然科学版） 2022年第1期37卷 36-40页

作者：韩晓乐刘晨音于帆朱佳骅胡军成中南民族大学化学与材料科学院湖北武汉430074

以牛血清白蛋白为模型,探究了盐酸小檗碱(BH)对牛血清白蛋白(BSA)淀粉样纤维化的影响及作用机制.研究结果表明:盐酸小檗碱通过与BSA内部氨基酸残基发生非共价结合,稳定蛋白质的α-螺旋结构,从而抑制蛋白质的错误折叠,降低其纤维化聚集... 详细信息

以牛血清白蛋白为模型,探究了盐酸小檗碱(BH)对牛血清白蛋白(BSA)淀粉样纤维化的影响及作用机制.研究结果表明:盐酸小檗碱通过与BSA内部氨基酸残基发生非共价结合,稳定蛋白质的α-螺旋结构,从而抑制蛋白质的错误折叠,降低其纤维化聚集的程度,作用效果与药物浓度呈现正相关.

关键词：盐酸小檗碱牛血清白蛋白淀粉样纤维化二级结构错误折叠

表没食子儿茶素(EGC)对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用

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化学研究与应用 2014年第5期26卷 696-700页

作者：李改涛李圆圆曾成鸣陕西师范大学化学化工学院陕西西安710062

天然多酚化合物是蛋白质淀粉样纤维化相关疾病的潜在治疗药物。本文采用溶菌酶和表没食子儿茶素(EGC)研究了多酚化合物对蛋白质淀粉样纤维的作用。结果表明,EGC能够抑制溶菌酶的淀粉样纤维化,并能够破坏成熟的纤维结构,使纤维的淀粉样... 详细信息

天然多酚化合物是蛋白质淀粉样纤维化相关疾病的潜在治疗药物。本文采用溶菌酶和表没食子儿茶素(EGC)研究了多酚化合物对蛋白质淀粉样纤维的作用。结果表明,EGC能够抑制溶菌酶的淀粉样纤维化,并能够破坏成熟的纤维结构,使纤维的淀粉样特性降低。巯基化合物二巯基苏糖醇(DTT)能够部分抑制EGC破坏纤维的作用,表明EGC可能通过与巯基结合而对多肽链进行共价修饰,从而改变了淀粉样纤维的自组装结构。根据上述结果,我们认为,多酚化合物形成醌类中间体并对多肽链的自由巯基进行修饰,是其抑制蛋白质淀粉样纤维化的主要途径。

关键词：表没食子儿茶素溶菌酶淀粉样纤维化巯基共价修饰

1,4-二巯基苏糖醇对溶菌酶淀粉样纤维化的抑制作用

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化学研究与应用 2013年第5期25卷 665-669页

作者：李杰曾成鸣陕西师范大学化学化工学院陕西西安710062

蛋白质淀粉样纤维化是很多人类疾病的重要特征,筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂对于研究和开发相关疾病的治疗药物具有重要意义。本文采用溶菌酶作为模型,探索巯基化合物1,4-二巯基苏糖醇(DTT)对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用。结果表明... 详细信息

蛋白质淀粉样纤维化是很多人类疾病的重要特征,筛选蛋白质淀粉样纤维化的抑制剂对于研究和开发相关疾病的治疗药物具有重要意义。本文采用溶菌酶作为模型,探索巯基化合物1,4-二巯基苏糖醇(DTT)对蛋白质淀粉样纤维化的抑制作用。结果表明,DTT对溶菌酶淀粉样纤维化具有较强的抑制作用,其IC50数值为17μmol.L-1。DTT抑制溶菌酶纤维化的作用与其巯基结构有关。在溶菌酶分子高级结构改变产生聚集和纤维化的过程中,DTT分子的巯基通过与溶菌酶的二硫键作用改变了多肽的构象,从而改变了溶菌酶纤维化的进程。

关键词：溶菌酶淀粉样纤维化 1,4-二巯基苏糖醇谷胱甘肽半胱氨酸二硫键

硫酸钠对胰岛素淀粉样纤维化及其细胞毒性的作用

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化学研究与应用 2012年第1期24卷 54-58页

作者：陈云霞谢富瑞谢庆斯徐润杨吴胜男曾成鸣陕西师范大学化学与材料科学学院陕西西安710062 陕西师范大学生命科学学院陕西西安710062

超过20种人类疾病与蛋白质或者多肽淀粉样纤维化密切相关,探究影响蛋白质的结构稳定性及其淀粉样纤维化的环境条件具有重要意义。本文采用牛胰岛素作为模型蛋白质,研究了Na2SO4对蛋白质淀粉样纤维化的作用。实验结果表明,不同浓度的Na2... 详细信息

超过20种人类疾病与蛋白质或者多肽淀粉样纤维化密切相关,探究影响蛋白质的结构稳定性及其淀粉样纤维化的环境条件具有重要意义。本文采用牛胰岛素作为模型蛋白质,研究了Na2SO4对蛋白质淀粉样纤维化的作用。实验结果表明,不同浓度的Na2SO4对胰岛素淀粉样纤维化过程具有不同的影响,低浓度条件下可促进纤维化,较高浓度可明显抑制淀粉样纤维的形成,更高的浓度则使胰岛素形成非纤维状聚集体。ANS荧光分析结果表明,所有浓度的Na2SO4均可减小胰岛素聚集体的表面疏水性,并导致聚集体对细胞膜的损害作用降低。Na2SO4的上述作用可能与其改变蛋白质分子间的静电作用力及溶剂效应有关。

关键词：牛胰岛素淀粉样纤维化硫酸钠细胞毒性

抑制蛋白质淀粉样纤维化的活性化合物筛选评价及作用机理研究

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抑制蛋白质淀粉样纤维化的活性化合物筛选评价及作用机理研究

作者：靳力聊城大学

学位级别：硕士

蛋白质淀粉样纤维化是指在机体代谢紊乱或病理的条件下,一些蛋白质受内源性或外源性因素的诱导会发生异常的构象转变,错误折叠形成不溶性的淀粉样纤维或聚集体。这些纤维聚集体的沉积能够诱导细胞凋亡,引起多种病理学特征,并最终导致阿... 详细信息

蛋白质淀粉样纤维化是指在机体代谢紊乱或病理的条件下,一些蛋白质受内源性或外源性因素的诱导会发生异常的构象转变,错误折叠形成不溶性的淀粉样纤维或聚集体。这些纤维聚集体的沉积能够诱导细胞凋亡,引起多种病理学特征,并最终导致阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)和II型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)等多种淀粉样蛋白相关疾病。因此,抑制蛋白质淀粉样纤维化被认为是治疗淀粉样蛋白相关疾病的重要策略。近年来,对于蛋白质淀粉样纤维化抑制剂的研究颇多,其中小分子化合物被认为具有广泛的应用前景。目前关于小分子抑制剂的研究主要集中在多酚和黄酮类的天然化合物领域,而很少涉及针对上市化学药物的再评价研究。与一些天然化合物相比,已上市化学药物在代谢动力学、安全性、毒性等方面已得到广泛的研究。因此,基于“老药新用”的理念,将已上市化学药物重新定位用于抗淀粉样纤维化和治疗淀粉样蛋白相关疾病,可以有效节省研发时间和成本,具有更高的成药性前景。本文使用经典模型蛋白人溶菌酶(Human lysozyme,HL)构建了体外淀粉样纤维化模型,对上市的化学药物进行抑制活性筛选,初步得到了恩他卡朋(Entacapone,Ent)、卡托普利(Captopril,CAP)和西咪替丁(Cimetidine,Cim)三个活性化合物;之后,通过光谱学实验和显微镜成像技术系统评价了Ent、CAP和Cim对HL淀粉样纤维化的抑制作用;最后,通过荧光光谱法、二维核磁共振波谱法结合分子对接模拟研究了Ent、CAP和Cim与HL的相互作用,探讨其发挥抑制作用的潜在机理。本论文主要包括以下三个部分:第一部分:通过硫黄素-T(Thioflavin-T,Th T)荧光法、8-苯胺-1-萘磺酸(8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid,ANS)荧光法、刚果红(Congo red,CR)紫外光谱法、瑞利光散射法、动态光散射法和原子力显微镜(Atomic force microscopy,AFM)成像技术研究了Ent对HL淀粉样纤维化的影响。光谱学的研究结果表明,Ent能通过减少β-折叠结构的形成、疏水区域暴露的程度以及纤维聚集体的粒径大小来抑制HL淀粉样纤维的形成,同时降低了HL纤维化动力学过程的速率常数,并延长了纤维形成的滞后时间。AFM可以直接观察到Ent存在时HL丝状纤维的数量和长度明显减少。此外,通过荧光猝灭法和分子对接模拟研究表明,Ent与HL活性口袋的Glu35、Asp53、GIn58、Trp64、Ala108和Trp109氨基酸残基相互作用,并通过氢键作用力与HL的Glu35和Asp53氨基酸残基直接结合。二维核磁共振波谱实验的结果进一步发现,HL的Trp64和Trp109氨基酸残基在与Ent的结合中起着重要作用,与分子对接结果有很高的相关性。第二部分:通过多种生物物理和显微镜成像相结合的方法研究了CAP对HL淀粉样纤维化的影响。Th T和CR光谱学实验结果表明,CAP呈浓度依赖的方式阻止了HL淀粉样纤维的形成,圆二色(Circular dichroism,CD)光谱实验结果表明,CAP减弱了HL从天然的α-螺旋构象向富含β-折叠结构的HL纤维转变。通过动态光散射法、瑞利光散射法和浊度法检测,我们发现,CAP能够降低HL纤维聚集体的粒径大小,延缓了HL纤维的形成。基于AFM和透射电子显微镜(Transmission electron microscope,TEM)的可视化观察,进一步证实了CAP存在时HL纤维的数量和长度明显减少。通过MTT实验,我们发现CAP降低了HL纤维诱导的细胞毒性,提高了细胞的存活率。蛋白质-配体相互作用的研究结果表明,CAP以静态猝灭的方式与HL相互作用,并通过氢键作用力与HL活性口袋中的Glu35和Ala108氨基酸残基直接结合,形成了稳定的CAP-HL复合物。第三部分:通过光谱学实验、显微镜成像以及分子对接模拟相结合的方法研究了Cim对HL淀粉样纤维化的影响。各种光谱学实验结果表明,Cim以浓度依赖的方式抑制HL的淀粉样纤维化。通过TEM可视化进一步证实了光谱学的结论,Cim的加入可以使HL纤维的长度明显缩短,直的和长的纤维数量显著减少。通过荧光猝灭法和分子对接研究了Cim与HL之间的相互作用,结果表明Cim以静态猝灭的方式与HL相互作用,氢键和范德华作用力在Cim-HL复合物的形成过程中起主要作用。综上,本文基于体外模型对上市药物进行了淀粉样纤维化活性再评价,并深入研究了Ent、CAP和Cim等三种药物的作用机理。结果发现,Ent、CAP和Cim能够通过多种作用力与HL易聚集倾向区域的关键氨基酸残基结合,形成的蛋白质-配体复合物维持了HL的构象稳定性,从而起到了抑制HL淀粉样纤维化的作用。本文取得的研究

关键词：淀粉样纤维化蛋白质溶菌酶恩他卡朋卡托普利西咪替丁抑制作用相互作用

十二烷基磺酸钠（SDS）对蛋白质淀粉样纤维化的作用

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十二烷基磺酸钠（SDS）对蛋白质淀粉样纤维化的作用

作者：张银娟陕西师范大学

学位级别：硕士

蛋白质是维持人体生命活动的重要物质,具有正确的空间构象是其发挥正常生理功能的先决条件。蛋白质的三维结构一旦被改变,就可能导致生物活性改变,甚至引发疾病。迄今为止,二十多种人类疾病被发现与蛋白质空间结构的错误折叠有关,如p淀... 详细信息

蛋白质是维持人体生命活动的重要物质,具有正确的空间构象是其发挥正常生理功能的先决条件。蛋白质的三维结构一旦被改变,就可能导致生物活性改变,甚至引发疾病。迄今为止,二十多种人类疾病被发现与蛋白质空间结构的错误折叠有关,如p淀粉样肽因错误折叠导致的纤维化是阿尔兹海默氏疾病的重要特征;α-核蛋白的淀粉样沉积与帕金森疾病有关等等,这些疾病的共同特征之一就是与之相关的蛋白质在一定条件下发生了淀粉样纤维化。研究表明,蛋白质纤维化主要经历三个过程,即滞后期→生长期→成熟期。但也有少数蛋白的纤维化过程不依赖于“核”,即无滞后期。蛋白质在纤维化过程中,其高级结构α-螺旋结构减少,β-折叠结构增加,分子内部疏水基团逐渐外露,这些性质与淀粉样纤维的物理化学性质及其细胞毒性密切相关。寻找淀粉样沉积相关疾病治疗药物的主要策略之一就是筛选那些能够抑制多肽淀粉样纤维化并破坏纤维结构的小分子化合物。不同化合物的抗纤维化作用可能经历不同的分子机制,作用于纤维化过程中的不同环节,深入研究各类小分子化合物的抗多肽淀粉样纤维化作用,可以为抗淀粉样变性疾病提供新的有效先导药物结构。本文选取牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)作为实验研究的模型蛋白质,探究其在不同条件下的纤维化过程,以及表面活性剂十二烷基磺酸钠(Sodium dodecyl sulfonate, SDS)在不同条件下对蛋白质纤维化的抑制作用和作用机理。研究的主要内容包括：BSA在不同pH条件下纤维化过程,SDS和SDS类似物对BSA纤维化过程的影响,并通过内源荧光、电泳等实验手段探究这些小分子化合物与BSA作用的分子机制。实验方法及实验结果：1.BSA的淀粉样纤维化采用硫磺素T (Thioflavine T, ThT)、8-苯胺基-1-萘磺酸(1-anilino-naphthalene-8-sulfonate,ANS)荧光标记技术、圆二色谱(CD)检测的BSA纤维化过程中结构的变化,透射电子显微镜(TEM)及电泳技术观察纤维化过程中的形态改变。实验结果表明,BSA在pH 7.4和pH 3.0环境下均能够形成淀粉样纤维,纤维化过程伴随p-折叠结构增加,α-螺旋结构减少,表面疏水性减弱,没有成核期。形成的BSA纤维呈现密集、交叉的形态,与通常的无分支结构的淀粉样纤维有所不同。电泳分析表明这些纤维聚集体具有共价和非共价结合两种方式。比较而言,在pH3.0环境下纤维达到成熟期所需的时间较长,内源荧光分析结果表明可能与低pH环境下蛋白质包裹更加紧密有关。2.SDS对BSA纤维化过程的影响SDS在pH 7.4和pH 3.0环境下均能抑制BSA的纤维化,且在一定浓度范围内,SDS的浓度与其抑制作用成正比。不同的是相同浓度的SDS在不同环境下表现出来的抑制作用不同,即pH 3.0时相对较弱。通过测定SDS在不同环境下对BSA内源荧光的作用,计算SDS与BSA的结合常数及结合位点数,证实SDS在pH 7.4环境与BSA具有更高的结合常数,结合比例为1：1。3.SDS类似物对BSA纤维化的抑制作用SDS是一种阴离子表面活性剂,一端为亲水的磺酸钠,另一端为疏水的直链烷烃.SDS可能通过疏水或者静电作用抑制BSA的纤维化。为此本文选取了几种与SDS结构类似的物质(己烷基磺酸钠、辛烷基磺酸钠、癸烷基磺酸钠、十四烷基磺酸钠、十六烷基磺酸钠、十二酸钠),通过这些化合物的作用探索这类物质抑制BSA纤维化的作用机制。实验结果表明,在pH 7.4环境下,SDS主要通过疏水作用力与BSA作用,进而抑制纤维化,当疏水链的C原子数目小于10时,相同浓度的物质对BSA纤维化的抑制作用与其C原子数目成正比;当C原子数目等于或大于10时,相同浓度的物质对BSA纤维化的抑制作用基本相同。在pH 3.0环境下,十二酸钠可促进BSA的纤维化,可能的原因是羧基在酸性条件下主要以羧酸分子形式存在,此时羧基上的氢与周围的质子受体发生作用,从而促进蛋白质构象向易于纤维化的构象转变。结论：BSA在中性(pH 7.4)和弱酸性(pH 3.0)的环境下均能够形成淀粉样纤维。纤维生长不依赖于成核过程,同时伴随分子中α-螺旋结构减少、β-折叠结构增多、表面疏水性减弱等性质改变,最终形成的纤维呈现密集、具有分支结构的形态。比较而言,BSA在pH 3.0环境下纤维化的速率较小。阴离子表面活性剂SDS能够抑制BSA的纤维化,但相同浓度的SDS在不同pH环境下抑制作用不同。pH 7.4环境下SDS通过疏水作用与BSA结合抑制其纤维化,而在pH 3.0的环境下SDS与BSA间的结合力降低,导致抑制纤维化的作用减小。

关键词：牛血清白蛋白淀粉样纤维化抑制剂十二烷基磺酸钠疏水作用

氧化作用对蛋白质结构及其淀粉样纤维化行为的影响

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氧化作用对蛋白质结构及其淀粉样纤维化行为的影响

作者：孔丽秀陕西师范大学

学位级别：硕士

蛋白质分子是细胞活动的基础,正确的空间结构是其发挥正常生理功能的先决条件。在某些条件下,蛋白质可发生错误折叠而导致淀粉样纤维化。淀粉样纤维沉积是很多人类疾病,如亨廷顿氏病、糖尿病、帕金森病以及阿尔兹海默症等的共同特征之... 详细信息

蛋白质分子是细胞活动的基础,正确的空间结构是其发挥正常生理功能的先决条件。在某些条件下,蛋白质可发生错误折叠而导致淀粉样纤维化。淀粉样纤维沉积是很多人类疾病,如亨廷顿氏病、糖尿病、帕金森病以及阿尔兹海默症等的共同特征之一。尽管蛋白质在序列、长度、折叠状态、前体蛋白结构方面有很大的差异,但它们在发生错误折叠后形成的淀粉样纤维具有高度相似的结构,形成淀粉样纤维几乎是所有蛋白质的共性。研究表明,蛋白质淀粉样纤维化一般经历三个动力学过程,即形成具有淀粉样性质的晶核,在晶核的基础上延伸形成纤维以及转变为成熟纤维,分别对应于生长动力学曲线的滞后期、生长期和稳定期。很多因素如温度、酸度、离子强度、金属离子以及一些小分子化合物等都能够对蛋白质纤维化产生影响。对蛋白质的氧化也可以使蛋白质的结构和性能发生变化,从而影响其纤维化过程。本文以牛胰岛素和鸡蛋清溶菌酶为模型蛋白,分析氧化作用对蛋白质的结构及其淀粉样纤维化过程的影响,并对相关的分子机制以及纤维细胞毒性进行探索。主要研究方法及结果1.H2O2对蛋白质的氧化作用以H2O2作为氧化剂,与溶菌酶作用一定时间后,透析除去多余的H2O2,以纯溶菌酶作为对照,研究蛋白质的结构及纤维化行为的改变。紫外光谱显示,溶菌酶分子中的芳香族氨基酸不受H2O2氧化作用的影响;而内源荧光光谱证实,经H2O2作用后溶菌酶分子三级结构发生了变化,且三级结构的变化程度与H2O2浓度呈正相关。此外,蛋白质变性实验结果表明,氧化溶菌酶分子更易受到变性剂的作用,变性过程属于“多态模型”,而非氧化溶菌酶的变性过程则属于“三态模型”。与溶菌酶不同,牛胰岛素在H2O2的作用下,紫外光谱和内源荧光光谱都基本保持不变,质谱分析显示,牛胰岛素的氧化涉及一个加氧过程。2.经H2O2处理后蛋白的淀粉样纤维化行为本文主要采用ThT和ANS荧光标记、刚果红光谱和圆二色谱检测蛋白质的淀粉样纤维化过程。结果表明,非氧化胰岛素和溶菌酶在淀粉样纤维化生长过程中,ThT曲线呈“S”型,蛋白的α-螺旋逐渐减少,β-折叠和表面疏水性逐渐增加。与之比较,经H2O2氧化后,蛋白质淀粉样纤维化趋势明显下降。透射电子显微镜结果表明,孵育成熟的纯蛋白质纤维具有浓密的线状形态,而经过H2O2氧化后,纤维密度及长度均明显降低,说明H2O2对蛋白的氧化作用可抑制蛋白质的淀粉样纤维化。3.AAPH对蛋白质的氧化作用及其对蛋白质淀粉样纤维化的影响AAPH常被用作水溶性的自由基源。将AAPH作为另一种氧化剂加入到蛋白溶液中,在37℃下作用不同时间后,透析除去未反应的AAPH,并以纯蛋白作为对照。光谱数据表明,AAPH使蛋白质中的芳香族氨基酸发生氧化,导致紫外光谱和内源荧光发生变化,说明蛋白质的结构发生了改变。经AAPH氧化后,蛋白质淀粉样纤维化趋势明显减小。透射电子显微镜下,蛋白在孵育6天后可观察到大量聚集体颗粒,纤维密度明显减小,即蛋白的淀粉样纤维化过程被抑制。非变性电泳结果表明,经AAPH处理后,蛋白单体发生交联,产生多聚体,这种多聚体使蛋白的纤维化趋势降低。4.纤维的细胞毒性以人红细胞作为体外模型,探索并比较氧化和非氧化蛋白经孵育形成的聚集体的细胞毒性。结果表明,由非氧化蛋白形成的纤维具有较强的细胞溶血作用,而经H202和AAPH处理后,氧化蛋白形成的纤维聚集体对细胞的溶血作用明显降低,该结果在细胞形态观察中得到了进一步证实。结论:牛胰岛素和溶菌酶在经历H202和自由基的氧化作用后,其分子结构发生了改变,进而使蛋白质淀粉样纤维化过程发生变化。这些变化主要体现在延长了纤维形成的成核期,并降低了蛋白在淀粉样纤维化过程中聚集体的表面疏水性,从而使纤维的细胞毒性作用降低。虽然上述两种氧化剂对蛋白质的作用机制不同,但最终的结果都是蛋白质被氧化后,淀粉样纤维化行为得到了明显的抑制。其主要原因是氧化作用使蛋白质原有的构型发生变化,或者生成多聚体,从而使形成淀粉样纤维化的条件受阻。本文的结果对于进一步探索氧化胁迫条件下蛋白质淀粉样纤维化的分子机制具有重要意义。

关键词：溶菌酶牛胰岛素淀粉样纤维化氧化作用细胞毒性

重组人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其在淀粉样纤维化抑制剂筛选中的应用

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重组人溶菌酶在毕赤酵母中的表达及其在淀粉样纤维化抑制剂筛选中...

作者：高雯聊城大学

学位级别：硕士

人溶菌酶是人体中一种非特异性免疫因子,与人体具有天然相容性,对人体完全没有毒副作用,并具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用,在临床、食品工业和畜牧业等领域应用广泛,但目前仍未实现重组人溶菌酶高产菌株和规模化生产工艺的突破。除此之... 详细信息

人溶菌酶是人体中一种非特异性免疫因子,与人体具有天然相容性,对人体完全没有毒副作用,并具有抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用,在临床、食品工业和畜牧业等领域应用广泛,但目前仍未实现重组人溶菌酶高产菌株和规模化生产工艺的突破。除此之外,在阿尔兹海默症发病机制和药物研究中,由于人溶菌酶是含有多种典型二级结构和二硫键的蛋白,因此成为通过淀粉样纤维化进行抑制剂药物筛选的理想模型。基于此,本课题围绕重组人溶菌酶毕赤酵母高产菌株的构建表达与发酵工艺,以及人溶菌酶在淀粉样纤维化抑制剂筛选中的应用进行了研究。下面是两个方面研究工作的主要内容:(一)重组人溶菌酶毕赤酵母表达菌株的构建和发酵工艺研究本研究将含人溶菌酶基因的表达质粒p PIC9K通过电转化的方法整合到巴斯德毕赤酵母中,构建了人溶菌酶毕赤酵母工程菌株并进行表型鉴定,确定菌株为Mut型,进一步通过G418抗性筛选确定了一株高拷贝的人溶菌酶毕赤酵母重组菌株。同时,建立了高效液相色谱法检测人溶菌酶活性的方法,并进行方法学验证,该方法可完全替代生物法检测溶菌酶活性,提高了分析检测的效率和精确度。此外,本课题先在摇瓶水平对高拷贝人溶菌酶毕赤酵母菌株的发酵条件进行单因素实验,通过考察不同诱导时间、温度、甲醇含量、p H值及装液量对诱导表达人溶菌酶含量的影响,初步优化出重组人溶菌酶毕赤酵母菌株最佳的发酵条件为:将p H为5.5、装液量为25 m L的摇瓶(500 m L)放在28℃、转速为220 rpm的摇床中,诱导120 h,在诱导过程中甲醇诱导含量保持为2%,每24 h补充一次。接下来在发酵罐水平进行甲醇流加方式优化,以菌体量(干重、湿重)、酶活和SDS-PAGE为评价指标,考察了恒速流加、p H反馈流加、DO反馈流加和指数流加这四种甲醇补料方式对诱导表达人溶菌酶的影响。优化结果为在DO反馈流加的补料方式下,在28℃、p H5.5的发酵罐环境中,诱导132 h时人溶菌酶表达量最高,酶活能够达到49422.78 U/mg。该优化结果为毕赤酵母工业化诱导表达人溶菌酶工艺的开发提供了新的思路。(二)人溶菌酶在淀粉样纤维化及其抑制剂筛选中的应用蛋白淀粉样纤维化被认为是阿尔茨海默病(AD)、帕金森病(PD)和2型糖尿病(T2DM)等许多神经退行性疾病的重要病因,体外建立淀粉样蛋白纤维化模型被认为是寻找淀粉样蛋白纤维化抑制剂的常用策略。已有研究表明,植物的天然产物可以维持蛋白质的天然构象,并具有治疗神经退行性疾病的活性。本研究成功构建了人溶菌酶淀粉样纤维化模型,并筛选出番泻苷A和番泻苷C两个抑制剂化合物,结合生物物理方法和分子对接工具,评价番泻苷A和番泻苷C对淀粉样纤维化的抑制作用。硫黄素-T(Th T)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)和刚果红(CR)检测结果表明,番泻苷A和番泻苷C均能以剂量依赖性的方式抑制人溶菌酶淀粉样蛋白纤维性颤动,番泻苷A和番泻苷C对人溶菌酶纤维化的IC值分别为200.09μM和186.20μM。然后通过透射电子显微镜和原子力显微镜观察形态外貌特征进一步证实了这一发现,番泻苷A或番泻苷C的加入均显著减少人溶菌酶的淀粉样纤维化。此外,还通过荧光淬灭、紫外吸收光谱和分子对接研究了人溶菌酶与番泻苷A和番泻苷C的相互作用。结果表明,番泻苷A和番泻苷C都能通过氢键、范德华力和疏水作用与人溶菌酶结合,形成稳定的复合物。综上所述,我们的实验显示,番泻苷A和番泻苷C均能起到抑制人溶菌酶淀粉样纤维性聚集的作用。

关键词：重组人溶菌酶毕赤酵母淀粉样纤维化番泻苷A 番泻苷C