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同时检测猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型抗...

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作者：刘向楠华南农业大学

学位级别：硕士

繁殖障碍是导致养猪生产损失最重要的一类疾病,其中传染性因素尤为常见。猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均是引起引起母猪繁殖障碍以及免疫抑制病的病原,流行病学调查证实在猪群中这3种病毒常混... 详细信息

繁殖障碍是导致养猪生产损失最重要的一类疾病,其中传染性因素尤为常见。猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒2型(PCV2)均是引起引起母猪繁殖障碍以及免疫抑制病的病原,流行病学调查证实在猪群中这3种病毒常混合感染,相互协作促使病情加重。猪细小病毒主要严重危害种猪,尤其是初产母猪以及血清学阴性的经产母猪,怀孕母猪感染后,可经胎盘垂直传播至胚胎,发生孕猪屡配不孕、流产、产死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障碍。猪繁殖与呼吸综合征病毒感染后能引起母猪发热、厌食、繁殖障碍,仔猪呼吸道症状和猪群高死亡率。猪圆环病毒2型感染能引起猪体质下降、腹泻、消瘦、呼吸困难,以仔猪高发病率、高死亡率、机体淋巴系统损伤和免疫缺陷为主要特征,也是引起仔猪多系统衰弱综合症的主要原因。如何对三种病原进行快速、高通量及特异性检测至关重要。液相蛋白芯片是一种芯片技术与流式细胞术相结合的新技术。该技术集流式细胞技术、荧光编码微球、激光、数字信号处理和传统的生化技术于一体,即在特制的微球(聚苯乙烯微球或磁性微球)上包被核酸探针、抗原或抗体等生物分子在液相中与待测物结合,再加入荧光标记的报告分子,借助流式细胞仪检测微球表面荧光标记物。具体研究结果如下:本研究以PPV全病毒为抗原,建立了检测PPV抗体的液相蛋白芯片检测方法,特异性结果显示与猪瘟病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体无交叉反应。对29份阳性样品进行PPV的x MAP检测,与ELISA方法结果的符合率为93.1%。以原核表达的PRRSV N蛋白作为抗原,建立了检测PRRSV抗体的液相蛋白芯片检测方法,特异性结果显示与检测猪瘟病毒、圆环病毒2型、伪狂犬病毒及细小病毒抗体无交叉反应。对29份样品进行PRRSV的x MAP检测,与ELISA方法结果的符合率为86.20%。以原核表达的PCV2 Cap蛋白作为抗原,建立了检测PCV2抗体的液相蛋白芯片检测方法,特异性结果显示与猪瘟病毒、伪狂犬病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒及细小病毒抗体无交叉反应。对29份样品进行PCV2 x MAP检测,与ELISA方法结果的符合率为62.07%。683份临床血清样品通过本研究建立的三重x MAP方法进行检测,同时进行商品化ELISA试剂盒检测,PRRSV和PPV的符合率为分别为81%和86.68%,结果较理想;PCV2的符合率为69.98%。本论文建立了对三种猪繁殖障碍与免疫相关疾病的液相蛋白芯片检测方法。与目前常用的ELISA试剂盒相比,液相蛋白芯片技术能够实现在多重检测时用较低成本同时检测出多种病原,也节省了时间成本。通过特异性检测和灵敏度对比,发现该方法与其他猪病原参考血清无交叉反应,灵敏度比ELISA方法高。除敏感高和特异性好外,还显示出快速、高通量的特点,具有代替ELISA的潜力,如能产业化生产,将有利于提高行业的检测水平,为抗体水平监测提供强有力的技术支持。建立了三种猪繁殖障碍与免疫相关疾病的液相蛋白芯片检测方法,具有灵敏度高、特异性好、快速、高通量、节省试剂成本和人力成本的特点。具有产业化生产替代ELISA的潜力,有利于提高行业的检测水平,为免疫后抗体水平监测提供技术支持。

关键词：猪细小病毒病猪圆环病毒病猪繁殖与呼吸综合征液相蛋白芯片技术

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