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海洋球石藻(Emiliania huxleyi)磷脂酶C的结构特点及系统进化分析

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海洋与湖沼 2018年第1期49卷 106-116页

作者：郭强强蔡伟聪李桂玲曾珺李健刘静雯集美大学食品与生物工程学院厦门361021 福建省高校食品微生物与酶工程重点实验室厦门361021

磷脂酶C(phospholipase C,PLC)作为一种重要的细胞信号分子,是G蛋白信号转导过程中的重要调节因子之一,在动、植物环境胁迫应答及病原菌致病过程中发挥重要作用。海洋浮游植物生长代谢与环境因子之间的相互作用涉及细胞内复杂的信号通路... 详细信息

磷脂酶C(phospholipase C,PLC)作为一种重要的细胞信号分子,是G蛋白信号转导过程中的重要调节因子之一,在动、植物环境胁迫应答及病原菌致病过程中发挥重要作用。海洋浮游植物生长代谢与环境因子之间的相互作用涉及细胞内复杂的信号通路,并最终通过调节细胞分裂过程控制浮游植物的增殖、种群生长动力及初级生产力。但对浮游植物PLC及其参与的信号通路的了解却非常少。通过NCBI基因数据库的关键词搜索、比对,发现海洋球石藻(Emiliania huxleyi)中含有30种PLC蛋白,利用SMART程序预测其结构保守域,以此将30种PLC分为四大类;对其氨基酸序列的信号肽、跨膜结构域、一级结构、二级结构、三级结构及其细胞定位等进行了生物信息学分析和预测。结果表明,海洋球石藻PLC具有丰富的多样性,它们在信号肽、跨膜区等方面均有一定的差别,其一级结构中存在多个可能的磷酸化修饰位点。二级结构中都含有α螺旋,β折叠,无规则卷曲,且都定位于线粒体,而三级结构相似度不高。从亲缘关系上看,海洋球石藻PLC与低等动物更接近。该研究补充和完善了对植物PLC信号转导网络系统的认识,并为进一步开展海洋球石藻PLC细胞定位及其参与的信号通路与环境胁迫之间关系的研究提供了重要的理论指导。

关键词：海洋球石藻磷脂酶C结构系统进化信号转导生物信息学

海洋球石藻（Emiliania huxleyi）中化合物的分离鉴定及其生物学活性初探

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海洋球石藻（Emiliania huxleyi）中化合物的分离鉴定及其生物学...

作者：马亚瑞集美大学

学位级别：硕士

海洋微藻作为海洋生态系统的初级生产者,在物质循环和能量流动中起到至关重要的作用。其代谢物中富含蛋白质、脂肪酸、维生素、色素、多酚、多糖及萜类等多种生物活性物质,尤其是海洋微藻细胞中总脂含量最高可达细胞干重的80%。这些化... 详细信息

海洋微藻作为海洋生态系统的初级生产者,在物质循环和能量流动中起到至关重要的作用。其代谢物中富含蛋白质、脂肪酸、维生素、色素、多酚、多糖及萜类等多种生物活性物质,尤其是海洋微藻细胞中总脂含量最高可达细胞干重的80%。这些化合物具有良好的抑菌、抗氧化、抗肿瘤等生物功能。海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物,隶属于定鞭藻门(Haptophyta)定鞭藻纲(Prymnesiophyceae)。海洋球石藻代谢产物中富含多种生物活性物质,如二十二碳六烯酸(DHA)、聚酮类化合物等,在生物技术领域具有广阔的应用前景。但目前有关海洋球石藻脂类活性物质领域的研究较少。本研究以海洋球石藻Emiliania huxleyi BOF92为研究对象,通过比较和优化其总脂的提取条件,建立一种高效提取球石藻细胞总脂的工艺,对脂类粗提物进行体外抗菌、抗氧化活性分析,并筛选其中活性较高的组分进一步进行分离、鉴定及活性分析。主要研究结果如下:(1)比较了不同提取溶剂、不同前处理方法对球石藻总脂提取率的影响,最终选择乙醇作为提取溶剂,采用溶剂浸提的方法。通过单因素和正交试验确定海洋球石藻中总脂提取的最佳工艺条件为:乙醇浓度75%,液料比10:1(mL/g),浸提温度35℃,浸提时间120 min,在该条件下海洋球石藻细胞总脂提取率是细胞干重的26.38%,实验重复性好。(2)海洋球石藻藻粉经过乙醇浸提获得浸膏后,分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取获得三相萃取物。抑菌实验表明乙酸乙酯相对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、酿酒酵母都有一定的抑制作用;石油醚相对副溶血性弧菌的抑制效果较强,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的生长也有一定的抑制能力但相对较弱;而正丁醇相对细菌的抑制能力较弱,而对霉菌的抑制效果较强。抗氧化试验综合表明乙酸乙酯相的抗氧化能力最强。(3)从海洋球石藻乙酸乙酯相中分离纯化出6种单体化合物,经过核磁共振波谱、高分辨质谱、红外光谱等分析,其中有4种化合物鉴定出结构,分别为棕榈酸、叶绿醇、肉豆蔻酸和邻苯二甲酸二丁酯。(4)四种单体化合物中,棕榈酸、肉豆蔻酸和邻苯二甲酸二丁酯无抗氧化活性,但对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、副溶血性弧菌有一定的抗菌活性,细胞毒活性试验效果不明显。叶绿醇无抗菌活性,抗氧化能力很强,对肝癌细胞Hep G2有较强的抑制作用。

关键词：海洋球石藻脂类化合物分离鉴定生物活性

海洋球石藻（Emiliania huxleyi）鞘脂类的液质分析及其活性初探

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海洋球石藻（Emiliania huxleyi）鞘脂类的液质分析及其活性初探

作者：江寒瑞集美大学

学位级别：硕士

鞘脂类是目前脂类研究的热点之一,其代谢产物(如神经酰胺、鞘氨醇及各种鞘糖脂等)具有较强的生物活性,作为信号分子参与细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等重要生理活动,特别是作为一种新型膳食营养成分和药用成分对人体健康具有重要... 详细信息

鞘脂类是目前脂类研究的热点之一,其代谢产物(如神经酰胺、鞘氨醇及各种鞘糖脂等)具有较强的生物活性,作为信号分子参与细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等重要生理活动,特别是作为一种新型膳食营养成分和药用成分对人体健康具有重要影响。目前对于鞘脂的研究主要集中在高等动植物,对海洋生物中鞘脂的研究还很少。海洋微藻因其繁殖快、种类多、数量大,含有多种活性物质,已成为新型天然产物的主要来源。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)是一种海洋真核浮游植物,能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,特别是该藻被特异性病毒感染后能够合成新的具有独特结构的鞘糖脂,该结构的鞘糖脂具有较高的生物学活性,有望开发为新型的天然食品医药资源。本研究以海洋球石藻*** BOP92和特异性裂解病毒EhV99B1为研究材料,建立了鞘脂标准品的质谱检测方法,初步明确了鞘脂的质谱学规律;在此基础上建立了适用于海洋球石藻细胞中粗脂的提取方法和超高效液相色谱-四级杆和轨道阱杂交傅里叶变换超高分辨率质谱联用(UPLC-Q-Exactive-MS)的分析检测方法,分析了病毒感染前后,海洋球石藻细胞中鞘脂的组成及含量变化。主要研究结果如下:首先对海洋球石藻细胞总脂进行了荧光观察和薄层色谱(TLC)分析。荧光显微镜观察结果显示,病毒感染的藻细胞中中性脂质积累明显增加,细胞核遗传物质片段化;TLC结果显示藻细胞总脂中中性脂质的含量比例较高,且病毒感染在一定程度上影响宿主藻细胞脂质的组成和含量,特别是能够促进中性脂质的合成和积累;球石藻细胞总脂粗提物具有一定抗氧化和抗肿瘤活性,病毒感染后藻细胞粗脂具有更强的总还原能力,球石藻粗脂对正常肝细胞LO2和肝癌细胞HepG2的生长具有抑制或刺激作用,且与粗脂的浓度相关。将鞘脂的标准品直接进行质谱分析,在正负离子模式下探索鞘脂的质谱学规律。结果显示,鞘脂更易在正离子模式下离子化,且鞘脂分子发生类似的结构断裂,产生的离子碎片或中性丢失可以提供鞘脂的结构信息,因此解析质谱图的离子碎片可以确定鞘脂的种类及结构。鞘脂的特征离子碎片为鞘氨醇骨链脱去两分水时产生的离子碎片,例如鞘脂的长链碱基为d18:1、t18:0,在正离子模式下其特征离子碎片的质荷比为264.3、282.3。在上述基础上,进一步建立了UPLC-Q-Exactive-MS分析手段,用于检测病毒感染前后藻细胞中鞘脂的组成及含量变化情况。结果鉴定出了13种鞘脂,其中神经酰胺的含量最高,可达鞘脂总含量的99%以上,其结构多为带两个羟基的C18长链碱基和不带羟基的C20-C23脂肪酸链,还有少量的单糖鞘糖脂存在;病毒EhV99B1感染*** BOF92后宿主藻细胞鞘脂类的组成没有发生改变,但含量均不同程度降低,表明病毒基因组编码的鞘脂类代谢酶参与并调节宿主的鞘脂类代谢途径。

关键词：海洋球石藻病毒感染鞘脂液质联用活性

海洋球石藻病毒参与宿主新型鞘脂类合成途径关键酶基因的克隆及其功能分析

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海洋球石藻病毒参与宿主新型鞘脂类合成途径关键酶基因的克隆及其...

作者：郭强强集美大学

学位级别：硕士

鞘脂类是目前脂类研究的热点之一,作为食物中的一种天然成分,鞘脂可以归为食物中的“功能成分”。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)是一种海洋真核浮游植物,能够产生丰富的次级代谢生物活性物质。特别是该藻被特异性病毒(*** virus:EhV)... 详细信息

鞘脂类是目前脂类研究的热点之一,作为食物中的一种天然成分,鞘脂可以归为食物中的“功能成分”。海洋球石藻(Emiliania huxleyi)是一种海洋真核浮游植物,能够产生丰富的次级代谢生物活性物质。特别是该藻被特异性病毒(*** virus:EhV)感染后能够合成一系列具有特殊结构的新型鞘脂类活性物质,这些鞘脂类有望开发为新型的天然食品和医药资源。EhV86及其宿主EhCCMP1516全基因组测序注释结果显示,EhV86基因组中存在7个预测编码鞘脂类合成途径(SBP)关键催化酶的基因,包括丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)、长寿保障基因类蛋白(LAG1)、脂肪酸去饱和酶(FAD)、酯类磷酸酶(LPP)、甾醇去饱和酶(SD)、糖基转移酶(GT)及跨膜脂肪酸伸长蛋白(TFAE)。正是病毒基因组编码的这些酶在一定程度上掌控着宿主藻细胞鞘脂类的代谢,从而合成并积累宿主新型的鞘脂类物质。到目前为止,上述几种酶中只有SPT功能和生化特性进行了初步研究,其他几种鞘脂类代谢途径中酶的功能和确切位置还有待确定。本论文选择其中两种关键酶,即SD和FAD为研究对象,从海洋球石藻病毒EhV99B1基因组中克隆获得该两种酶基因,对其结构特点进行了系统的生物信息学分析;然后通过基因工程技术初步分析这两种酶在酵母细胞鞘脂类代谢途径中可能的作用;对本实验室已建立的海洋球石藻遗传转化系统进行了优化改进。为进一步构建海洋球石藻生物反应器、合成积累新型鞘脂类资源提供科学依据和技术支持。主要研究结果如下:(1)应用PCR技术从球石藻病毒EhV99B1基因组中扩增获得上述两种酶基因。其中甾醇去饱和酶SD基因全长987bp,编码328个氨基酸,该蛋白的理论等电点为8.31,分子量为37.83kDa,为疏水性、不稳定蛋白,存在6个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中螺旋含量最多。脂肪酸去饱和酶FAD基因全长963bp,编码320个氨基酸,该蛋白的理论等电点为7.26,分子量为37.67kDa,属于亲水性、稳定蛋白,存在4个跨膜结构域,不存在信号肽;其二级结构中也是螺旋结构含量最多。系统发育分析结果显示,病毒这两种基因与宿主球石藻及金色藻属亲缘关系较近。(2)构建了酿酒酵母重组表达载体pYES2/CT-SD和pYES2/CT-FAD,通过醋酸锂的方法转化酿酒酵母菌株INVSc1,对筛选获得的阳性菌株用D-半乳糖诱导目的基因表达,SDS-PAGE检测到目的蛋白的表达,其分子量分别为甾醇去饱和酶SD为37.8 kDa,脂肪酸去饱和酶FAD为37.6 kDa。重组酵母细胞与原始酵母细胞的总脂薄层层析结果有较大的差别,表明病毒甾醇去饱和酶SD和脂肪酸去饱和酶FAD能够改变酵母细胞中脂类组成及含量变化,具有一定的催化活性。(3)利用基因工程技术从pBar、pGFP质粒和*** BOF92基因组中成功克隆了海洋球石藻内源性启动子FCP-P基因,终止子FCP-T基因、草铵膦抗生素抗性基因Bar、绿色荧光蛋白基因GFP。以psp73作为基础载体,利用不同酶切位点成功构建了pEhux-I(psp73-FAP-Bar-FAT1-FBP-FAT2)载体和pEhux-II(psp73-FAP-GFP-FAT2)载体;采用PEG介导的方法将两个载体共转化海洋球石藻BOF92细胞,荧光显微镜观察到部分转化细胞中绿色荧光蛋白基因的表达,通过草铵膦筛选获得成功转化的藻细胞株;实时荧光定量PCR和Western bloting检测进一步验证转化细胞中Bar基因的稳定表达。以上研究结果初步确定了病毒两种酶基因表达产物具有一定的催化活性,优化后的球石藻遗传转化系统能够诱导目的基因的稳定表达,为进一步构建含有病毒SD和FAD基因的球石藻工程藻株奠定了基础,也为实现海洋球石藻新型鞘脂类的产业化生产及应用提供了科学依据。

关键词：海洋球石藻海洋球石藻病毒甾醇去饱和酶SD 脂肪酸去饱和酶FAD 酵母重组表达海洋球石藻遗传转化体系

海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析

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海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能...

作者：蔡艺钦集美大学

学位级别：硕士

海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物,广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中,在地质学、生物地理学、古气候学、生态生理学、材料科学和医学等领域中具有重要的研究价值。作为大洋环境中重要的初级生产者,海洋... 详细信息

海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物,广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中,在地质学、生物地理学、古气候学、生态生理学、材料科学和医学等领域中具有重要的研究价值。作为大洋环境中重要的初级生产者,海洋球石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术研究领域具有广阔的应用前景。球石藻细胞能够合成大量聚酮类化合物,具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性。引人注目的是,球石藻中最重要的种类Emiliania huxleyi能被特异性病毒感染并随着宿主细胞的裂解释放出大量神经酰胺类(Ceramide)物质,这可能是由于病毒在某种程度上控制着宿主神经酰胺的代谢过程,并通过大量合成神经酰胺类物质诱导宿主细胞凋亡。神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质,对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。作为一种新型的生物活性物质,神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质,在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。神经酰胺在细胞中的含量甚微,一般在0.01?0.2%(干重)左右。海洋球石藻***在病毒感染条件下,其细胞中神经酰胺的含量可达到细胞干重的0.091%。尽管与其他生物相比,其细胞中神经酰胺相对含量并不是很高,但球石藻神经酰胺独特的结构特点使其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。微藻基因工程是一种复杂而快速发展的生物技术,可作为操纵微藻代谢通路的强有力工具。通过微藻基因工程技术可以改造海洋球石藻鞘脂类合成代谢途径的关键环节,使其有利于高效合成并积累神经酰胺,从而有效提高细胞中神经酰胺的产量。目前有关海洋球石藻遗传转化系统及其应用研究国内外尚未见报道。本论文以海洋球石藻***(EhBOF92)及其特异性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,构建海洋球石藻真核表达载体、建立其遗传转化方法,在此基础上将病毒基因组中神经酰胺合成第一限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)催化亚基LCB2基因亚克隆入表达载体并转化宿主藻细胞,检测LCB2基因表达水平及其对宿主细胞神经酰胺合成的影响。主要研究结果如下:(1)抗生素抗性基因的筛选及其克隆:选择氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素和除草剂草铵膦,以球石藻生长率为指标,从上述化学物质中筛选适宜的抗生素。结果表明,海洋球石藻对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素等不敏感,对氯霉素和新生霉素较敏感,而对G418、嘌呤霉素和草铵膦则高度敏感。综合分析最终选择G418作为球石藻基因工程藻株的选择性抗生素,其对应的抗性基因neo作为构建海洋球石藻真核表达载体的选择标记基因。从pSELECT载体中PCR扩增获得neo基因并通过测序验证。(2)启动子及报告基因的选择:从pGFP载体中PCR扩增获得绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因并通过测序验证;采用生物信息学方法筛选启动子,并对启动子序列进行综合分析。本文选择球石藻内源性fcp(岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白启动子)启动子,从基因组中PCR扩增该基因并利用PLACE(http://***/PLACE/)和Plant CARE(http://***/webtools/plantcare/html/)数据库对其序列中的顺式作用元件、增强子和阻遏因子等进行预测和分析。结果表明,fcp启动子序列包含大量的顺式作用元件,具有潜在的强启动子活性。(3)表达载体的构建及其转化方法的建立:以pUC18为基础载体,成功构建了双元重组表达载体pUC18-gfp-fcp和pUC18-fcp-neo,利用电击法共转化海洋球石藻。转化条件的优化结果为:选择对数中期细胞,质粒DNA浓度为10μg/mL(高纯度),电击缓冲液为0.080 mol/L KCl、0.005 mol/L CaCl2、0.2 mol/L甘露醇、0.2 mol/L山梨醇、0.01 mol/L Hepes、pH 7.2,电场强度为2000 V/cm,电击时间为2 ms/次、电击2次。荧光显微镜及实时荧光定量PCR验证结果表明:成功获得转化的藻细胞,转化效率为0.07%。fcp启动子能够在球石藻细胞中启动gfp基因和neo基因的相对高效的表达。(4)球石藻病毒SPT对宿主神经酰胺合成的影响:从病毒基因组中克隆SPT(EC2.***.1.50)的催化亚基LCB2基因片段,构建了含有EhV99B1-LCB2基因的重组表达质粒pUC18-fcp-neo-LCB2,采用电击转化法将其与重组质粒pUC18-gfp-fcp进行共转化导入球石藻细胞中,经PCR验证获得含有病毒LCB2基因的球

关键词：海洋球石藻球石藻病毒载体构建遗传转化神经酰胺

病毒介导的海洋球石藻(Coccolithophores)鞘脂类代谢调控

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微生物学通报 2016年第7期43卷 1555-1564页

作者：马亚瑞刘旭宏蔡艺钦李健刘静雯集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 福建省高校食品微生物与酶工程研究中心福建厦门361021

海洋球石藻(Coccolithophores)是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核浮游植物,有些种类是大洋和近岸常见的赤潮种。自然海域中,病毒感染是导致球石藻死亡和赤潮消亡的一个关键因素。基于一株海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特... 详细信息

海洋球石藻(Coccolithophores)是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核浮游植物,有些种类是大洋和近岸常见的赤潮种。自然海域中,病毒感染是导致球石藻死亡和赤潮消亡的一个关键因素。基于一株海洋球石藻Emiliania huxleyi及其特异性裂解病毒全基因组测序注释的结果,研究者们发现病毒可能通过基因横向转移从宿主基因组中获取了一系列与鞘脂类代谢相关的关键酶基因,进而在一定程度上掌控了宿主鞘脂类代谢,大量合成、积累病毒性鞘脂类物质,并最终诱导宿主细胞以凋亡的形式死亡。因此,病毒介导的宿主鞘脂类代谢在调节病毒与宿主间相互作用中具有重要意义。本文着重综述海洋球石藻病毒与宿主间的基因横向转移、病毒介导的宿主鞘脂类代谢特点及其生态学意义,以期深入了解海洋球石藻病毒与宿主间复杂的相互作用关系。

关键词：海洋球石藻海洋球石藻病毒基因横向转移鞘脂类代谢生态学意义

富硒海洋球石藻(Emiliania huxleyi)的培养及其硒蛋白的初步分离纯化

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海洋与湖沼 2010年第6期41卷 879-884页

作者：刘静雯张稚兰杜翠红黄志勇集美大学生物工程学院厦门361021

在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,... 详细信息

在不同浓度亚硒酸钠(Na2SeO3)条件下培养海洋球石藻,分析其生长和富集硒情况,并采用(NH4)2SO4分级盐析、DEAE-Sepharose离子交换柱层析和SephacrylS-200凝胶过滤层析方法,对球石藻硒蛋白进行了初步分离纯化。结果表明,在本实验条件下,不添加外源硒的f/2培养基本底硒浓度(约3.2nmol/L)为海洋球石藻最佳生长和富硒的硒浓度,其细胞内硒含量可达到6475?g/g干重。离子交换和凝胶层析分离的含硒蛋白结合的最高硒含量分别达到392.3ng/mg和663.5ng/mg蛋白。SDS-PAGE纯度鉴定显示,在分子量分别约为41.3kDa和30.1kDa处各有单一电泳条带。结果提示,海洋球石藻能在环境硒浓度极低的条件下大量吸收硒并将大部分无机硒转化为硒蛋白。富硒能力较强的海洋球石藻有望作为一种新的有机硒资源,对开发含硒安全性食品具有很大的应用潜力。

关键词：海洋球石藻富硒培养硒蛋白分离纯化

病毒感染海洋球石藻（Emiliania huxleyi）长链非编码RNA的预测及功能分析

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病毒感染海洋球石藻（Emiliania huxleyi）长链非编码RNA的预测及...

作者：田雪集美大学

学位级别：硕士

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核浮游植物,几乎每年都在大洋中形成大面积赤潮,尤其是亚极地高纬度海域的优势赤潮种。***因其可以产生由碳酸钙(CaCO3)构成的“球石粒”及高产二甲基巯基丙酸内盐... 详细信息

海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核浮游植物,几乎每年都在大洋中形成大面积赤潮,尤其是亚极地高纬度海域的优势赤潮种。***因其可以产生由碳酸钙(CaCO3)构成的“球石粒”及高产二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate,DMSP)的能力,已成为当今研究全球生物地化循环及气候变化的一个关键物种。自然海域中,某些株系的***能够被特异性病毒(Ehuxleyi virus,EhVs)感染,并诱导宿主细胞裂解死亡,造成大量的球石粒脱落和DMS的释放。因此,***及其特异性裂解病毒EhVs之间的相互作用过程是决定海洋碳、硫命运的一个主要因素,在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用,并在重塑海洋群落结构及地质演变中具有很重要的地位。随着对该病毒-宿主复杂的基因组结构特点、基因间水平转移现象以及病毒和宿主丰富的遗传多样性特点等的逐渐认识,***-EhV已成为研究真核生物宿主-病毒相互作用关系的关键模式系统之一。但迄今为止,我们对它们之间复杂的相互作用机制尚不十分清楚,特别是缺乏在分子水平上系统阐释病毒-宿主互作机制充分的实验证据。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一类转录本长度大于200 nt、不编码或很少编码蛋白质的RNA,能在转录、转录后、表观遗传等多个水平调控基因表达。通常作为功能调控元件参与真核生物细胞分化、个体发育等生命过程的基因表达调控,是当前分子生物学和遗传学研究的热点。目前,lncRNA的研究主要集中于人、小鼠、模式生物及经济物种等高等动植物,浮游植物该领域的研究非常有限,特别是lncRNA与浮游植物病毒感染的相关性研究尚未见报道。本研究拟以海洋球石藻*** BOF 92及其特异性裂解病毒EhV-99 B1为研究对象,利用Illumina HiSeq 4000高通量测序技术、生物信息学分析方法并结合分子生物学实验,分别对***病毒感染组(Exp)和非感染对照组(Con)6 h和45 h的藻细胞样品进行全基因组lncRNA及mRNA测序分析,构建病毒感染相关mRNA及lncRNA转录组表达谱,筛选和验证病毒感染差异表达的mRNAs及lncRNAs;通过对两种不同转录组的分析,揭示病毒感染条件下相关转录本的差异变化,并从中挖掘关键转录本及其代谢调控途径;预测分析差异表达lncRNA与miRNA可能的互作关系,并利用荧光素酶报告系统实验验证lncRNA与miRNA的互作方式。主要研究结果如下:(1)共得到38554条平均长度为1117 bp的mRNA转录本,病毒感染6 h和45 h分别得到15374个和7334个差异表达mRNAs,其中两个时间点的共差异表达基因5422个;对随机选取的10个差异表达mRNAs进行qRT-PCR实验验证,证实转录组测序结果可靠。(2)共得到24193条平均长度为900 nt的lncRNA转录本,包括12449个基因间型lncRNAs(lincRNAs)和 11744 个反义型 lncRNAs(anti-sence lncRNAs)。病毒感染 6h和45 h分别得到4797个和876个差异表达lncRNAs,其中两个时间点的共差异表达lncRNA 520个;对随机选取的20个差异表达的lncRNAs进行qRT-PCR实验验证,超过73%的lncRNA的qPT-PCR结果与测序结果一致,证实lncRNA转录组测序结果可靠。(3)GO和KEGG功能分析显示,涉及差异表达基因最多的是代谢途径相关的基因。mRNA转录组中富集较显著的有次生代谢物的生物合成、抗生素的生物合成、碳代谢、氨基酸的生物合成、脂肪酸代谢、卟啉和叶绿素代谢、萜类骨架的生物合成、类固醇的生物合成及糖酵解/糖异生等代谢途径;对Co-located和Co-expressed两种不同预测方法得到的lncRNA靶基因取交集,然后进行Pathway显著性富集,得到较显著的有抗生素生物合成、糖酵解/糖异生、次级代谢生物合成及脂肪酸代谢等代谢途径;差异表达mRNA及lncRNA靶基因共同富集的代谢途径集中于宿主的次级代谢、碳代谢及脂代谢,暗示病毒感染过程中,lncRNA可能参与这类代谢过程的调控。(4)选择病毒感染差异表达的20个lncRNAs和5个miRNAs(本实验室前期鉴定的miRNAs),对它们之间进行结合位点预测,发现lncRNA可以与多个miRNA结合,miRNA也可以结合多个lncRNA,并且同一 lncRNA与同一 miRNA之间可能存在多个结合位点;我们最终选择1条lncRNALNC-011228与1条microRNAEhe-miR6,

关键词：海洋球石藻病毒感染 mRNA lncRNA 功能分析双荧光素酶报告载体系统

病毒诱导海洋球石藻metacaspase依赖的程序性细胞死亡及对线粒体功能的影响

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病毒诱导海洋球石藻metacaspase依赖的程序性细胞死亡及对线粒体...

作者：苏金净集美大学

学位级别：硕士

浮游植物受到外界病原物侵染、营养及环境等胁迫时可以激活细胞程序性死亡(PCD),Metacaspases属于半胱氨酸蛋白酶家族成员,被认为是动物caspase的远缘蛋白,在浮游植物PCD过程中起着重要作用。海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广... 详细信息

浮游植物受到外界病原物侵染、营养及环境等胁迫时可以激活细胞程序性死亡(PCD),Metacaspases属于半胱氨酸蛋白酶家族成员,被认为是动物caspase的远缘蛋白,在浮游植物PCD过程中起着重要作用。海洋球石藻Emiliania huxleyi是一种全球广泛分布且具有重要生态功能的真核微型浮游植物,能够形成由碳酸钙(CaCO3)构成的“球石粒”,其生物形成和物理沉降构成了全球碳循环中非常重要的一环。自然海域中,***能够被特异性裂解病毒(*** yivirus,EhV)感染并通过诱导宿主PCD终止该藻赤潮并控制宿主的种群动力学过程,在调节海洋碳、硫循环及全球气候变化中起着重要作用。因此***-EhV已成为研究真核生物病毒-宿主互作过程的关键模式系统之一。迄今为止,我们对浮游植环境胁迫特别是病毒感染诱导PCD的分子功能及其调控机制的的了解还十分有限。本论文利用生物信息学方法深度挖掘和分析细胞凋亡特征蛋白酶metacaspase基因在浮游植物中的分布情况,并以海洋球石藻***的metacaspases(EhMCs)为代表分析其结构和功能,依据现有的Uniprot和String数据库挖掘与metacaspase功能相关并参与浮游植物PCD过程的互作蛋白;然后以*** BOF92及其特异性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,分析病毒感染对宿主线粒体结构和功能的损伤以及诱导的PCD;明确响应病毒感染的细胞凋亡特征蛋白酶metacaspase的表达特征;分析病毒感染诱导的microRNA即EhVe-miR8与metacaspase的互作关系,初步了解EhV诱导的PCD过程是否可能受micoRNA的调控。主要结果如下:(1)在Uniprot和String数据库中共收集到11种浮游植物中29条metacaspases,分为 Ⅰ 型、Ⅱ 型、Ⅲ型及 metacaspase-like protease(MCP)四种类型,MCP 又称 orthocaspase,它们的metacaspase蛋白一级结构存在明显差异,但位于p20的组氨酸和半胱氨酸活性位点均具有高度的保守性;其中EhMCs蛋白三级结构与酵母的metacaspase十分相似,暗示它们具有类似的功能;浮游植物metacaspases与多种蛋白存在直接或间接的互作关系,并可能参与众多生物学过程,在细胞凋亡、响应环境胁迫和能量代谢等方面发挥重要作用。另外,metacaspase的磷酸化修饰可能在浮游植物PCD信号转导过程中起调节作用。(2)于病毒感染后0h、24 h、45 h、60 h收集细胞样品,观察细胞结构的变化及线粒体功能分析。细胞超微结构变化显示:病毒感染24 h后,线粒体稍微肿大,内膜嵴的数量减少;感染45 h后,线粒体膨胀,嵴模糊紊乱,形成空泡;感染60 h后,细胞裂解并形成类凋亡小体,同时线粒体膜破裂、线粒体嵴破坏严重且空泡化。病毒感染后45 h,线粒体膜电位、ATP水平明显降低,细胞色素C(Cyt-C)基因及蛋白表达水平均显著升高,意味着EhV诱导PCD过程中可能涉及到线粒体的介导作用。(3)病毒感染过程中,qRT-PCR结果显示,9条EhMCs基因在转录水平上的表达均不同程度的上调,除了 EhMC5外,有7条EhMCs在感染晚期表达量显著上升(P海洋球石藻中各种metacaspases可能具有不同的作用,即有些metacaspase参与了细胞PCD过程,而有些metacaspase可能没有caspase活性并不负责PCD的执行。(4)对本实验室前期研究确定的EhV99B1感染诱导的microRNAs——EhVe-miR8和EhVe-miR9,分析它们与宿主9条EhMCs之间的靶向关系并进行准确的靶向结合位点预测,发现EhVe-miR8和EhVe-miR9均分别与metacaspases存在多样的结合方式,即与靶标的3'UTR、CDS和5'UTR均有结合位点。选择具有确定3'UTR的EhMC2,采用双荧光素酶报告系统验证EhVe-miR8与EhMC2-EhMC2-3'UTR的结合方式。结果显示,EhVe-miR8能够显著抑制psiCHECK2-EhMC2-3'UTR荧光素酶活性,说明EhMC2很可能是EhVe-miR8的靶基因。至于病毒感染诱导的EhVe-miR8如何调控EhMC2基因的表达有待进一步研究。综上,本文研究了 metacaspase基因在浮游植物中的分布及功能特征,以特异性裂解病毒感染海洋球石藻为实验模型,明确m

关键词：海洋球石藻海洋球石藻病毒程序性细胞死亡 Metacaspase 结构与功能线粒体功能 MicroRNA