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海南砂的WlTPSs及其与阳春砂WvTPSs的比较研究

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海南砂的WlTPSs及其与阳春砂WvTPSs的比较研究

作者：凌旭怡广州中医药大学

学位级别：硕士

1目的姜科植物海南砂Wurfbainia longiligularis与阳春砂Wurfbainia villosa.均为砂仁的来源植物,其药用部位为成熟干燥果实,具有芳香化湿和辛温行散功效,其中果实富含多种单萜类药效成分,如乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑、莰烯及蒎烯等,其中... 详细信息

1目的姜科植物海南砂Wurfbainia longiligularis与阳春砂Wurfbainia villosa.均为砂仁的来源植物,其药用部位为成熟干燥果实,具有芳香化湿和辛温行散功效,其中果实富含多种单萜类药效成分,如乙酸龙脑酯、龙脑、樟脑、莰烯及蒎烯等,其中乙酸龙脑酯是其在中国药典的质量指标性成分。课题组已经从阳春砂基因组中鉴定出萜类合酶(terpene synthase,TPS)基因家族66个成员,并对其中18个TPS进行了催化功能鉴定,并且获得了负责合成砂仁主要药效成分乙酸龙脑酯前体的关键酶——龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS),同时在海南砂中也鉴定了能催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphat,BPP)的TPS(WlTPS24),但其催化生成BPP的活性较弱,推测海南砂中可能存在其他能够催化产生BPP的TPS,且前期还未从基因组水平整体对海南砂TPS基因进行筛选和研究,因此基于转录组和基因组数据对海南砂TPS基因家族进行鉴定并与阳春砂TPS基因进行比较分析,以期增加对海南砂与阳春砂两者萜类合酶基因家族的认识,分析不同药用砂仁中萜类种类及含量差异与TPS相关的分子基础,为改进砂仁种质及合成萜类等药用有效成分提供理论依据。2方法2.1海南砂TPS基因家族鉴定及与阳春砂TPS基因家族的进化分析通过在Pfam蛋白数据库检索TPS所对应的隐马尔可夫模型(hidden Markov models,HMM),在海南砂基因组数据库的注释信息中进行筛选,将所获得的基因在转录组数据库中进行本地blast,进一步筛选出具有保守motif和完整开放阅读框的海南砂TPS基因家族,并命名为WlTPS。用TBtools的MUSCLE工具构建WlTPS与WvTPS的系统进化树,使用在线工具i TOL(https://itol.***.de/)对系统进化树进行美化。2.2 WlTPS的染色体定位、结构域可视化、表达量热图分析分别使用TBtool软件的染色体定位功能模块和热图分析模块对WlTPS基因家族进行染色体定位和表达量热图分析,使用MEME在线网站(http://***/tools/meme)对WlTPS基因家族的结构域进行分析,将分析所获得的MEME文件用TBtool结构域分析模块进行可视化和美化。2.3候选WlTPS基因的筛选、克隆与功能鉴定筛选与已鉴定的阳春砂WvTPS,特别是与WvBPPS聚类关系较近且表达量较高或具有器官特异性的WlTPS作为候选基因。以候选基因所在表达量较高的器官部位c DNA作为模板进行克隆,使用原核表达体系对融合蛋白进行诱导,纯化后的蛋白以香叶基焦磷酸(geranyl pyrophosphate,GPP)为底物进行体外酶促反应,对可能催化生成BPP的纯化蛋白以GPP为底物反应后加入碱性磷酸酶进行脱磷酸处理,GC-MS检测其催化产物。2.4与BPPS相关基因的实时荧光定量PCR根据基因序列设计用于qPCR的特异性引物,以海南砂不同组织部位的根、根状茎、茎、叶、花和果实(开花后60天)及阳春砂种子团的c DNA为模板进行q RT-PCR,基因表达水平以2进行归一化处理,数据用Graph Pad prism软件进行作图展示。2.5 WlBPPS与WvBPPS酶动力学分析取酶的最适反应时间和蛋白浓度,在一定范围的底物浓度梯度下对WlBPPS和WvBPPS进行体外酶活检测,用GC-MS检测其催化产生龙脑的含量,产物浓度用外标法确定。通过Graph Pad Prism 8.0软件计算酶动力学参数。2.6 WlTPS24与WvBPPS突变体的构建及功能鉴定结合课题组前期对WvBPPS与底物结合的活性口袋分析结果,选取未进行突变验证的位点进行定点突变,体外酶活检测方法如2.3所示。2.7海南砂与阳春砂蒎烯合酶的比较分析从Uni Prot(https://***/)在线网站下载已发表的蒎烯合酶(Pinene synthase,PS)氨基酸序列,与WlPS和WvPS进行序列比对,并对PS关键位点进行预测。结合本课题组已有的海南砂与阳春砂转录组数据及萜类含量数据对WlPS和WvPS的表达量及各组织部位蒎烯含量进行相关性分析。3结果3.1海南砂TPS基因家族鉴定及生物信息分析筛选获得了75个具有全长CDS的WlTPS候选序列。75个WlTPS和66个WvTPS被分为5个TPS亚家族:TPS-a,TPS-b,TPS-c,TPS-e/f和TPS-g。75个WlTPS分布在13条染色体上,共有14个串联重复基因簇,有15个基因可能发生了片段复制事件。3.2参与海南砂主要单萜类成分合成的候选基因筛选、克隆与功能鉴定根据聚类关系及转录组表达谱信息,在TPS-b亚家族筛选到15个WlTPS候选基因,成功克隆和鉴定了其中11个WlTPS的催化功能:WlTPS5和WlTPS8为蒎

关键词：海南砂阳春砂萜类合酶龙脑基二磷酸合酶蒎烯合酶

海南砂BDH的功能研究及其与阳春砂BDH的比较

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海南砂BDH的功能研究及其与阳春砂BDH的比较

作者：黄琳璇广州中医药大学

学位级别：硕士

1.目的海南砂(Wurfbainia longiligularis)属姜科豆蔻属植物,是中药砂仁的药用植物来源之一,其干燥成熟果实含有丰富的挥发油,如乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等萜类化合物。龙脑脱氢酶(borneol dehydrogenase,BDH)来源于短链脱氢/还原酶(shor... 详细信息

1.目的海南砂(Wurfbainia longiligularis)属姜科豆蔻属植物,是中药砂仁的药用植物来源之一,其干燥成熟果实含有丰富的挥发油,如乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑等萜类化合物。龙脑脱氢酶(borneol dehydrogenase,BDH)来源于短链脱氢/还原酶(short-chaindehydrogenases/reductases,SDR)超家族,能催化龙脑生成樟脑,是樟脑合成途径下游最后的关键酶,其他植物中也已有龙脑脱氢酶的报道,而海南砂中的龙脑脱氢酶基因及其相应的基因家族未被报道。海南砂与阳春砂种子中皆含有较丰富的樟脑,但二者相比,海南砂的樟脑含量在总萜类化合物中占比高于阳春砂樟脑含量的占比,并且樟脑在海南砂各组织部位中的分布更广,对其合成途径中关键酶龙脑脱氢酶的研究有利于深入认识海南砂中樟脑的合成和调控机制,同时比较二者龙脑脱氢酶差异有利于进一步探究阳春砂和海南砂龙脑相关萜类含量差异的原因。因此,本研究基于海南砂基因组的基因挖掘和体外酶反应,鉴定WlBDH,尤其是参与种子中樟脑合成的关键龙脑脱氢酶,并与阳春砂龙脑脱氢酶WvBDH进行比较,通过分析它们的功能和结构差异,阐释其与樟脑含量占比差异的关系。2.方法2.1 海南砂SDR classical家族全基因组水平的生物信息学分析基于海南砂全基因组序列,通过本地BLAST和Pfam蛋白数据库的登记号并结合隐马尔可夫模型(hidden Markovmodels,HMM)搜索结果,筛选海南砂SDR classical家族成员,用SDR Enzymes对获得的上述成员进行分组;对该家族进行染色体定位和共线性分析;结合代谢组和转录组,关注主要的樟脑积累器官以及在不同组织部位的积累趋势;结合进化树分析,获得候选基因。2.2 WlBDH候选基因的克隆与功能鉴定以候选基因表达量高的部位cDNA为模板,克隆候选的WlBDH基因,并构建重组表达载体,进行原核表达、融合蛋白诱导和纯化;以(+)-龙脑(海南砂内源底物)以及其相反构型龙脑和其他单萜醇为底物,进行体外酶促反应;使用GC-MS检测其催化产物。2.3 WlBDH和WvBDH表达模式分析设计相应的用于qPCR的引物,以海南砂7个不同组织部位(包括种子团、果皮、叶、花、茎、根状茎和根)以及阳春砂种子团的cDNA为模板,进行实时荧光定量PCR。同时运用Plant CARE对启动子进行预测分析并将结果可视化。2.4 WlBDH和WvBDH酶动力学分析以(+)-龙脑为底物,运用紫外分光光度法,对WlBDH和WvBDH进行酶动力学分析和比较。2.5 WlBDH同源建模与分子对接以鼠尾草龙脑脱氢酶SoBDH2为模板对阳春砂和海南砂的龙脑脱氢酶进行同源建模,比较两者蛋白结构差异;运用Autoduckvina,与右旋龙脑为底物进行分析对接,分析对接结果,比较催化中心关键氨基酸位点的差异。3.结果3.1 海南砂SDR classical家族成员的鉴定及候选基因筛选从海南砂基因组中鉴定了 109个SDR classical家族成员,共分为21个亚家族。通过染色体定位和共线性分析,发现海南砂SDR classical家族通过片段复制和串联复制进行家族的扩展。从龙脑脱氢酶归属的SDR110C亚家族中筛选在种子团中高表达以及与WvBDH聚类关系相近的候选基因,筛选出其中10个基因为WlBDH候选基因,包括9个SDR110C和1个SDR132C亚家族成员。3.2 WlBDH候选基因的克隆与功能鉴定10个WlBDH候选基因均被克隆并获得了其融合蛋白,其中只有7个WlSDR110C经鉴定具有龙脑脱氢酶的功能,分别命名为WlBDH1、WlBDH2、WlBDH3、WlBDH4、WlBDH5、WlBDH6 和 WlBDH7。这 7 个 WlBDH 均能催化(+)-龙脑生成(+)-樟脑,并且与以(-)-龙脑为底物时相比,均对(+)-龙脑具有更好的催化活性或者只对(+)-龙脑具有催化活性,其中WlBDH2催化活性最好;同时它们还能够催化其它单萜醇,具有一定的底物宽泛性。依据课题组前期对海南砂果实内源龙脑和樟脑构型的检测和分析结果,两者均为右旋构型,与上述WlBDH体外酶活对(+)-龙脑的偏好性一致。3.3 WlBDH表达模式分析及其与WvBDH的比较WlBDH2在种子团特异表达且表达量最高,而WlBDH3和WlBDH4则是在根、根状茎和茎具有较高表达。因此,推测WlBDH2主要负责种子团中樟脑的合成,而WlBDH3和WlBDH4则参与根、根状茎和茎中樟脑的合成,这与樟脑在海南砂的茎、根状茎及根中均有分布相符。以60DAF果实的种子团为实验材料,WvBDH2、WvBDH3 与 WlBDH2、WlBDH4 相比,WvBDH2表达量最高,WlBDH2次之。启动子分析发现海南砂和阳春砂BDH含

关键词：海南砂樟脑短链脱氢酶经典家族龙脑脱氢酶分子对接

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海南砂生殖生物学特性研究

广东农业科学 2014年第9期41卷 20-23,F0002页

作者：杨锐培许善雄陈蔚赖小平何国振广州中医药大学中药学院广东广州510006 中药资源科学教育部(省部共建)重点实验室广东广州510006

为了提高海南砂的产量,研究了其小花数目、花粉活力、柱头可授性、落果率等生殖生物学特性以及海南砂花粉在不同贮藏条件下的活力。结果表明,海南砂每个花序有7.28(±0.83)朵小花;小花的花期为1.5 d;离体萌发法测定花粉活力在花朵刚刚... 详细信息

为了提高海南砂的产量,研究了其小花数目、花粉活力、柱头可授性、落果率等生殖生物学特性以及海南砂花粉在不同贮藏条件下的活力。结果表明,海南砂每个花序有7.28(±0.83)朵小花;小花的花期为1.5 d;离体萌发法测定花粉活力在花朵刚刚开放时达83.6%,开花12 h后降为21.0%,24 h后降为11.4%;柱头和花粉在花朵开放6 h内都具极强可授性,寿命维持24 h,比花粉寿命长12 h以上;人工授粉率和自然授粉率分别为64.10(±29.80)%和17.55(±15.49)%、落果率为20.65(±31.39)%和11.11(±32.34)%。高湿度条件下贮藏花粉12 h后活力降为0.6%,而在低温高湿条件下贮藏花粉12 h的活力为23.4%,表明低温更有利于海南砂花粉贮藏。

关键词：海南砂花粉活力柱头可授性生殖生物学特性

阳春砂、绿壳砂与海南砂高效液相色谱指纹图谱比较研究

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中国药学杂志 2016年第12期51卷 1039-1043页

作者：申丽王洋江坤殷果王珏鲁艺王铁杰沈阳药科大学药学院沈阳110016 深圳市药品检验研究院广东深圳518057 深圳药品质量标准研究重点实验室广东深圳518057 深圳岭南道地药材资源开发与应用工程实验室广东深圳518057

目的探索建立阳春砂、绿壳砂和海南砂的高效液相色谱指纹图谱,并比较三者的差异。方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇(A)-0.05%甲酸溶液(B),二元梯度洗脱(0 min,5%A... 详细信息

目的探索建立阳春砂、绿壳砂和海南砂的高效液相色谱指纹图谱,并比较三者的差异。方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为Agilent ZORBAX SB-Aq C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相为甲醇(A)-0.05%甲酸溶液(B),二元梯度洗脱(0 min,5%A;5 min,5%A→15%A;10 min,15%A→26%A;20 min,26%A→40%A;45min,40%A→70%A;58min,70%A→100%A,63 min,100%A),检测波长为263 nm,柱温30℃,流速1.0 m L·min-1。采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012.0版本)和SPSS21.0对谱图进行相似度分析和聚类分析。结果从对照指纹图谱和聚类分析结果看,阳春砂与海南砂共有模式相似,两者与绿壳砂差别明显,分别建立对照指纹图谱,各有29和25个共有峰。结论首次建立了3种砂仁非挥发性成分HPLC指纹图谱,为不同品种砂仁的鉴别和质量控制提供参考。

关键词：高效液相色谱法指纹图谱阳春砂绿壳砂海南砂

阳春砂与绿壳砂、海南砂的ITS-1测序鉴别

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中药材 2001年第7期24卷 481-483页

作者：潘华新黄丰王培训周联曹柳英梁瑞燕广州中医药大学广州510405

目的:从分子水平鉴别阳春砂及其伪充品。方法:从阳春砂及其常见伪充品绿壳砂、海南砂中提DNA,以核基因组通用引物ITS-1为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果:样品ITS-1序列长度均为248bp,但绿壳砂有7个... 详细信息

目的:从分子水平鉴别阳春砂及其伪充品。方法:从阳春砂及其常见伪充品绿壳砂、海南砂中提DNA,以核基因组通用引物ITS-1为引物进行扩增,扩增产物经纯化后,用PCR产物直接测序法进行测序。结果:样品ITS-1序列长度均为248bp,但绿壳砂有7个碱基与阳春砂不同,海南砂有12个碱基与阳春砂不同。结论:1序列可有效地鉴别阳春砂及其伪充品。

关键词：阳春砂绿壳砂海南砂鉴别测序 ITS-1

超临界CO_2流体萃取海南砂有效成分的研究

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中药材 2000年第3期23卷 157-158页

作者：吴忠许寅超第一军医大学广州510515 第一军医大学珠江医院广州510282

用超临界CO_2流体萃取技术对海南砂有效成分进行萃取,用GC-MS-计算机联用技术对其进行分析。结果表明,海南砂化学成分与阳春砂基本一致,这为临床合理用药提供了依据。

关键词：海南砂 GC-MS分析萃取有效成分

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海南砂种子贮藏条件的研究

中国农学通报 2015年第36期31卷 87-91页

作者：胡佳佳徐建区陈轩辉何国振广州中医药大学中药学院广州510006 中药资源科学教育部(省部共建)重点实验室广州510006

为了探索海南砂种子的最佳贮藏条件,分别研究了沙磨、赤霉素(GA3)处理、贮藏条件、贮藏时间对海南砂种子萌发率的影响。以当年采收的海南砂种子为试验材料,对其进行沙磨、GA3处理,并将种子分别在不同条件下贮藏,进行种子萌发试验,统计... 详细信息

为了探索海南砂种子的最佳贮藏条件,分别研究了沙磨、赤霉素(GA3)处理、贮藏条件、贮藏时间对海南砂种子萌发率的影响。以当年采收的海南砂种子为试验材料,对其进行沙磨、GA3处理,并将种子分别在不同条件下贮藏,进行种子萌发试验,统计萌发率。研究结果表明:沙磨处理并不能显著提高海南砂种子的萌发率,但可促进GA3进入种子内部并发挥作用;GA3对海南砂种子萌发具有浓度效应,且80μmol/L GA3处理8 h效果较好,浓度过高则表现出抑制作用;阴室贮藏是海南砂种子的最佳贮藏方式,有利于种子后熟,最高萌发率可高至(97.78±3.84)%,最佳贮藏时间为8个月。该试验获得了海南砂种子的最佳贮藏条件,为推广海南砂播种育苗技术奠定了坚实的基础。

关键词：海南砂沙磨 GA3 贮藏

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海南砂种苗繁育技术规程

安徽农业科学 2017年第1期45卷 133-134,147页

作者：晏小霞王建荣王茂媛王清隆羊青任保兰王祝年中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所海南儋州571737

从种子繁殖、分株繁殖和组培繁殖的育苗技术,以及种苗病虫害防治、种苗出圃和包装运输等方面,明确规定了海南砂的种子苗、分株苗和组培苗生产技术规程,为海南砂种苗标准化生产提供依据。

关键词：海南砂种苗繁育标准操作规程

阳春砂龙脑基二磷酸合酶关键氨基酸位点筛选及突变体的构建

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中草药 2022年第2期53卷 529-537页

作者：赵圆圆孙叶雯郑诗敏李萌马东明杨锦芬广州中医药大学中药学院(中药数理工程研究院)岭南中药资源教育部重点实验室广东广州510006

目的对阳春砂萜类合成关键酶龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,BPP)的关键氨基酸位点解析,为阳春砂BPPS的功能优化并且促进其在代谢工程中的应用奠定基础。方法比较阳春砂... 详细信息

目的对阳春砂萜类合成关键酶龙脑基二磷酸合酶(bornyl diphosphate synthase,BPPS)催化生成龙脑基二磷酸(bornyl diphosphate,BPP)的关键氨基酸位点解析,为阳春砂BPPS的功能优化并且促进其在代谢工程中的应用奠定基础。方法比较阳春砂、海南砂的BPPS (AvBPPS、A1BPPS)及已报道的其余3种植物的BPPS,发现AvBPPS催化产生BPP的比率较高。通过分子建模和底物对接、保守基序预测,以及与其他BPPS、单萜合酶序列多重比对的方法,筛选关键氨基酸位点,探索决定AvBPPS产生BPP及其较高比率BPP的关键活性位点,据此设计突变体,并用快速定点突变的方法获得突变体。结果筛选出了20个可能影响AvBPPS催化的关键位点,并根据这些位点,设计了20个AvBPPS突变体及1个A1BPPS突变体,成功构建其中17个突变体,诱导表达获得了纯化蛋白。结论综合使用多种分析方法,理性设计BPPS的突变位点,并获得了相应突变体及蛋白,为通过氨基酸定点突变探索BPPS的催化机制及功能优化提供了基础。

关键词：阳春砂海南砂龙脑基二磷酸合酶定点突变蛋白表达