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海南捕鸟蛛毒蛋白的分离纯化与性质鉴定

海南捕鸟蛛毒蛋白的分离纯化与性质鉴定

作者：谷维娜河北大学

学位级别：硕士

本文采用软管刺激排毒法从海南捕鸟蛛(Ornithoctonus hainana)中采取了毒液，对粗毒液进行分析发现，粗毒中蛋白含量为79.6％，粗毒对蟋蟀的LD值为0.042mg／g，LD的95％置信区间为0.039～0.045mg／g。应用反相层析和阳离子交换分离方法... 详细信息

本文采用软管刺激排毒法从海南捕鸟蛛(Ornithoctonus hainana)中采取了毒液，对粗毒液进行分析发现，粗毒中蛋白含量为79.6％，粗毒对蟋蟀的LD值为0.042mg／g，LD的95％置信区间为0.039～0.045mg／g。应用反相层析和阳离子交换分离方法，从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化出一种对小鼠无毒但对昆虫有毒的毒素组分，命名为海南捕鸟蛛毒素a(HNTXa)。SDS-PAGE电泳图显示该毒素组分分子量较小，IEF-PAGE电泳图显示其等电点在8.15和8.45间。该毒素对鳞翅目棉铃虫和同翅目蟋蟀均有毒性，72h之后棉铃虫死亡率达30％;对蟋蟀的LD值为0.058mg／g，LD的95％置信区间为0.055～0.062mg／g。对该毒素进行蛋白质N端测序，结果发现该毒素有两个N端，这表明该毒素或者是一个不纯的物质，它由两个分子量近似的蛋白组成;或者是一个由两条肽链组成的蛋白。本文应用先进的反相层析技术对海南捕鸟蛛粗毒进行分离纯化。反相层析具有快速、高效和比较高的回收率等特点，所以在分离和制备上有它独特的优越性。国内外在蜘蛛毒液的分离纯化上大多采用此种方法。

关键词：海南捕鸟蛛多肽毒素反相层析分离纯化序列测定

海南捕鸟蛛毒素激活中电导钙激活钾通道的分子机制

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海南捕鸟蛛毒素激活中电导钙激活钾通道的分子机制

作者：黄娟湖南师范大学

学位级别：硕士

IK通道是由钙离子和电压双向门控的钾离子通道,广泛分布在机体多种类型细胞中,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和肌细胞等。同时IK通道与细胞生理活动的调控密切相关,如细胞数目增殖、细胞迁徙... 详细信息

IK通道是由钙离子和电压双向门控的钾离子通道,广泛分布在机体多种类型细胞中,如T淋巴细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞和肌细胞等。同时IK通道与细胞生理活动的调控密切相关,如细胞数目增殖、细胞迁徙、细胞凋亡焦亡以及基因控制的细胞程序性死亡等。目前研究发现IK通道与恶性肿瘤、气道重塑、心肌梗死、动脉粥样硬化、哮喘、肾纤维化、镰刀形红细胞病等多种疾病密切相关。海南捕鸟蛛毒素-I(HNTX-I)是从海南捕鸟蛛中分离得到的一种高丰度多肽,相对分子量为3608.1 Da,含有33个氨基酸残基,其序列为ECKGFGKSCVPGKNECCSGYACNSRDKWCKVLL。虽然HNTX-I是至今为止发现的第一个IK通道的多肽类激活剂,但其活性并不理想,而且HNTX-I毒素与IK通道的相互作用机制也并不清楚。为了解决上述问题,深入研究HNTX-I毒素与IK通道作用的分子机制,本实验合成HNTX-I及其11条突变体,分别为E1K、E1F、E1F-S18K、K3A、F5I、K7A、E15D、R25A、D26A、K27A、K30A。通过膜片钳实验验证发现,合成的HNTX-I的活性和天然的HNTX-I的活性一致,表明合成后复性的多肽与天然的HNTX-I的结构相同。在HNTX-I的一系列突变体中,K3A、F5I和K7A在40μM浓度下对IK通道无明显的激活作用,E1F、E1F-S18K和E1K对IK通道的激活率在40μM浓度下均高于HNTX-I的激活率。E1F对IK通道的活性最高,4μM的E1F激活率为20.1%±0.4%,40μM的E1F激活率为78.5%±0.5%,80μM的E1F激活率为112.5%±0.7%,经Boltzmann sigmoidal方程拟合E1F对IK通道激活的EC为8.01μM。上述结果表明,HNTX-I上的第1、3、5、7位氨基酸残基可能是毒素结合IK通道的关键位点,毒素主要利用N端氨基酸作用于IK通道。选取活性最高的HNTX-I突变体E1F研究HNTX-I与IK通道的结合机制。首先加入80μM的E1F后IK电流被显著激活,再加入100nM NS309继续能够激活IK通道电流大约1.25倍,加入1μM的TRAM-34能显著抑制IK被激活的电流。为了进一步探讨毒素与通道之间作用的结合机制,利用定点突变的方法对IK通道S1-S2、S3-S4、S5-S6的胞外区域进行丙氨酸扫描,构建了一系列IK通道突变体。在40μM浓度下,E1F对IK通道突变体W141A和T260A无明显的激活作用,但是对G259A的激活程度明显增强,说明这三个位点区域是毒素与通道作用的关键位置。S5-S6区域的Q229、V231、N232、T234、S238等突变后也显著的降低了和HNTX-I的亲和力。靠近S6的G259突变后可能由于疏水性减弱使E1F对IK通道的亲和力明显增强,相反T260突变后可能由于极性增强使相互作用力减弱。以上结果表明,HNTX-I毒素与IK通道相互作用可能是疏水作用的结果。

关键词： IK通道海南捕鸟蛛 HNTX-I 突变体多肽合成作用机制

海南捕鸟蛛毒素的结构与功能研究及虎纹镇痛肽-Ⅰ（HWAP-Ⅰ）的一般药理学研究

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海南捕鸟蛛毒素的结构与功能研究及虎纹镇痛肽-Ⅰ（HWAP-Ⅰ）的一...

作者：潘建义湖南师范大学

学位级别：硕士

摘要1：海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)是分布在我国海南岛一带，最近才被鉴定的蜘蛛新种，隶属捕鸟蛛科(Theraphosidae)。其生物学活性及形态特征与分布在我国云南、广西一带的虎纹捕鸟蛛极其相似，仅体色有差别。该蛛粗毒中含有多... 详细信息

摘要1：海南捕鸟蛛(Selenocosmia hainana)是分布在我国海南岛一带，最近才被鉴定的蜘蛛新种，隶属捕鸟蛛科(Theraphosidae)。其生物学活性及形态特征与分布在我国云南、广西一带的虎纹捕鸟蛛极其相似，仅体色有差别。该蛛粗毒中含有多种生物学活性成分。本文报道对其中两种活性成分进行研究的结果。 (1)利用阳离子交换色谱、反相高效液相色谱从粗毒中纯化出两种新型多肽毒素成分，分别命名为海南捕鸟蛛毒素-Ⅱ(Hainantoxin-Ⅱ，HNTX-Ⅱ)，海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ(Hainantoxin-Ⅵ，HNTX-Ⅵ)。 (2)Hainantoxin-Ⅱ能可逆的麻痹美洲蜚蠊等昆虫，其麻痹时间可长达十余小时，剂量增大时能使美洲蜚蠊致死。小鼠脑室注射该毒素亦能使小鼠死亡，但腹腔注射对小鼠无明显影响。很有可能Hainantoxin-Ⅱ只作用于小鼠的中枢神经系统，而对外周神经系统的作用不明显。Hainantoxin-Ⅵ能阻断小鼠膈神经膈肌标本的神经肌肉传递，脑室及硬膜外注射能使小鼠瘫软。这两种毒素对小鼠杂交瘤细胞细胞Na电流均无影响。 (3)质谱分析及氨基酸序列分析表明：Hainantoxin-Ⅱ为一条单一多肽链，分子量为4253.135Da。该多肽链含有37个氨基酸残基，其中有6个氨基酸残基为Cys，他们形成了3对二硫键。氨基酸全序列为：NH-LFECSVSCEIEKEGNKDCKKKKCKGGWKCKFNMCKV-COOH。同源性搜索表明HNTX-Ⅱ与虎纹捕鸟蛛毒素-Ⅱ(HWTX-Ⅱ)、捕鸟蛛Eurypelma californicum中的一种毒素ESTX及蜘蛛Brachypelma smithii成分中的Venom protein 1有很高的同源性。尤其是与HWTX-Ⅱ，其同源性高达95％，37个残基中仅有3个残基不同。HNTX-Ⅵ的分子量为3998.5Da，序列为NH-ECKYLWGTCEKDEHCCEHLGCNKKHGWCGWDGTF-COOH，其中的6个Cys形成3对二硫键。该毒素与两种K通道阻断剂(智利捕鸟蛛Grammostola spatulata毒素HaTx和蜘蛛Hysterocrates gigas中的SGTx1毒素)有很中文摘要高的同源性。 (4)对1诬NTX一H的二级结构进行预测。

关键词：海南捕鸟蛛海南捕鸟蛛毒素-Ⅱ 海南捕鸟蛛毒素-Ⅵ 神经毒素杀虫肽 K+通道阻断剂

Arg26和Lys27突变对海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ生物活性影响

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中国生物化学与分子生物学报 2005年第4期21卷 499-503页

作者：熊霞徐侠李冬玲陈平梁宋平湖南师范大学生命科学学院长沙410081

海南捕鸟蛛毒素Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是一种新型的从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化的作用于河豚毒素敏感型(tetrodotoxinsensitive,TTXS)钠通道阻断剂.采用2D1HNMR技术解析HNTXⅣ的空间结构为胱氨酸抑制剂结模体,为进一步阐述HNTX-Ⅳ... 详细信息

海南捕鸟蛛毒素Ⅳ(hainantoxin-Ⅳ,HNTX-Ⅳ)是一种新型的从海南捕鸟蛛粗毒中分离纯化的作用于河豚毒素敏感型(tetrodotoxinsensitive,TTXS)钠通道阻断剂.采用2D1HNMR技术解析HNTXⅣ的空间结构为胱氨酸抑制剂结模体,为进一步阐述HNTX-Ⅳ结构与功能的关系,应用固相Fmoc方法化学合成了用丙氨酸代替海南捕鸟蛛毒素Ⅳ第26位精氨酸的单残基突变体R26AHNTXⅣ和第27位赖氨酸的单残基突变体K27AHNTXⅣ.合成的突变体用谷胱甘肽法氧化复性并通过反相高效液相色谱(RPHPLC)纯化.通过MALDITOF质谱测定突变体的分子量.通过核磁共振谱仪测定突变体的空间结构.通过全细胞膜片钳实验比较天然HNTX-Ⅳ(nHNTX-Ⅳ)和两个突变体分子的生物学活性.结果发现,nHNTX-Ⅳ的R26或K27被突变后的空间结构没有发生明显变化.R26AHNTX-Ⅳ能明显抑制TTXS钠电流,K27AHNTX-Ⅳ对TTXS钠电流无明显影响.说明第26位的精氨酸与HNTX-Ⅳ的生物学活性无关,而第27位赖氨酸则是HNTX-Ⅳ的关键残基.

关键词：海南捕鸟蛛 HNTX-Ⅳ 突变体固相多肽合成生物活性

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海南捕鸟蛛筑巢巢居特征研究

经济动物学报 2021年第3期25卷 173-178页

作者：吴海霞张何信符溶钟圣赟凌家如吕朝军海南省林业科学研究所通什分所中国热带农业科学院椰子研究所

为加强对海南捕鸟蛛(Cyriopagopus hainanus)的保育利用,在海南省三亚育才镇、乐东尖峰岭、五指山市三地,采用踏查和详查相结合的方式对海南捕鸟蛛巢穴生境特性及不同生境条件下巢穴密度与几何特征等筑巢生态学特征进行了研究。结果表明... 详细信息

为加强对海南捕鸟蛛(Cyriopagopus hainanus)的保育利用,在海南省三亚育才镇、乐东尖峰岭、五指山市三地,采用踏查和详查相结合的方式对海南捕鸟蛛巢穴生境特性及不同生境条件下巢穴密度与几何特征等筑巢生态学特征进行了研究。结果表明:海南捕鸟蛛适宜活动温度为24.0～27.3℃,巢周相对湿度为88%左右,多筑巢于西坡、南坡和西南坡的坡面与坎面上。其成体蛛巢密度的排序为次生林>橡胶林>槟榔林。成体蛛巢穴洞口直径和洞穴容积在三亚育才镇不同植被类型下差异显著(P次生林>槟榔林;当植被类型为次生林时,成体蛛巢洞口直径和洞穴容积在三亚育才镇显著大于其他调查地(P蛛巢洞穴容积在五指山市显著小于三亚育才镇(P蛛巢仅五指山市不同植被类型下的洞深值具有显著差异,表现为槟榔林下显著大于次生林下(P海南捕鸟蛛巢穴的分布、密度与几何特征。

关键词：海南捕鸟蛛生境巢密度巢穴几何特征

1.光温敏核不育水稻F2(培矮64S×9311)幼穗减数分裂期蛋白质组的初步分析　2.海南捕鸟蛛毒素-Ⅳ的两种突变体R26A和K27A的合成与生理活性分析

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1.光温敏核不育水稻F2(培矮64S×9311)幼穗减数分裂期蛋白质组的...

作者：熊霞湖南师范大学

学位级别：硕士

第一部分光温敏核不育水稻F2(培矮64S×9311)幼穗减数分裂期蛋白质组学的初步分析光温敏核不育水稻是有中国特色和巨大应用前景的生物资源,随着两系杂交稻的大面积推广,其育种应用已非常成功。本实验试图从蛋白质角度寻找光温敏... 详细信息

第一部分光温敏核不育水稻F2(培矮64S×9311)幼穗减数分裂期蛋白质组学的初步分析光温敏核不育水稻是有中国特色和巨大应用前景的生物资源,随着两系杂交稻的大面积推广,其育种应用已非常成功。本实验试图从蛋白质角度寻找光温敏核不育水稻基因的特异表达产物。光温敏核不育水稻的雄性核不育基因只有在外界环境的诱导下才能表达,如温度和光照时间。在本实验室对培矮64S已进行的高温长日、高温短日、低温长日、低温短日处理的幼穗蛋白质组研究的基础上,进一步对培矮64S×9311的杂交F代(包括可育和不育植株)进行研究,为进一步阐明水稻光温核不育的机理提供依据。我们采用固相pH梯度-SDS聚丙烯酰胺双向凝胶电泳对光温敏核不育水稻(培矮64S×9311)F代减数分裂期幼穗蛋白质(对可育和不育单株分别进行编号)进行了分离,在适当的样品上样量、电泳参数和凝胶浓度等条件下,得到重复性较好的凝胶图谱。用PDQUEST 2-D胶图象分析软件获得了光温敏核不育条件和可育条件下减数分裂期幼穗差异蛋白质图谱并通过ESI-Q-TOF对这些差异蛋白质点进行了鉴定。初步对双向电泳凝胶上74个蛋白质点作了归属。并对在可育和不育两种生理条件下的13个上调,下调和有无差异蛋白质以及一些非差异蛋白质进行了分子功能及生物过程的数据库搜索。

关键词：海南捕鸟蛛 HNTX-IV 突变体固相多肽合成生物活性双向凝胶电泳蛋白质组水稻 ESI-Q-TOF

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海南捕鸟蛛毒素及体液的抗菌活性研究

蛛形学报 2008年第1期17卷 46-49页

作者：林元山吴卫明王智湖南农业大学生物科学技术学院长沙410128 湖南永州职业技术学院永州425006

采用杯碟法研究了海南虎纹捕鸟蛛粗毒和体液对革兰氏阴性菌、阳性菌、霉菌和酵母的抑菌效果。结果表明,粗毒和体液均能抑制革兰氏阳性菌、阴性菌和霉菌的生长,但对酵母无抑制效果,并且粗毒和体液有一定的协同抗菌作用。

关键词：海南捕鸟蛛毒素体液抗菌作用协同作用

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海南捕鸟蛛毒腺cDNA文库的构建

海南捕鸟蛛毒腺cDNA文库的构建

我国狒蛛科一新种及海南捕鸟蛛的分类研究(蛛形纲:蜘蛛目)

第八届中国生物毒素学术研讨会

作者：唐兴梁宋平湖南师范大学生命科学学院

通过 Creator SMARTcDNA Library Construction 技术,本文构建了海南捕鸟蛛毒腺 cDNA 文库。经过测定,该文库的滴度大于1.0×10pfu/mL,插入 cDNA 片段范围约为0.4-1.0Kb。通过序列测定和分析,共获得146条 cDNA,它们编码76条多肽毒素。... 详细信息

通过 Creator SMARTcDNA Library Construction 技术,本文构建了海南捕鸟蛛毒腺 cDNA 文库。经过测定,该文库的滴度大于1.0×10pfu/mL,插入 cDNA 片段范围约为0.4-1.0Kb。通过序列测定和分析,共获得146条 cDNA,它们编码76条多肽毒素。这些多肽包括作用于 K、Na、Ca2 离子通道的毒素,以及可能具有酶抑制剂作用的 Kunitz 型毒素。海南捕鸟蛛毒腺的 cDNA 文库构建, 为深入研究海南捕鸟蛛毒素的组分及其进化关系奠定了基础.

关键词：海南捕鸟蛛毒腺 cDNA文库离子通道

来源： cnki会议 cnki会议评论

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保定师专学报 2001年第2期14卷 1-6页

作者：朱明生宋大祥李廷辉河北大学生命科学学院河北保定071002 南方蜘蛛养殖研究所广西南宁530000

报道了产于中国海南省狒蛛科棒刺蛛亚科 Selenocosmiinae缨毛蛛属一新种：敬钊缨毛蛛 Chilobrachys ***.。通过对海南捕鸟蛛 Selenocosmia hainana Liang et al., 1999的研究，认为该种应转移到捕鸟蛛亚科 Ornithoctoninae的捕鸟蛛属 Or... 详细信息

报道了产于中国海南省狒蛛科棒刺蛛亚科 Selenocosmiinae缨毛蛛属一新种：敬钊缨毛蛛 Chilobrachys ***.。通过对海南捕鸟蛛 Selenocosmia hainana Liang et al., 1999的研究，认为该种应转移到捕鸟蛛亚科 Ornithoctoninae的捕鸟蛛属 Ornithoctonus，并对海南捕鸟蛛 Ornithoctonus hainana (Liang et al., 1999)的雌蛛及新发现的雄性进行了描述和图示。

关键词：蜘蛛目狒蛛科棒刺蛛亚科捕鸟蛛亚科缨毛蛛属捕鸟蛛属海南捕鸟蛛新种中国