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孤独症风险基因chd8在小脑早期发育中的作用

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孤独症风险基因chd8在小脑早期发育中的作用

作者：蒋志文南昌大学

学位级别：硕士

孤独症(Autism Spectrum Disorder,ASD)是一种神经发育紊乱性疾病,主要表现为社会交流交互障碍、兴趣狭隘以及重复刻板行为。目前孤独症的发病原因和致病机制尚不明确。多个脑区病变与孤独症相关,越来越多证据表明小脑也参与其中。大量... 详细信息

孤独症(Autism Spectrum Disorder,ASD)是一种神经发育紊乱性疾病,主要表现为社会交流交互障碍、兴趣狭隘以及重复刻板行为。目前孤独症的发病原因和致病机制尚不明确。多个脑区病变与孤独症相关,越来越多证据表明小脑也参与其中。大量孤独症患者存在小脑缺陷,包括小脑体积减小以及浦肯野细胞数量减少和形态异常等。动物模型研究也表明,小脑尤其是浦肯野细胞异常导致孤独症样症状。CHD8是近年来发现的孤独症高风险基因之一,有研究报道在小鼠的颗粒细胞中敲除Chd8导致其发育缺陷和功能异常,但在出生后浦肯野细胞中敲除Chd8并未发现显著影响。本课题以斑马鱼为模型研究chd8在小脑发育中的作用。我们发现chd8突变导致小脑颗粒细胞前体的基因表达异常,分化成熟颗粒细胞的数量下降,将来发育成小脑亚区的细胞集簇也有不同程度的减小。这些结果表明chd8在斑马鱼颗粒细胞发育中的作用与小鼠类似。令人惊讶的是,我们发现chd8突变导致小脑浦肯野细胞前体减少,并且分化成熟的浦肯野细胞总体数量大幅减少,其分布格局也发生改变,表明浦肯野细胞的分化成熟和迁移障碍。这些结果与小鼠中的发现似乎矛盾,这可能与小鼠中敲除Chd8的时间是在出生后有关,因此我们推测Chd8可能在胚胎期调节浦肯野细胞的发育,正如我们观察到的斑马鱼中chd8突变导致浦肯野细胞前体发育缺陷。同时,我们发现在chd8突变体中,与浦肯野细胞发育密切相关的维甲酸相关孤核受体(roraa)表达水平降低,类似于孤独症病人小脑RORA表达降低的现象。在胚胎发育早期用RORA的转录激动剂SR1078处理后,chd8突变所致小脑浦肯野细胞发育缺陷在一定程度上得到改善,进一步表明chd8在胚胎早期调节浦肯野细胞的发育。综上,本课题研究发现孤独症基因chd8既调节小脑颗粒细胞的发育,也调节浦肯野细胞的早期发育,为进一步研究chd8通过调节小脑发育参与孤独症的致病机制打下实验基础,也为改善孤独症症状提供了潜在研究靶标。

关键词：孤独症 chd8 小脑发育浦肯野细胞颗粒细胞

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SMEK1在小脑发育中的作用研究

SMEK1在小脑发育中的作用研究

作者：孙悦清山东大学

学位级别：硕士

SMEK1是蛋白磷酸酶4(PP4)的一个调节亚基,也被称为PP4R3α。研究表明,SMEK1在神经发生中发挥重要作用,实验室前期发现该基因突变促进3型脊髓小脑共济失调的进展,且机制尚不明确。研究表明,小脑发育异常与脊髓小脑共济失调密切相关。因此... 详细信息

SMEK1是蛋白磷酸酶4(PP4)的一个调节亚基,也被称为PP4R3α。研究表明,SMEK1在神经发生中发挥重要作用,实验室前期发现该基因突变促进3型脊髓小脑共济失调的进展,且机制尚不明确。研究表明,小脑发育异常与脊髓小脑共济失调密切相关。因此,本文通过Smek1基因敲除小鼠研究Smek1在小脑发育过程中的作用及机制,以期丰富SMEK1突变促进脊髓小脑共济失调的病理机制。首先,我们通过RNA和蛋白检测,发现SMEK1在出生后第八天(P8)野生型小鼠各个组织中广泛表达,并且在神经系统,尤其是小脑中表达量较高。对SMEK1在小鼠的小脑不同时期的表达模式进行检测,我们发现SMEK1在各个时期的小脑中表达量均很高。通过免疫组织化学染色,发现SMEK1在小脑的颗粒细胞及浦肯野细胞中都有表达,在浦肯野细胞中表达量较高,说明SMEK1在小脑发育中可能发挥重要作用。同时,我们发现Smek1纯合敲除小鼠出生比例不符合孟德尔分离率。因此我们对不同胚胎时期小鼠进行了基因型统计,在E12.5及E16.5时,纯合胎鼠比例正常,而胚胎发育晚期E18.5时,纯合胎鼠比例降低,不符合孟德尔分离率。这些结果表明Smek1缺失会导致晚期胚胎部分致死的情况,说明Smek1在小鼠胚胎发育中扮演着重要的角色。在验证了Smek1敲除效率后,我们检测了敲除小鼠的生长发育状况。我们发现纯合敲除小鼠体型小,发育迟缓,具体表现为从P4开始纯合敲除小鼠体重始终低于野生型和杂合子小鼠。因此,SMEK1对于小鼠出生后的正常生长发育至关重要。接下来,本文对小鼠进行了行为学分析。步态分析结果发现,纯合敲除小鼠的步态出现共济失调及步幅变小的现象。我们还对P8小鼠进行了翻正实验,发现与野生型及杂合子小鼠相比,纯合敲除小鼠需要花费更长时间。这些实验结果说明,Smek1敲除影响小鼠的运动协调能力。在对小鼠的大脑和小脑的观察中,我们发现P8、P15纯合敲除小鼠的小脑体积明显小于野生型小鼠。通过石蜡切片及H&E染色,我们发现发育期及成年纯合敲除小鼠小脑均小于野生型,且小脑部分脑叶沟回变浅以及外颗粒细胞层(EGL)变薄,这些结果说明Smek1敲除影响了小脑的发育。通过EdU掺入实验和免疫荧光染色实验,我们发现EGL的颗粒细胞前体细胞(GCPs)增殖减少,提前退出细胞周期并进入分化阶段。通过TUNEL及免疫荧光染色实验,我们发现凋亡没有异常。除此之外,纯合敲除小鼠小脑胶质细胞增多以及单极刷状细胞减少。通过免疫荧光染色,我们发现纯合敲除小鼠浦肯野细胞(PCs)数量减少,分子层变薄。为了进一步研究SMEK1对PCs的影响,我们进行了高尔基染色。发现与野生型小鼠相比,成年纯合敲除小鼠PCs胞体变小,初级树突轴直径变细,树突分支复杂性降低,树突棘密度降低。结果表明,SMEK1在浦肯野细胞发育成熟过程中起着重要的作用。综上所述,SMEK1在小脑发育发挥重要作用,Smek1缺失会导致小鼠小脑发育异常及运动协调能力受损。因此,SMEK1突变导致的小脑发育异常可能是加重脊髓小脑共济失调患者症状的原因。

关键词：脊髓小脑共济失调 SMEK1 胚胎致死小脑发育浦肯野细胞

中缝5－HT能纤维传入抑制小脑浦肯野细胞的反应

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广西师范大学学报（自然科学版） 1995年第3期13卷 83-88页

作者：王晓燕冯丽冰广西师范大学生物系

中缝──小脑的５－ＨＴ能纤维传入可抑制小脑浦肯野细胞（ＰＣ）的自发活动．本实验采用条件──测试刺激法研究中缝５－ＨＴ能传入对小脑浦肯野细胞诱发活动的作用．实验在３０只大白鼠上进行，在小脑皮层第Ⅵ，Ⅶ小叶记录ＰＣ的诱发... 详细信息

中缝──小脑的５－ＨＴ能纤维传入可抑制小脑浦肯野细胞（ＰＣ）的自发活动．本实验采用条件──测试刺激法研究中缝５－ＨＴ能传入对小脑浦肯野细胞诱发活动的作用．实验在３０只大白鼠上进行，在小脑皮层第Ⅵ，Ⅶ小叶记录ＰＣ的诱发产生简单峰电位（ＳＳ）和复杂峰电位（ＣＳ）的发放．结果发现中缝背核（ＤＲ）的条件刺激不改变ＳＳ和ＣＳ的自发频率，但可对由皮层感觉运动区刺激所诱发的ＳＳ和ＣＳ发放起显著的压抑作用，５－ＨＴ受体阻断剂可阻断ＤＲ的上述压抑作用．

关键词：中缝背核 5-HT 浦肯野细胞诱发反应小脑

MAPK/ERK信号通路参与褪黑素对阿尔茨海默病大鼠小脑的神经保护作用

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中国药理学通报 2019年第3期35卷 402-407页

作者：刘亭毕竟王盼任丽莉张露允隋汝波锦州医科大学附属第一医院神经内科三病区辽宁锦州121000 锦州医科大学辽宁省神经退行性疾病重点实验室辽宁锦州121000 锦州医科大学基础医学院神经生物学教研室辽宁锦州121000

目的观察褪黑素能否通过MAPK/ERK信号通路,发挥对阿尔茨海默病大鼠小脑的神经保护作用。方法将32只♂SD大鼠随机分为4组:对照组、Aβ_(1-42)侧脑室注射组(AD)、褪黑素腹腔注射组(MT)、Aβ_(1-42)侧脑室注射结合褪黑素腹腔注射组(AD+MT)... 详细信息

目的观察褪黑素能否通过MAPK/ERK信号通路,发挥对阿尔茨海默病大鼠小脑的神经保护作用。方法将32只♂SD大鼠随机分为4组:对照组、Aβ_(1-42)侧脑室注射组(AD)、褪黑素腹腔注射组(MT)、Aβ_(1-42)侧脑室注射结合褪黑素腹腔注射组(AD+MT)。HE染色观察各组大鼠小脑皮层的病理学变化;免疫荧光染色观察各组颗粒细胞标记物NeuN、浦肯野细胞标记物Calbindle和p-ERK蛋白的表达情况;Western blot检测各组小脑组织中p-ERK蛋白的表达。结果 HE染色结果显示,AD组大鼠小脑皮层的神经元数量减少,细胞排列紊乱,细胞形态改变,褪黑素可明显减轻侧脑室注射Aβ_(1-42)对小脑的病理学损害;免疫荧光结果显示,与AD组相比,AD+MT组颗粒细胞标记物NeuN的蛋白表达增加,以Calbindin标记的浦肯野细胞个数明显增多(P<0.01), p-ERK蛋白表达减少(P<0.01);Western blot结果显示,与AD组相比,AD+MT组小脑组织中p-ERK蛋白表达水平降低。结论褪黑素可能通过抑制MAPK/ERK信号通路的激活,发挥对小脑皮层神经原的保护作用。

关键词：褪黑素 MAPK/ERK信号通路小脑阿尔茨海默病神经保护浦肯野细胞

心脏浦肯野细胞起搏离子流——从ik2到if

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生理科学进展 1988年第3期 252-255页

作者：徐有秋上海第二医科大学生理学教研室

ik2是心脏浦肯野细胞起搏离子流的假设,随着对多细胞标本电压钳制术实验伪差积聚、减失现象的发现,了解到 ik2实质上是起搏离子流 if 和减失电流的混合物。if 是一个因复极化到-50mV 而开始激活的内向离子流,其主要成份为钠离子。

关键词：起搏离子流钾平衡电位 k2 i_f 浦肯野细胞心脏

巨细胞网状核5-HT能纤维对小脑浦肯野细胞自发电活动的影响

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江苏师范大学学报（自然科学版） 1993年第2期23卷 33-40页

作者：董金辉徐州师范学院生物系

用电生理学方法、观察了小脑皮层第Ⅵ—Ⅶ小叶蚓部的浦肯野细胞（Purkinje cell,PC）对巨细胞网状核（Gigantocellularis reticularis nucleus,GI）刺激的反应特性,并观察了颈静脉注射5-羟色胺（5-HT）受体阻断剂二甲麦新碱（Methyserg... 详细信息

用电生理学方法、观察了小脑皮层第Ⅵ—Ⅶ小叶蚓部的浦肯野细胞（Purkinje cell,PC）对巨细胞网状核（Gigantocellularis reticularis nucleus,GI）刺激的反应特性,并观察了颈静脉注射5-羟色胺（5-HT）受体阻断剂二甲麦新碱（Methysergide）后GI刺激的效应。结果表明:（1）刺激GI对小脑皮层Ⅵ—Ⅶ小叶PC自发放电的影响有抑制（41％）、兴奋（27％）及无明显作用（32％）三种形式,其中以抑制性作用为主。（2）GI刺激引起的PC反应在小脑皮层上呈区域性差异,表现为由VIA（64.3％）、VTB（65.3％）、VIC（71.4％）至Ⅶ小叶（74.2％）PC反应比率逐渐升高。（3）颈静脉注射二甲麦角新碱后,由GI刺激引起的PC自发放电的抑制性效应可逐渐被消除,而兴奋性效应则不被减弱。结果提示:GI—小脑之间存在着5-HT能纤维投射,这些5-HT能纤维可能以“非突触释放”的形式调节着PC的机能活动。PC对GI刺激反应的区域性差异,可能与GI—小脑5-HT能纤维投射的解剖学分布特性有关。

关键词：巨细胞网状核 5-HT能纤维小脑皮层浦肯野细胞自发放电

小脑微量注射cdc2-siRNA对C型尼曼-匹克病小鼠共济运动的影响

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中华行为医学与脑科学杂志 2017年第11期26卷 972-976页

作者：魏佳军曾非降风武汉大学人民医院神经内科武汉430060 武汉同济医院神经内科武汉430030

目的观察抑制cdc2基因的异常激活对C型尼曼-匹克病（Niemann-PickdiseasetypeC，NPC）小鼠共济运动的影响。方法包装携带ode2-siRNA的重组腺相关病毒（rAAV），将该病毒注射至2周龄npc-/-小鼠的小脑中，8周龄时采用足印实验、垂直屏实... 详细信息

目的观察抑制cdc2基因的异常激活对C型尼曼-匹克病（Niemann-PickdiseasetypeC，NPC）小鼠共济运动的影响。方法包装携带ode2-siRNA的重组腺相关病毒（rAAV），将该病毒注射至2周龄npc-/-小鼠的小脑中，8周龄时采用足印实验、垂直屏实验检查小鼠的共济运动，并用HE染色及蛋白免疫印迹法分别检查小脑浦肯野细胞数量及微管相关蛋白Tau的磷酸化（由PHF-1抗体识别）情况。结果（1）足印实验显示cdc2-siRNAnpc组的步长[（4．92±0．31）cm]比空载体npe。组[（4．05±0．19）em]显著增加（P〈O．05）。（2）垂直屏实验显示cdc2-siRNAnpc。一组小鼠转头向r、爬至网屏上边缘的时间[（26．01±1．82）s、（50．93±1．98）s]分别比空载体npc组[（31．96±3．47）s、（56．89±2．97）S]明显缩短（均P〈0．05）。（3）cde2-siRNAnpe。一组小鼠小脑浦肯野细胞数目[（11．0±2．5）个]较空载体npc组[（5．1±2．2）个]显著增加（P〈0．05）。（4）cdc2-siRNAnpc。组小鼠cdc2及磷酸化Tau蛋白免疫反应条带相对灰度值（1．42±0．22、0．95±0．31）分别较空载体npc-/-组（2．11±0．29、2．61±0．62）明显降低（均P〈0．05）。结论抑制cdc2基因的异常激活可通过挽救浦肯野细胞的脱失和减轻小脑Tau蛋白的过度磷酸化以改善npe-/-小鼠的共济运动。

关键词： C型尼曼-匹克病共济运动细胞分裂周期蛋白2 浦肯野细胞

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m6A修饰对小鼠小脑发育的调控作用研究

m6A修饰对小鼠小脑发育的调控作用研究

作者：林小燕哈尔滨工业大学

学位级别：硕士

mA是一种在mRNA和非编码RNAs中广泛存在的,动态且可逆的甲基化修饰。在神经发育以及神经环路形成等过程中mA修饰发挥着调控作用。但是,现进行的研究主要是对mA的甲基化修饰酶“writers(刻写器)”和去甲基化修饰酶“erasers(擦除器)”的... 详细信息

mA是一种在mRNA和非编码RNAs中广泛存在的,动态且可逆的甲基化修饰。在神经发育以及神经环路形成等过程中mA修饰发挥着调控作用。但是,现进行的研究主要是对mA的甲基化修饰酶“writers(刻写器)”和去甲基化修饰酶“erasers(擦除器)”的研究,而对mA修饰的识别和结合蛋白“readers(阅读器)”的研究很少,具体在mA修饰调控小脑发育的研究中,其readers的功能和机制目前还未见报道。本课题利用神经系统特异性表达的Nestin-cre敲除mA的writer METTL14,发现METTL14敲除后的小鼠体型明显变小,小脑萎缩。鉴于敲除writer后导致严重的小脑发育缺陷,说明mA修饰对于小脑发育至关重要。我们分别在小脑的两类主要神经元即浦肯野细胞和颗粒细胞中分别研究mA修饰,本课题主要集中研究mA修饰对浦肯野细胞发育和功能的调控作用和机制。本课题利用Rosa26m T/m G报告基因鼠确定了小脑浦肯野细胞特异表达的L7-cre和Pcp2-cre在小脑中的表达谱,我们发现L7-cre的表达要早于Pcp2-cre。因为后者表达过晚,对于浦肯野细胞发育研究的用途比较有限,我们在本课题研究中主要使用了L7-cre小鼠。我们将Cre鼠分别与Mettl14fl/fl,Ythdf1fl/fl和Ythdf2fl/fl交配收集c KO和同窝对照ctrl小鼠,经过灌流固定,脱水包埋,冷冻切片和免疫荧光观察敲除后对小鼠小脑浦肯野细胞发育的影响,包括浦肯野细胞产生,树突发育等参数,同时也进行小脑功能相关的一些行为学测验,包括Rota rod、Grip Strength、Open field和Footprint这四种方法,观察敲除后对小鼠小脑控制的运动功能的影响。我们初步发现浦肯野细胞中特异性敲除METTL14、YTHDF1或YTHDF2后,小脑浦肯野细胞的产生和早期发育没有受到明显的影响,对整个小脑的早期发育也没有产生明显的影响。但是在Rota rod行为学测验中,浦肯野细胞特异性敲除的Ythdf2 c KO小鼠的运动协调能力表现出了明显的增强,而Ythdf1 c KO小鼠的行为学测验没有明显差异。因此我们初步可以得出浦肯野细胞中的阅读器蛋白YTHDF2可能是调控小脑功能的一个重要reader。通过后续进一步的机制研究,我们将阐释mA修饰通过其阅读器蛋白调控小脑神经环路和功能的作用和机制。

关键词： m6A YTHDF1 YTHDF2 小脑浦肯野细胞行为学

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家鸽小脑皮层浦肯野细胞电活动的研究

Zoological Research 1999年第3期20卷 239-240,177页

作者：陈蓉王彬湛江师范学院生物系西南师范大学生命科学系

神经解剖学和组织化学的研究资料指出，鸟类小脑的组织学结构与哺乳类的相似，其皮层也由分子层、浦肯野细胞层和颗粒层构成（Ａｒｅｎｄｓ，１９８５）。与哺乳动物相比，鸟类的小脑皮层发育不完善，在组织学特征上小脑皮层的浦肯野细... 详细信息

神经解剖学和组织化学的研究资料指出，鸟类小脑的组织学结构与哺乳类的相似，其皮层也由分子层、浦肯野细胞层和颗粒层构成（Ａｒｅｎｄｓ，１９８５）。与哺乳动物相比，鸟类的小脑皮层发育不完善，在组织学特征上小脑皮层的浦肯野细胞（Ｐｕｒｋｉｎｊｅｃｅｌ，ＰＣ）...

关键词：家鸽小脑皮层浦肯野细胞桡神经刺激电生理