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金雀异黄酮预适应对大鼠小脑浦肯野细胞缺血再灌注损伤的保护作用

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中国老年学杂志 2012年第13期32卷 2758-2760页

作者：赵士弟黄丽姜之全姜丽娜王小娇陈前芬蚌埠医学院病理生理学教研室安徽蚌埠233030 蚌埠医学院第一附属医院神经外科

目的建立糖氧剥夺(OGD)的缺血再灌注模型,观察金雀异黄酮(GEN)预适应对小脑浦肯野细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法制备SD大鼠小脑脑片,人工脑脊液灌流培养。脑片分为正常对照组、缺血再灌注(I/R)组、GEN 200、100、50 mmol/L预适应... 详细信息

目的建立糖氧剥夺(OGD)的缺血再灌注模型,观察金雀异黄酮(GEN)预适应对小脑浦肯野细胞缺血再灌注损伤的保护作用。方法制备SD大鼠小脑脑片,人工脑脊液灌流培养。脑片分为正常对照组、缺血再灌注(I/R)组、GEN 200、100、50 mmol/L预适应组和尼莫地平组。GEN培养20 min,OGD 20 min,再灌注4 h。采用HE染色,观察GEN作用下小脑浦肯野细胞未受损伤的百分比,检测小脑组织中肌酸肌酶(CK)活力。结果与正常对照组比较,I/R能明显诱导小脑浦肯野细胞死亡(P浦肯野细胞存活率明显升高(P浦肯野细胞存活率明显升高(P浦肯野细胞I/R损伤具有保护作用。

关键词：金雀异黄酮预适应脑片浦肯野细胞缺血再灌注损伤

孕期酒精暴露对子鼠小脑浦肯野细胞自噬影响的实验性研究

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孕期酒精暴露对子鼠小脑浦肯野细胞自噬影响的实验性研究

作者：张俊士河南大学

学位级别：硕士

细胞的自噬（autophagy）是近十年来生命科学领域一个新的研究热点,它是继凋亡（apoptosis）之后发现的另一种程序性细胞死亡方式。自噬现象可见于细胞正常的生长发育及其病理变化过程,在降解胞内蛋白、蛋白结构重建、清除废物、保持细... 详细信息

细胞的自噬（autophagy）是近十年来生命科学领域一个新的研究热点,它是继凋亡（apoptosis）之后发现的另一种程序性细胞死亡方式。自噬现象可见于细胞正常的生长发育及其病理变化过程,在降解胞内蛋白、蛋白结构重建、清除废物、保持细胞内环境稳定等方面发挥着非常重要的作用。在阐释自噬发生机制方面,人们对于酒精的毒性作用与细胞自噬的关系,特别是对神经元的影响研究较少。在胚胎发育的关键时期遭受宫内酒精的暴露,会对胚胎神经系统的发育造成较为严重的损害。本课题通过建立妊娠期酒精暴露动物模型,模拟胎儿酒精综合征（Fetal Alcohol Syndrome, FAS）的发生,应用透射电子显微镜、免疫细胞化学染色及Western blotting等技术,对孕期酒精暴露后不同年龄段的仔鼠小脑浦肯野（Purkinje）细胞自噬现象进行系统的研究,结果如下： 1.孕期酒精暴露影响仔鼠小脑Purkinje细胞的发育利用免疫细胞化学染色的方法,在对照组与模型组间对P7～P30年龄段仔鼠的Purkinje细胞发育的一般形态进行比较,结果显示酒精模型组较对照组Purkinje细胞在发育上存在着一般形态学上的差异,如皮质层变薄、细胞胞体变小、细胞排列混乱、树突分支减少、树突棘密度降低等,特别是高剂量酒精组变化更明显。这说明酒精暴露影响了子代小脑Purkinje细胞的发育,且有剂量依赖效应。 2.透射电子显微镜观察证实孕期酒精暴露后Purkinje细胞自噬的发生一直以来,透射电子显微镜都是判断自噬发生的金标准。我们利用透射电子显微镜技术,观察对照组与模型组小脑Purkinje细胞胞质内微观结构变化,结果发现：酒精暴露后Purkinje细胞自噬作用明显增强。酒精模型组较对照组,特别是高剂量酒精组细胞胞质内,发现较多自噬体或自噬溶酶体样结构,并且其细胞器普遍存在如线粒体结构肿胀、线粒体嵴受损,高尔基体扁平囊扩张、大小泡结构崩解,粗面内质网扩张等情况。这一结果从微观结构证实孕期酒精暴露对子代小脑Purkinje细胞的发育产生不良影响,且诱导细胞自噬的发生。 3.光镜观察和Western blotting蛋白检测Purkinje细胞自噬情况比较微管相关蛋白轻链3（MAPLC3）是编码自噬相关蛋白的重要基因,它被认为是自噬体膜上标志性蛋白。本研究利用免疫细胞化学染色的方法,MAPLC3荧光单标、与Calbindin荧光双标,光镜下观察Purkinje细胞自噬现象的发生,结果显示：P7、P14模型组自噬细胞数量（PAC）及自噬指数（PAI）明显多于对照组,高剂量酒精组多于低剂量组（P＜0.01）;P30模型组与对照组间差别不明显（P＞0.05）。对照组不同年龄点仔鼠随着年龄的增长,PAC及PAI随着年龄的增长逐渐增高（F=58.29,P＜0.001）。Western blotting支持了光镜统计结果,半定量分析显示差异具有统计学意义（P＜0.01）。这样的结果提示孕期酒精暴露能够诱导Purkinje细胞自噬的发生,且有剂量依赖性和长时程效应。 4. Beclin-1对细胞自噬影响的正调控作用 Beclin-1也是哺乳动物参与自噬的特异性基因,已经证实在哺乳动物中Beclin-1表达的上调能够刺激自噬的发生,是白噬重要的正调节因子。利用Beclin-1荧光单标、与MAPLC3荧光双标、与Calbindin荧光双标,结果显示：Beclin-1在酒精模型组与对照组间的表达情况比较与MAPLC3基本一致,二者在同一细胞中几乎呈重叠表达,MAPLC3在细胞核内仅有少量表达,Beclin-1不表达,也即是二者表达基本上成正相关。Western blot半定量分析支持光镜统计结果,差异具有统计学意义。这一结果提示酒精暴露导致Purkinje细胞自噬作用增强可能是通过酒精的有效成分乙醇或者代谢产物乙醛刺激了Beclin-1表达的上调,激活了自噬其它相关基因如MAPLC3的表达。总之,自噬是大自然赋予生命体一种独特的生理调节方式,在细胞更新换代、抵御恶劣环境变化中起着非常重要的作用。通过本课题的研究将使我们进一步认识到母体滥用酒精所产生的胎儿酒精综合征的危害,尤其是对胎儿和儿童中枢神经系统发育的影响,以及对解释由于酒精毒性作用所引起的相关神经系统疾病如韦尼克（Wernicke）脑病、酒精性小脑变性等的发病机理都具有重要意义。对于提高国人体质、促进优生优育有巨大的社会效益,对发育神经生物学、神经病学及神经毒理学有一定的理论价值。

关键词：自噬胎儿酒精综合征浦肯野细胞 LC3 Beclin-1 Calbindin

Reelin基因缺失对小鼠小脑浦肯野细胞迁移与极化的影响

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河南大学学报（自然科学版） 2015年第5期45卷 569-575页

作者：梁爽王倩穆小云郭俊楠范文娟邓锦波河南大学生命科学学院神经生物学研究所河南开封475004 漯河医学高等专科学校分子医学实验室河南漯河462002

利用免疫荧光双标、尼氏染色技术对不同发育阶段Reelin基因缺失的reeler小鼠与野生型小鼠小脑浦肯野细胞的发生及迁移进行形态学观察,同时比较和测量其极性改变的角度.结果显示,reeler小鼠小脑皮质在发育过程中片层化发生紊乱,浦肯野细... 详细信息

利用免疫荧光双标、尼氏染色技术对不同发育阶段Reelin基因缺失的reeler小鼠与野生型小鼠小脑浦肯野细胞的发生及迁移进行形态学观察,同时比较和测量其极性改变的角度.结果显示,reeler小鼠小脑皮质在发育过程中片层化发生紊乱,浦肯野细胞未按正确位置迁移,其胞体直径和极性化角度改变显著,与野生型小鼠比较,差异具有统计学意义(P浦肯野细胞极性改变,迁移受阻,提示Reelin蛋白在小脑皮质片层化形成的过程中发挥了至关重要的作用.

关键词： Reelin 小脑浦肯野细胞细胞极性化细胞迁移小鼠

乙醇对小脑皮层浦肯野细胞复杂性峰电位活动的影响

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延边大学医学学报 2016年第4期39卷 235-239页

作者：史金地初春平邱德来邴艳华延边大学细胞功能研究中心延边大学医学院生理学与病理生理学教研室延边大学医学院机能学实验中心吉林延吉133002

[目的]探讨乙醇对小鼠小脑皮层浦肯野细胞（PC）复杂性峰电位（CS）活动的影响.[方法]取6～8周龄昆明种小鼠,腹腔注射给予乌拉坦（1.3g/kg）施行麻醉,在小脑Vermis区施行直径为1.0～1.5mm的开颅术,揭除硬脑膜,在暴露的脑表面区域持续灌... 详细信息

[目的]探讨乙醇对小鼠小脑皮层浦肯野细胞（PC）复杂性峰电位（CS）活动的影响.[方法]取6～8周龄昆明种小鼠,腹腔注射给予乌拉坦（1.3g/kg）施行麻醉,在小脑Vermis区施行直径为1.0～1.5mm的开颅术,揭除硬脑膜,在暴露的脑表面区域持续灌流给予含氧的人工脑脊液（ACSF）;电生理记录选用在体膜片钳记录,并结合生物素染色技术,记录电极内充装20～30μL电极內液,阻抗为4～6 MΩ;通过膜片钳放大器及数据采集软件记录小脑皮层PC自发性活动.[结果]给予乌拉坦施行麻醉后,小鼠小脑皮层Vermis区PC表现为规律的单纯性峰电位（SS）放电,平均频率为（19.00±4.20）Hz;同时伴有不规律的CS活动,平均频率为（0.31±0.12）Hz;在电流钳记录模式下,乙醇（300 mmol/L）可缩短放电暂停时间,减少后超极化振幅;在电压钳下,乙醇可显著抑制CS的小穗个数及波形下面积,但对CS发生频率即小穗间隔频率未见有影响;乙醇对CS的抑制作用具有一定的剂量依存性;阻断NMDA和mGluR1受体对乙醇所起的CS抑制作用未见有影响,但乙醇对CS的抑制作用可被CB1受体阻断剂所阻断.[结论]乙醇通过活化CB1受体抑制小鼠小脑皮层PC的CS活动,提示过量饮酒可能通过激活攀缘纤维-PC突触前CB1受体抑制外周信息向小脑皮层PC的传入,进而影响运动调节功能.

关键词：小脑皮层浦肯野细胞在体膜片钳记录复杂性峰电位神经药理学小鼠

活化小脑皮层NMDA受体对浦肯野细胞自发性活动的影响

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活化小脑皮层NMDA受体对浦肯野细胞自发性活动的影响

作者：刘全日延边大学

学位级别：硕士

目的：N-甲基（酰）-D-门冬氨酸（NMDA）受体是谷氨酸类门控通道,在中枢神经系统的突触传递调节方面起关键作用,广泛存在于哺乳动物小脑皮质颗粒细胞、平行纤维、高尔基细胞以及分子层中间神经元的细胞膜上,但哺乳动物出生2周后小脑浦... 详细信息

目的：N-甲基（酰）-D-门冬氨酸（NMDA）受体是谷氨酸类门控通道,在中枢神经系统的突触传递调节方面起关键作用,广泛存在于哺乳动物小脑皮质颗粒细胞、平行纤维、高尔基细胞以及分子层中间神经元的细胞膜上,但哺乳动物出生2周后小脑浦肯野细胞上的功能性NMDA受体的表达就会消失。迄今,NMDA受体在活体动物上、在完整小脑神经网络中的作用还不完全清楚。因此,本课题应用电生理和药理学等手段,研究外源性NMDA对乌拉坦麻醉小鼠小脑浦肯野细胞（Purkinje cell, PC）自发性活动的影响,探索NMDA对小脑神经网络活动的影响及其机制。材料与方法：ICR小鼠（6-8周龄）经腹腔注射乌拉坦（1.3g/kg体重.）麻醉后,在小脑Vermis VIa/VIb相应部位行直径为1-1.5mm的开颅术,除去硬脑膜,脑表面暴露部位持续灌流人工脑脊液（ACSF）;与电生理记录同步;电生理记录选用细胞外记录,电生理实验数据分析采用Clampfit10.1软件,采用SPSS软件进行数据统计学分析,给药前后均数的比较采用配对T检验,P＜0.05认为有统计学差异。结果：（1）脑表面灌流NMDA对小脑皮层PC自发性单纯性放电（simple spike, SS）活动产生可逆性的抑制作用,其抑制效应具有剂量依存性,半数抑制浓度为50.3μM。（2） NMDA脑表面灌流浓度为25μM时可引起显著抑制,给药10分钟后PC自发性SS放电频率降低8.9±2.3%,冲洗后恢复。（3）当NMDA的浓度增加至50μM,PC自发性SS放电频率可减少53.3±3.5%;但对自发性SS放电的幅值和宽度没有显著性影响。（4）高浓度NMDA可导致PC自发性SS放电停止,虽然对自发性复杂性放电频率没有显著性影响,但可以显著增加复杂性放电强度。（5）GABAA受体阻断剂不仅可以解除NMDA对PC自发性SS放电的抑制作用,而且揭示了外源性NMDA可以间接兴奋PC,增加自发性SS放电频率。结论：外源性NMDA在保持完整的成熟小鼠小脑神经网络中,不能兴奋小脑皮层浦肯野细胞,反而通过γ-氨基丁酸A（GABAA）受体引起PC自发性SS放电活动明显减少,甚至停止,提示外源性NMDA兴奋小鼠小脑皮层中间神经元,从而导致PC自发性单纯性放电频率显著减少,表明小脑皮层中间神经元网络的活动在PC自发性活动和信息传递与整合中起关键作用。

关键词：小鼠小脑皮层浦肯野细胞细胞外记录 NMDA

慢性酒精中毒对成年小鼠小脑浦肯野细胞超微结构的影响

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中国组织化学与细胞化学杂志 2011年第2期20卷 140-143页

作者：张长征朱庆丰安庆师范学院生命科学学院安徽246011

目的观察慢性酒精中毒所致的成年小鼠小脑皮质浦肯野细胞(Purkinje cell,PC)胞体的超微结构变化,探讨其对神经元超微结构的影响方式及生理意义。方法用15%酒精饲喂3月龄小白鼠3个月,经行为学检测后,取小脑前叶做电镜包埋,切片,染色,透... 详细信息

目的观察慢性酒精中毒所致的成年小鼠小脑皮质浦肯野细胞(Purkinje cell,PC)胞体的超微结构变化,探讨其对神经元超微结构的影响方式及生理意义。方法用15%酒精饲喂3月龄小白鼠3个月,经行为学检测后,取小脑前叶做电镜包埋,切片,染色,透射电镜下观察并拍照。结果酒精中毒组PC核周质中线粒体膨解,基质囊泡化;高尔基复合体扁平囊扩张;粗面内质网碎裂,核糖体颗粒减少;"空泡变性"出现;双层核膜界限不清;染色质边集等变化。结论慢性酒精中毒可导致小脑浦肯野细胞多种细胞器出现异常改变,推测这些变化可引起胞内物质合成减少,空间构筑紊乱,神经元死亡,最终导致小脑功能损伤。

关键词：小鼠小脑皮质浦肯野细胞超微结构酒精中毒

骨形态发生蛋白对鼠小脑浦肯野细胞发育的重要性

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中国临床康复 2006年第26期10卷 92-94,i0002页

作者：秦丽华 E. Bryan Crenshaw Ⅲ 雷季良周长满北京大学医学部解剖学与组织胚胎学系北京市100083 费城儿童医院耳鼻喉科儿童感染中心神经遗传学组

目的:观察骨形态发生蛋白通过Ⅰ型受体传导信号在小脑浦肯野细胞发育中的作用。为揭示临床有关骨形态发生蛋白引起的遗传病发病及治疗提供有力的依据。方法:实验于2004-03/2005-08在美国费城儿童医院Crenshaw实验室和北京大学医学部解... 详细信息

目的:观察骨形态发生蛋白通过Ⅰ型受体传导信号在小脑浦肯野细胞发育中的作用。为揭示临床有关骨形态发生蛋白引起的遗传病发病及治疗提供有力的依据。方法:实验于2004-03/2005-08在美国费城儿童医院Crenshaw实验室和北京大学医学部解剖学神经研究实验室完成。小鼠种类为C57Bl/6J,敲除了骨形态发生蛋白Ⅰ型受体的Bmpr1a和Bmpr1b两个亚型基因,产生了条件性的BMPR-ⅠA和经典性的BMPR-ⅠB受体敲除鼠,破坏了在小脑内的骨形态发生蛋白信号转导。并使用免疫双标calbindin,Tuj1估计小鼠胚胎13.5d和新生幼鼠的浦肯野细胞发育分化情况。结果:①在小鼠刚出生时,正常组鼠的浦肯野细胞都迁移到了小脑,并形成浦肯野细胞层;但在Bmpr1a/Bmpr1b双敲除鼠的浦肯野细胞迁移明显异常,大部分Calbindin阳性的浦肯野细胞呈簇状位于小脑深部,另有部分细胞迁移到了中脑下丘。②免疫双标显示在正常组双标的细胞位于小脑的腹侧缘;但在Bmpr1a/Bmpr1b双敲除组,双标记的浦肯野细胞数量明显减少,并且浦肯野细胞排列紊乱,说明浦肯野细胞的分化受到影响。结论:①骨形态发生蛋白信号对浦肯野细胞的作用可能不是直接的,或许是经过一些中间环节来完成的。②只有两受体基因Bmpr1a和Bm-pr1b同时敲除才能影响骨形态发生蛋白信号对小脑浦肯野细胞发育的作用。

关键词：骨形态发生蛋白质类小鼠,基因敲除浦肯野细胞

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促胰液素对小脑浦肯野细胞抑制性突触的调节

哈尔滨医科大学学报 2015年第5期49卷 393-396页

作者：张颖杨永滨哈尔滨医科大学生理教研室哈尔滨医科大学机能实验中心黑龙江哈尔滨150081

目的观察促胰液素(secretin)对小脑中间神经元—浦肯野细胞抑制性突触的影响。方法采用小脑脑片膜片钳技术,脑片灌流液中给予secretin,观察其对浦肯野细胞上抑制性突触后电流的影响。结果 Secretin应用后,浦肯野细胞诱发性抑制性突触后... 详细信息

目的观察促胰液素(secretin)对小脑中间神经元—浦肯野细胞抑制性突触的影响。方法采用小脑脑片膜片钳技术,脑片灌流液中给予secretin,观察其对浦肯野细胞上抑制性突触后电流的影响。结果 Secretin应用后,浦肯野细胞诱发性抑制性突触后电流增强;自发性抑制性突触后电流也增强。结论 Secretin可能参与调节浦肯野细胞的功能及其信号传递,从而参与小脑功能的调节。

关键词：促胰液素抑制性突触 GABA 浦肯野细胞

小脑肽1对浦肯野细胞突触形成作用的最新研究进展

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中国临床神经科学 2015年第2期23卷 229-234页

作者：遇春霖张忠玲哈尔滨医科大学附属第一医院神经内科 150001

小脑肽1是一种小脑中的特异性糖蛋白,由颗粒细胞生成并分泌,在颗粒细胞的平行纤维和浦肯野细胞之间的兴奋性突触形成过程中发挥重要作用。文中将详细描述小脑肽1诱导新生突触形成的分子机制。复习相关方面的文献,就小脑肽1对于浦肯野细... 详细信息

小脑肽1是一种小脑中的特异性糖蛋白,由颗粒细胞生成并分泌,在颗粒细胞的平行纤维和浦肯野细胞之间的兴奋性突触形成过程中发挥重要作用。文中将详细描述小脑肽1诱导新生突触形成的分子机制。复习相关方面的文献,就小脑肽1对于浦肯野细胞上突触的形成以及兴奋与抑制传入的调节作用的研究现状作详细介绍。

关键词：小脑肽浦肯野细胞平行纤维突触