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生物技术通报 2024年第7期40卷 117-124页

作者：田兴苗王健霖郭磊司朵朵龚振兴李继东宁夏大学动物科技学院银川750021 宁夏晓鸣农牧股份有限公司银川750011

【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase ampli... 详细信息

【目的】鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum,MG)和滑液囊支原体(Mycoplasma synoviae,MS)是对家禽危害最大的两种支原体,MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。通过将重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA)和测流层析试纸条(lateral flow dipstick,LFD)相结合,建立一种操作便捷、反应快速、结果可视化、可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。【方法】基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因设计特异性引物和探针,优化反应时间、反应温度及引物配比建立双重LFD-RPA快速检测方法,评价其灵敏度、特异性、稳定性,同时对120份临床样品进行检测。【结果】双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5-10min即可完成扩增,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6∶1.4。MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL。用该方法与OIE推荐的PCR方法对120份样品进行检测,二者符合率为93.3%。【结论】MG、MS双重LFD-RPA检测方法在恒温条件下即可完成扩增,其操作简单、反应快速、灵敏度高、特异性强、稳定性好,无需使用任何仪器即可观察到结果,适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的现场快速检测。

关键词：鸡毒支原体滑液囊支原体重组酶聚合酶扩增技术测流层析试纸条

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牛病毒性腹泻病毒核酸快速检测方法的建立

牛病毒性腹泻病毒核酸快速检测方法的建立

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作者：雷丽霞宁夏大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染牛引起的一种传染病,感染后不仅会产生严重的临床症状,还会降低动物的免疫力,增加其他病原体的感染风险,导致患病动物发病率和死亡率上升,严重阻滞了养牛业的健康发展。BVD的综合... 详细信息

牛病毒性腹泻（BVD）是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染牛引起的一种传染病,感染后不仅会产生严重的临床症状,还会降低动物的免疫力,增加其他病原体的感染风险,导致患病动物发病率和死亡率上升,严重阻滞了养牛业的健康发展。BVD的综合防控依赖于对其进行快速、特异、便捷的诊断,其中BVDV核酸的快速检测是诊断其感染发生的关键技术。环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）是两种新型核酸恒温扩增技术,该技术无需特殊设备,操作简单、反应时间短、灵敏性高、特异性强,且非常适合在田间应用。因此,本研究在参考已有检测方法、分析BVDV基因组的基础上,建立了 RPA和LAMP检测方法,进而选择更适用于基层BVDV核酸快速检测的可视化方法,以期为BVD的诊断及防控提供技术支撑。研究结果如下:1.基于BVDV基因组的5’-UTR保守序列,建立了 BVDV的LAMP检测方法,确定其最适反应时间为50min,最适反应温度为62℃和反应体系。特异性结果表明,该方法可以区分BVDV菌株与腹泻相关的其他菌株,具有良好的特异性。灵敏性结果表明,LAMP的最低检测限为1.9×102copies/μL,灵敏度比PCR高10倍。2.基于BVDV基因组的5’-UTR保守序列,建立了 BVDV基础RPA检测方法,确定其最适反应时间为15min,最适反应温度为37℃。以阳性质粒标准品pUC57-BVDV1254为模板进行梯度稀释,确定基础RPA的最低检测限为1.9×102copies/μL,与LAMP的最低检测限一致。结果表明,该方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性。3.在基础RPA的基础上建立了 BVDV的LFD-RPA检测方法,确定其最适反应时间为15min,最适反应温度为35℃。以cDNA为模板梯度稀释,其最低检出量为5.8×10-2ng/μL;以阳性质粒标准品pUC57-BVDV1254为模板进行梯度稀释,确定其最低检测限为1.9×102copies/μL,灵敏度与基础RPA和LAMP的一致。结果表明,该方法具有良好的灵敏度、特异性和重复性,可以区分BVDV与腹泻相关的其他病原。4.用建立的BVDV LAMP、基础RPA和LFD-RPA方法和PCR方法对107份临床血清样本进行检测,LAMP和PCR的阳性检出率均为1.87%（2/107）,基础RPA和LFD-RPA的阳性检出率均为 2.80%（3/107）。综上所述,通过分析BVDV基因组选择高度保守序列,成功建立了 BVDV LAMP、基础RPA和LFD-RPA检测方法,该三种恒温核酸扩增方法具有良好的特异性和灵敏度。综合其快速性、简单性和可视化等各方面的比较,LFD-RPA方法更适合用于基层BVDV的检测,可为BVD的防控及消除提供技术支撑。

关键词：牛病毒性腹泻病毒重组酶聚合酶扩增测流层析试纸条环介导等温扩增

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心肌肌钙蛋白Ⅰ高灵敏快速检测试剂盒的研制

心肌肌钙蛋白Ⅰ高灵敏快速检测试剂盒的研制

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作者：康笑笑华中农业大学

学位级别：硕士

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为心肌肌钙蛋白的亚基,能抑制肌动蛋白ATP酶的活性,使肌肉松弛、防止肌纤维收缩,是维持心脏正常舒缩的重要物质,可作为心肌损伤的一种重要的检测指标。目前国外已经开发了cTnⅠ试剂盒用于急性心肌梗死临床检测及诊... 详细信息

心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTnⅠ)为心肌肌钙蛋白的亚基,能抑制肌动蛋白ATP酶的活性,使肌肉松弛、防止肌纤维收缩,是维持心脏正常舒缩的重要物质,可作为心肌损伤的一种重要的检测指标。目前国外已经开发了cTnⅠ试剂盒用于急性心肌梗死临床检测及诊断,但是国内该诊断技术研发仍处于起步阶段,诊断过程复杂,效率低,长期依赖进口产品。本研究首先利用胶体金法对从Hy Test公司的四种结合不同抗原表位的心肌肌钙蛋白单克隆抗体进行筛选配对,选择灵敏度较好的2+2型配对进行后续开发,通过对胶体金法、荧光免疫层析法的优化和改进,研发一种灵敏性高、特异性强、简单快捷的适用于早期诊断心肌梗死的免疫检测试纸条。cTnⅠ作为检测急性心梗的重要标志物,普通的胶体金试纸条难以达到100 pg/m L这样的高灵敏度。另外cTnⅠ容易降解、难以检测,是研发cTnⅠ高效检测试纸条的主要阻碍。因此,本课题通过对三种心肌肌钙蛋白I的测流层析检测方法的优化和改进,提高了检测灵敏度,主要实验结果如下:a)对胶体金法检测心肌肌钙蛋白测流层析试纸条进行优化,成功制备了分散性良好、粒径均匀的稳定的胶体金溶液。在实验过程中首先筛选出特异性强、灵敏度高的抗体配对用于后续荧光免疫层析试纸条和拉曼探针免疫试纸条实验。随后对胶体金试纸条的工艺条件进行了优化,并对优化后的心肌肌钙蛋白胶体金免疫层析试纸条进行敏感性实验,计算其最低检出限为0.403 ng/m L,,且随机样本检测无假阳性。b)对荧光免疫层析试纸条工艺流程进行优化,结果表明C线抗体浓度为0.5mg/m L,T线抗体浓度包被1 mg/m L,最佳反应时间为15 min,最佳微球活化时间为20 min,最适抗体量为10μg。在此条件下免疫荧光试纸条灵敏度最高,检出限为0.04ng/m L,且随机样本检测无假阳性。c)对测流层析试纸条进行凝胶改性,在测流层析试纸条C线后添加不同浓度的水凝胶,使整个反应过程中样本流速变慢,增加反应时间,提高灵敏度。胶体金试剂条的初始检出限为0.403 ng/m L,8%的明胶改性效果最好,检出限提高至0.174 ng/m L,提高了1.3倍。荧光免疫试纸条的初始检出限浓度为0.04 ng/m L,4%的明胶改性效果最好,检出限提高至0.00613 ng/m L,提高了5.5倍。万孚生物有限公司荧光免疫试纸条的初始检出限浓度为0.023 ng/m L,浓度为4%的明胶改性效果最好,检出限提高至0.00477 ng/m L,提高了3.8倍。d)尝试通过共价连接制备纳米探针,并用PEG共价回填,达到最低检出限为0.0895 ng/m L,共价连接比物理回填试纸条灵敏度提高了3.3倍。综上所述,本研究结合三种方法的研究优点,研制出一种高灵敏性cTnⅠ检测装置,实现对心肌肌钙蛋白Ⅰ的快速定性和定量检测,可以用于POCT检测,用于临床辅助诊断,为构建心血管标志物快速定量检测体系奠定基础。

关键词：急性心肌梗死心肌肌钙蛋白测流层析试纸条高灵敏性水凝胶

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鸡毒支原体和滑液囊支原体双重RPA快速检测方法的建立

鸡毒支原体和滑液囊支原体双重RPA快速检测方法的建立

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作者：田兴苗宁夏大学

学位级别：硕士

鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体。MG、MS呈世界性分布,无明显季节性,可通过水平和垂直传播,各个日龄的鸡群都易感,只要感染就会终生携带,很难根除,因此MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节... 详细信息

鸡毒支原体(MG)和滑液囊支原体(MS)是对家禽危害最大的两种支原体。MG、MS呈世界性分布,无明显季节性,可通过水平和垂直传播,各个日龄的鸡群都易感,只要感染就会终生携带,很难根除,因此MG、MS的早期诊断是预防和控制禽支原体的关键环节。本研究基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因,建立一种可同时检测MG、MS两种病原的快速检测方法。重组酶聚合酶扩增技术(RPA)是一种新型恒温核酸扩增技术,具有操作简单、反应时间短、灵敏度高、特异性好、无需精密仪器等优点,是目前最有应用前景的核酸快速诊断技术。通过建立MG、MS的基础RPA快速检测方法,并与侧流层析试纸条(LFD)结合建立LFD-RPA检测方法,发挥该技术简单、快速、特异、可肉眼观察结果等优点,进一步提高MG、MS感染的检测效率。1.以MG的mgc2基因、MS的vlhA基因为检测靶标,设计数对RPA引物,通过筛选得到最佳引物,建立MG、MS单重基础RPA检测方法。优化反应时间和温度以确定最佳反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性试验。结果显示,所建立的MG、MS单重基础RPA检测方法,在37℃下反应20 min即可完成扩增。以重组质粒为模板时,MG最低检出限为3.75 copies/μL,MS最低检出限为3.46 copies/μL;以基因组DNA为模板时,MG最低检出限为1.23×10-4 ng/μL,MS最低检出限为5.68×10-4 ng/μL,其具有良好的特异性与稳定性。2.在MG、MS单重RPA的基础上,建立双重基础RPA检测方法。通过优化MG、MS最佳引物配比确定双重基础RPA的反应体系,并进行灵敏度、特异性、重复性试验。结果显示,建立的双重基础RPA检测方法,其RPA-MG-F2/R2、RPA-MS-F1/R1最佳引物配比为0.6:1.4 μL。以重组质粒为模板时,MG、MS的最低检出限分别为3.75 copies/μL、3.46 copies/μL,与单重RPA灵敏度一致;以基因组DNA为模板时,MG、MS的最低检出限分别为1.23×10-3 ng/μL、5.68×10-3 ng/μL,比单重RPA灵敏度低10倍,其具有良好的特异性与稳定性。用该方法与OIE推荐的PCR方法对80份临床样品进行检测,结果表明该方法的阳性检出率高于OIE PCR方法,与OIE PCR方法一致性极强。3.在MG、MS双重RPA的基础上,建立双重LFD-RPA检测方法。优化反应时间和温度以确定最适反应条件,并进行灵敏度、特异性、重复性试验。结果显示,所建立的双重LFD-RPA检测方法在37℃下反应5～10 min即可完成扩增,结果肉眼可见。MG、MS最低检出限与双重基础RPA一致,具有良好的特异性和稳定性。综上所述,本试验基于MG的mgc2基因、MS的vlhA基因成功建立了 MG、MS单重基础RPA、双重基础RPA、双重LFD-RPA检测方法,三种检测方法具有操作简单、反应快速、灵敏高、特异性强、稳定性好等优点。综合其便捷性和可视化等方面的比较,LFD-RPA方法更适用于基层MG、MS单独感染或混合感染的检测,可为MG、MS的早期诊断与防控提供技术支撑。

关键词：鸡毒支原体滑液囊支原体重组酶聚合酶扩增技术测流层析试纸条

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