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水产科学 2019年第5期38卷 721-725页

作者：王娜张旻张舟景宏丽任彤张利峰吴绍强中国检验检疫科学研究院北京100176 北京海关技术中心北京101113

为建立流行性造血器官坏死病毒的焦磷酸测序检测方法,本研究针对流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的保守区域进行分析,设计扩增引物及测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,通过对反应条件和反应体系的优化,成功建立了该检测方... 详细信息

为建立流行性造血器官坏死病毒的焦磷酸测序检测方法,本研究针对流行性造血器官坏死病毒ORF65基因的保守区域进行分析,设计扩增引物及测序引物,经PCR扩增后对PCR产物进行焦磷酸测序,通过对反应条件和反应体系的优化,成功建立了该检测方法。试验结果显示,该方法扩增基因片段长度为137 bp,焦磷酸测序长度为38 bp,能够特异性检测出流行性造血器官坏死病毒,最低核酸检测限为0.5 pg/μL,与常规PCR检测方法的符合率达100%。本研究建立的流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为流行性造血器官坏死病毒的快速检测提供了一种可行方法。

关键词：流行性造血器官坏死病毒焦磷酸测序 PCR 检测

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流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立

流行性造血器官坏死病毒ELISA检测方法的初步建立

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作者：刘宏华中农业大学

学位级别：硕士

流行性造血器官坏死病(Epizootic hematopoietic necrosis, EHN)是由EHN病毒引起的红鳍鲈鱼和虹鳟鱼的一种全身性病毒性疾病。随着我国水产业迅速发展,水生动物疫病日益增多,特别是由EHN等病毒引起的流行性疫病危害更为严重。本研究针... 详细信息

流行性造血器官坏死病(Epizootic hematopoietic necrosis, EHN)是由EHN病毒引起的红鳍鲈鱼和虹鳟鱼的一种全身性病毒性疾病。随着我国水产业迅速发展,水生动物疫病日益增多,特别是由EHN等病毒引起的流行性疫病危害更为严重。本研究针对我国水生动物疫病现状,以本实验室引进和保存的EHN病毒为材料,进行了该病毒的实验室培养、鉴定及其某些生物学特性研究,并在此基础上,克隆表达了EHNV的主要衣壳蛋白(MCP),初步建立了基于MCP蛋白的EHN病毒感染的ELISA检测方法,取得了如下结果：***病毒的增殖和鉴定利用对流行性造血器官坏死病毒(EHNV)敏感的大鳞大麻哈鱼胚胎细胞系(CHSE)增殖病毒；测定了病毒毒力和培养液中的病毒滴度；采用蔗糖密度梯度离心法对收获的病毒进行了纯化；通过SDS-PAGE和Western blotting方法对纯化病毒进行了病毒组份鉴定和免疫学活性分析,为后续EHNV高免血清的制备及ELISA检测方法的建立奠定了基础。2. EHNV-MCP基因的克隆与高效表达参照GenBank已发表的流行性造血器官坏死病毒(EHNV) MCP基因序列,以本实验室保存的EHNV毒株为实验材料,提取DNA,将用PCR方法扩增得到的MCP基因克隆到pMD18-T载体上,对重组质粒进行酶切鉴定和序列测定。结果表明,扩增片段的长度为1392bp,所测得的基因序列与GenBank上所报道的EHNV的MCP序列同源性在99%以上。将重组基因插入原核表达载体pET-32a,成功构建了重组表达质粒ET-32a,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了高效表达；对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析,结果与预期蛋白大小一致,Western blotting检测表明,该表达蛋白具有良好的免疫学活性。***病毒ELISA-MCP检测方法的初步建立用纯化的EHNV免疫新西兰大耳白兔和Balb/c小鼠,制备高免血清。以亲和纯化的兔抗EHNV IgG为包被抗体,鼠抗EHNV IgG为第二抗体,建立了检测EHNV的双抗体夹心ELISA方法,并对影响ELISA反应的各种条件进行了优化。结果表明,兔抗EHNV IgG的最佳包被浓度为0.5μg／mL,鼠抗EHNV血清的最适工作浓度约为1：12800；与已知流行性造血器官坏死病标准病毒呈强阳性反应,与已知的阴性样品及其它一些鱼类病毒无交叉反应。该方法的建立,为我国水生动物EHN病毒的常规检测提供了技术手段。

关键词：流行性造血器官坏死病毒克隆表达 ELISA

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蛙虹彩病毒巢式PCR检测方法的建立

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中国水产科学 2011年第3期18卷 661-666页

作者：张旻林祥梅江育林中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所北京100029

蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性。为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋... 详细信息

蛙虹彩病毒属(Ranavirus)病毒宿主广泛,可以感染爬行类、鱼类和两栖类,大部分病毒对宿主都有较强的致病性和致死性。为建立一种快速高效的蛙虹彩病毒的检测方法,本研究利用中华鳖虹彩病毒(Soft-shelled Turtle Iridovirus,STIV)核衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因保守区设计内引物和外引物,建立了特异性检测流行性造血器官坏死病毒(Epizootic Haematopoietic Necrosis Virus,EHNV)、中华鳖虹彩病毒和虎纹蛙虹彩病毒(Tiger Frog Virus,TFV)的巢式PCR(巢式PCR)检测方法,并制备了重组质粒pGem-T-S作为阳性对照标准品。检测限试验结果显示,该方法可以检测102拷贝的病毒粒子。而且与传染性造血器官坏死病毒、鲤春病毒、病毒性出血性败血症病毒、斑点叉尾病毒、传染性胰脏坏死病毒、真鲷虹彩病毒、牙鲆弹状病毒以及锦鲤疱疹病毒等其他非蛙虹彩病毒无交叉反应。该体系具有简便、快速、敏感、特异性高、低成本等特点,为诊断与预防蛙虹彩病毒提供了一项重要的技术手段。

关键词：蛙虹彩病毒中华鳖虹彩病毒流行性造血器官坏死病毒虎纹蛙虹彩病毒巢式PCR

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三重荧光定量PCR快速检测水产品中的双链DNA病毒的研究

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食品工业科技 2015年第1期36卷 311-315页

作者：黄佳鸣宁喜斌史秀杰刘葒丛健兰文升上海海洋大学食品科学与工程学院上海201306 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心深圳市外来有害生物检测技术研发重点实验室广东深圳518045

目的:建立对水产品中三种双链DNA病毒(斑点叉尾鮰病毒、锦鲤疱疹病毒、流行性造血器官坏死病毒)快速、敏感、特异的检测方法。方法:针对三种病毒的DNA聚合酶基因的保守序列设计三对特异性引物和三条Taqman探针,优化体系,建立三重荧光定... 详细信息

目的:建立对水产品中三种双链DNA病毒(斑点叉尾鮰病毒、锦鲤疱疹病毒、流行性造血器官坏死病毒)快速、敏感、特异的检测方法。方法:针对三种病毒的DNA聚合酶基因的保守序列设计三对特异性引物和三条Taqman探针,优化体系,建立三重荧光定量PCR体系,并对该方法的灵敏性和特异性评估。结果:建立的三重荧光定量PCR体系特异性强,引物之间及引物和探针之间无相互干扰。对三种病毒的检测限均能达到102拷贝/μL。结论:该方法体系稳定,重复性好,可操作性强,对水产品中的双链DNA病毒的快速检测具有重要的应用价值。

关键词：斑点叉尾鮰病毒锦鲤疱疹病毒流行性造血器官坏死病毒三重荧光定量PCR

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