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贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

中国畜牧兽医学会2009学术年会

作者：许遐李海艳王彩霞吴绍强内蒙古农业大学中国检验检疫科学研究院

为了满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×10～1.0×10... 详细信息

为了满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×10～1.0×10,敏感性为10拷贝质粒DNA。采用模拟阳性样品试验,可检测到100拷贝质粒DNA。而且与贝类的包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受组织DNA的干扰。5 0份采集样品的检测结果与RFTM培养方法一致。本研究所构建的派琴虫LUX荧光PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

关键词：派琴虫贝类 LUX 荧光PCR 敏感性特异性

贝类派琴虫环介导等温扩增检测方法的建立与应用

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贝类派琴虫环介导等温扩增检测方法的建立与应用

动物检疫学分会2010年学术年会

作者：王彩霞吴绍强林祥梅刘建许遐中国检验检疫科学研究院动植物检疫研究所

【研究目的】为满足沿海贝类养殖场开展派琴虫流行病学调查以及口岸出入境贝类以及贝类产品派琴虫检疫需要,建立派琴虫病环介导等温扩增(LAMP)检测方法。【方法】选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计LAMP引物,通过对反应体系和反... 详细信息

【研究目的】为满足沿海贝类养殖场开展派琴虫流行病学调查以及口岸出入境贝类以及贝类产品派琴虫检疫需要,建立派琴虫病环介导等温扩增(LAMP)检测方法。【方法】选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计LAMP引物,通过对反应体系和反应条件的优化,建立了环介导等温扩增检测派琴虫的方法,同时进行了敏感性和特异性试验。利用所建立的LAMP方法对采自我国东海和黄海的60份贝类样品进行派琴虫检测,并与RFTM培养法检测结果进行比较。【结果】所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为5×107～5×101拷贝,敏感度可检测到50拷贝质粒DNA,而且与包拉米虫、单孢子虫、小瓜虫等寄生虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。60份贝类样品的LAMP检测结果表明LAMP检测方法的灵敏度高于RFTM培养法。【结论】本研究所建立的派琴虫环介导等温扩增检测方法可以应用于口岸贝类产品派琴虫的快速检测。

关键词：派琴虫贝类环介导等温扩增技术 RFTM 检测

贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法的建立和应用

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贝类派琴虫实时荧光PCR检测方法的建立和应用

中国畜牧兽医学会2008年学术年会暨第六届全国畜牧兽医青年科技工作者学术研讨会

作者：李海艳吴绍强林祥梅郑腾李西峰中国检验检疫科学研究院内蒙古农业大学福建出入境检验检疫局黄岛出入境检验检疫局

派琴虫病(Perkinsosis)是影响贝类养殖业的主要疾病之一,传统的液体巯基乙酸盐培养基(FTM)培养方法耗时过长,而且敏感性较低。本研究在FTM培养方法的基础上,选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定... 详细信息

派琴虫病(Perkinsosis)是影响贝类养殖业的主要疾病之一,传统的液体巯基乙酸盐培养基(FTM)培养方法耗时过长,而且敏感性较低。本研究在FTM培养方法的基础上,选择派琴虫保守的核糖体DNA ITS-2区域设计引物和TaqMan探针,建立了实时荧光定量PCR检测派琴虫的方法。所构建方法检测质粒模板DNA的动态范围为2.6×10～2.6×10,敏感度可检测到26拷贝质粒DNA,而且与包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受贝类组织DNA的干扰。利用本研究所建立的方法对来自我国山东、福建等不同沿海海域的30份贝类样品进行检测,检出阳性3份。研究所构建的派琴虫实时荧光定量PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

关键词：派琴虫贝类实时荧光PCR 检测

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贝类派琴虫LUX荧光PCR检测方法的建立

中国动物检疫 2009年第9期26卷 31-33页

作者：许遐王彩霞吴绍强林祥梅李海艳刘建内蒙古农业大学呼和浩特010018 中国检验检疫科学研究院北京100029

为满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×101-1.0×108,... 详细信息

为满足贝类派琴虫病的快速检测需要,本研究选择派琴虫保守的核糖体DNAITS-2区域设计引物,通过对反应体系和反应条件的优化,首次建立了LUX荧光PCR检测派琴虫的方法。试验表明,所建立方法检测质粒模板DNA的动态范围为1.0×101-1.0×108,敏感性为10拷贝质粒DNA。采用模拟阳性样品试验,可检测到100拷贝质粒DNA。而且与贝类的包拉米原虫、隐孢子虫等其它寄生性原虫无交叉反应,也不受组织DNA的干扰。50份采集样品的检测结果与RFTM培养方法一致。本研究所构建的派琴虫LUX荧光PCR检测方法具有快速、灵敏、特异等优点,可满足国内养殖场及进出口水生动物携带派琴虫的检测需要。

关键词：派琴虫贝类 LUX 荧光PCR 敏感性特异性

贝类寄生北海派琴虫的流行病学调查、体外培养以及形态观察

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贝类寄生北海派琴虫的流行病学调查、体外培养以及形态观察

作者：杨小彤天津农学院

学位级别：硕士

派琴虫(Perkinsus spp.)是一类对贝类具有较强感染性的原生动物,可造成贝壳闭合障碍、生长发育缓慢,损害贝类生殖系统,高强度感染时会导致贝类大规模的死亡,给贝类产业带来巨大损失。贝类一般在开放式海域养殖,这使得贝类病害防控工作... 详细信息

派琴虫(Perkinsus spp.)是一类对贝类具有较强感染性的原生动物,可造成贝壳闭合障碍、生长发育缓慢,损害贝类生殖系统,高强度感染时会导致贝类大规模的死亡,给贝类产业带来巨大损失。贝类一般在开放式海域养殖,这使得贝类病害防控工作很难开展,因此调查病原的流行感染规律对贝类疾病的发生、发展和防治显得尤为重要,本研究通过对广东沿海贝类进行季度监测,掌握贝类寄生派琴虫的时空变化规律;探究可替代液体巯基乙酸盐培养基(ARFTM)中不同抗生素浓度对于派琴虫休眠孢子生长的影响;同时,分别使用光学显微镜和电子扫描显微镜观察了派琴虫体外培养过程中的生活史。主要研究成果如下:1、文章采用常规PCR技术,调查了广东近岸6个养殖海域5种重要养殖贝类寄生派琴虫的感染情况,分析了贝类寄生派琴虫感染的时空变化。结果显示,共检测到两种派琴虫,其中北海派琴虫(Perkinus beihaiensis)总感染率显著高于奥尔森派琴虫(Perkinsus olseni)。5种检测的贝类中,除福建牡蛎(Crassostrea angulata)以外,均检测到派琴虫感染,其中香港牡蛎(Crassostrea hongkongensis)、杂色鲍(Haliotis diversicolor)感染两种派琴虫,马氏珠母贝(Pinctada martensii)、华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)仅感染奥尔森派琴虫。湛江、阳江、江门等粤西地区派琴虫感染率为17.17%,显著高于汕尾、揭阳、汕头等粤东地区。夏、秋季节派琴虫的感染率为15.67%,显著高于冬、春季节。2、设置了四组抗生素含量不同的可替代液体巯基乙酸盐培养基(ARFTM),在真空环境中培养派琴虫,统计了第二天和第七天时培养基的派琴虫数量,验证不同抗生素浓度的ARFTM对派琴虫休眠孢子在ARFTM培养基中生长的影响。实验表明,真空环境中使用ARFTM培养派琴虫时,抗生素浓度低有利于派琴虫的生长,高浓度的抗生素会抑制派琴虫休眠孢子的生长。氯霉素浓度为25μg·mL,制霉菌素浓度为25U·mL,青霉素链霉素浓度为250 U·mL组是最适合派琴虫休眠孢子生长的浓度,派琴虫此时数量最多。3、应用ARFTM培养基和DME/F12培养基在体外培养派琴虫细胞,使用光学显微镜和电子显微镜观察派琴虫不同的生长阶段。实验发现滋养体、休眠孢子和游动孢子之外北海派琴虫的新形态:蠕虫状裂殖体。蠕虫状裂殖体是派琴虫游动孢子囊发育过程中的新形态,表现为头部球状细加一条拖尾,长度在12～150μm左右。

关键词：派琴虫流行病学 ARFTM培养基抗生素浓度蠕虫状裂殖体

中国沿海主要养殖贝类四种原虫病流行病学的调查研究

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基因组学与应用生物学 2012年第6期31卷 559-566页

作者：谢丽基谢芝勋庞耀珊刘加波邓显文谢志勤范晴罗思思广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室南宁530001

为全面系统了解中国沿海主要养殖贝类4种原虫病的分布和流行状况,本研究从2006年10月到2012年10月的6年间,在中国主要贝类养殖海区采集牡蛎、文蛤和扇贝等11种养殖贝类331批共11291份,并对其四种原虫的感染情况进行检测和调查。结果显... 详细信息

为全面系统了解中国沿海主要养殖贝类4种原虫病的分布和流行状况,本研究从2006年10月到2012年10月的6年间,在中国主要贝类养殖海区采集牡蛎、文蛤和扇贝等11种养殖贝类331批共11291份,并对其四种原虫的感染情况进行检测和调查。结果显示,4种原虫的感染率累计为15.28%(1725/11291),其中感染率最高的为派琴虫(9.98%)(1127/11291),其次为尼氏单孢子虫(3.99%)(451/11291),最低为折光马尔太虫(1.30%)(147/11291),未检出包拉米虫的感染。在单个的牡蛎、花甲螺、菲律宾蛤仔、扇贝、溢蛏和血蛤中,存在多种原虫混合感染的现象,混合感染率为6.78%(117/1725),其它贝类均为单一感染,感染率为93.22%(1608/1725)。调查结果还表明,中国不同海域和不同品种的牡蛎,尼氏单孢子虫和派琴虫的感染率存在明显差异。该调查结果将为中国贝类养殖原虫病的防治提供重要的科学依据。

关键词：贝类尼氏单孢子虫派琴虫折光马尔太虫包拉米虫流行病学

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贝类中不同种类病原生物的快速检测方法

生命科学研究 2013年第2期17卷 156-162页

作者：倪梦丽杨冰王春德吕昆仑侯伟青岛农业大学海洋科学与工程学院中国山东青岛266109 青岛出入境检验检疫局中国山东青岛266001 青岛机场出入境检验检疫局中国山东青岛266108

为适应进口鲜活贝类的快速检验需求,有必要建立快速检测多种病原生物的方法.针对进口鲜活水产品中常见的细菌、病毒和原生动物等不同种类的病原生物,设计了退火温度相近的特异PCR引物,建立了能够同时定性检测不同种类病原生物的方法.在... 详细信息

为适应进口鲜活贝类的快速检验需求,有必要建立快速检测多种病原生物的方法.针对进口鲜活水产品中常见的细菌、病毒和原生动物等不同种类的病原生物,设计了退火温度相近的特异PCR引物,建立了能够同时定性检测不同种类病原生物的方法.在此基础上,针对不同病原生物设计了特异的荧光引物,建立了检测贝类中不同病原生物的荧光定量PCR体系,并进行了特异性与重复性试验.与传统的检测方法相比较,该方法检测贝类中的病原生物更为快速准确,结果直观,可以满足口岸进口水产品快速检测的需要.

关键词：沙门氏菌派琴虫急性坏死性病毒(AVNV) 荧光定量PCR 贝类

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3种贝类原虫多重荧光定量PCR方法的建立

生物技术通讯 2012年第5期23卷 713-717页

作者：谢芝勋谢丽基庞耀珊刘加波邓显文谢志勤广西壮族自治区兽医研究所广西畜禽疫苗新技术重点实验室广西南宁530001

目的:建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。方法:根据基因库中单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,设计3对特异性引物和3条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建... 详细信息

目的:建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。方法:根据基因库中单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的基因序列,设计3对特异性引物和3条用不同荧光基团标记的TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立能够同时检测单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的三重荧光定量PCR方法。结果:该方法对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫的检测敏感性分别达到40、400和40个模板拷贝数;此外抗干扰能力强,对单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫不同模板浓度进行组合,仍可有效地同时检测这3种原虫,对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果均为阴性。结论:建立的单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫多重荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床上单孢子虫、派琴虫和折光马尔太虫感染的检测。

关键词：单孢子虫派琴虫折光马尔太虫三重荧光定量PCR

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启事

中国动物检疫 2014年第7期 39-39页

本刊2014年第6期《贝类派琴虫原位杂交检测方法的建立与应用》一文应补充脚注:基金项目:国家十二五科技支撑计划2012BAK11B04;通讯作者:吴绍强。

关键词：原位杂交检测派琴虫通讯作者脚注