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氮溴化丙锭与聚合酶链反应结合的细菌活细胞检测方法

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吉林医学 2013年第6期34卷 1141-1142页

作者：史菊江苏省泗洪县人民医院江苏泗洪223900

目的:区分细菌PCR过程中的死活菌。方法:使用叠氮溴化丙锭(PMA)处理提取样品的基因,使样品中死细胞的DNA分子与PMA发生共价交联,使其DNA分子的PCR扩增被抑制。结果:当浊度100 NTU时,PMA的抑制效果就会失去。而当样品中的PMA质量浓度>3μ... 详细信息

目的:区分细菌PCR过程中的死活菌。方法:使用叠氮溴化丙锭(PMA)处理提取样品的基因,使样品中死细胞的DNA分子与PMA发生共价交联,使其DNA分子的PCR扩增被抑制。结果:当浊度细胞DNA的PCR扩增,PMA具备的抑制效用仍然有效;当浊度>100 NTU时,PMA的抑制效果就会失去。而当样品中的PMA质量浓度>3μg/ml时,曝光时间就会超过3 min,PMA可对死细胞DNA的PCR扩增进行抑制;PMA质量浓度>50μg/ml时,活细胞DNA的PCR扩增就会受到影响。结论:对异丙醇处理、热处理引起的细菌细胞膜破裂而产生的死细胞,可通过PMA与PCR结合的方法进行选择性地检测,能较好的区分死活菌。

关键词：叠氮溴化丙锭活细胞检测 PMA PCR

西瓜细菌性果斑病病菌活细胞PMA-PCR检测方法的建立

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中国植保导刊 2015年第9期35卷 12-15页

作者：赵璟源胡佳续张莹刘鹏唐芳廖芳天津出入境检验检疫局天津300461

利用叠氮溴化丙锭与聚合酶链式反应结合(PMA-PCR),建立了西瓜细菌性果斑病病菌(Acidovorax avenae ***)活细胞检测方法。实验结果表明,当PMA浓度为0.5 mg/m L时,对活细胞DNA的PCR扩增无影响,最低检测浓度为1×104cfu/m L。当样品中死亡... 详细信息

利用叠氮溴化丙锭与聚合酶链式反应结合(PMA-PCR),建立了西瓜细菌性果斑病病菌(Acidovorax avenae ***)活细胞检测方法。实验结果表明,当PMA浓度为0.5 mg/m L时,对活细胞DNA的PCR扩增无影响,最低检测浓度为1×104cfu/m L。当样品中死亡细胞浓度低于107 cfu/m L时,PMA可抑制死亡细胞DNA的PCR扩增;当死亡细胞浓度为1×107cfu/m L时,PMA失去效果。该方法适用于低浓度西瓜细菌性果斑病病菌活细胞的检测。

关键词：西瓜细菌性果斑病病菌叠氮溴化丙锭聚合酶链式反应活细胞检测

新型多孔石墨烯复合材料传感界面的构建及对活细胞释放过氧化氢的检测

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新型多孔石墨烯复合材料传感界面的构建及对活细胞释放过氧化氢的...

作者：刘一丹西北师范大学

学位级别：硕士

过氧化氢(HO)是生理环境中典型的活性氧代表,主要调节蛋白质合成、DNA损伤以及细胞凋亡等。检测HO在活细胞中的动态释放过程可以为病理诊断提供可靠的信息,因此是非常重要的。多孔石墨烯(PGN)是指在二维基面上具有纳米级孔隙的碳材料,... 详细信息

过氧化氢(HO)是生理环境中典型的活性氧代表,主要调节蛋白质合成、DNA损伤以及细胞凋亡等。检测HO在活细胞中的动态释放过程可以为病理诊断提供可靠的信息,因此是非常重要的。多孔石墨烯(PGN)是指在二维基面上具有纳米级孔隙的碳材料,它不仅保留了石墨烯优良的性质,而且相比惰性的石墨烯,孔的存在提高了物质运输效率、增大了比表面积、增多了活性位点,同时有效地防止了石墨烯的团聚,并且具有很好的吸附性能。这些优点使多孔石墨烯成为一种良好的负载基质,为生物传感器各种性能的提高创造了机遇。本文将多孔石墨烯分别与酶和金属纳米粒子相结合,构建了酶生物传感器与无酶传感器,并将这些传感器应用到了癌细胞释放HO的检测。主要研究内容如下:(1)初步探索多孔石墨烯(PGN)的合成方法,通过银纳米粒子刻蚀制得PGN,对其进行一系列表征,证明PGN制备成功。然后将其与辣根过氧化酶(HRP)结合,制得酶生物传感器。电化学实验表明,HRP/PGN/GCE对HO的还原展现了良好的电催化性能,峰电流是裸电极的4.8倍。这是因为PGN大的比表面积和良好的生物相容性使其能够负载更多的酶,从而增大HO的响应。此外,我们还讨论了HRP/PGN/GCE对HO的还原反应催化机理;(2)基于上一章的研究发现用银纳米粒子刻蚀制得多孔石墨烯是一种有效的方法,但从透射电镜(TEM)中看出其孔隙率很小。因此,本章通过改变表面活性剂,调控银纳米粒子与氧化石墨烯的配比,对制备方法进行改进,得到了孔隙率较大的多孔石墨烯。同样将PGN与HRP结合制得酶生物传感器。实验结果表明,该传感器对HO有优异的电催化活性,检测限低至0.0267 nM,线性范围宽达7个数量级,优于其他HO传感器。最重要的是,由于多孔石墨烯的优异性能和辣根过氧化酶对HO良好的选择性催化,这种传感器成功用于活细胞HO的释放检测,得到了满意的结果;(3)采用一步碳热还原法巧妙地将铂纳米粒子与多孔石墨烯结合,制得无酶电化学传感器。通过扫描电镜(SEM)观察到铂纳米粒子嵌入到了多孔石墨烯中,这种结构鲜有报道。实验结果表明,该传感器对HO有很好的检测效果,具有宽的线性范围(6.0×10.49×10mol/L),低的检测限(2.0×10mol/L)。PtNPs/PGN/GCE表现出如此优异的分析性能主要是由于孔结构可以促进电子的传递,铂纳米粒子可以催化HO的反应。最后,我们用这种传感器进一步探究了其在癌细胞检测中的应用,并考察了HO的释放动力学。

关键词：多孔石墨烯辣根过氧化酶铂纳米粒子过氧化氢电化学传感器活细胞检测氧化应激

基于SPR干涉成像传感法检测大蒜素刺激胃癌细胞的响应

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传感技术学报 2014年第4期27卷 432-437页

作者：窦福印王鹏邢蕊邓士杰吕有勇余兴龙清华大学精密仪器系精密测试技术及仪器国家重点实验室北京100084 北京大学肿瘤医院北京市肿瘤防治研究所恶性肿瘤发病机理及转化研究教育部重点实验室分子肿瘤学实验室北京100142

针对细胞响应传感的要求,提出了SPR干涉成像传感细胞响应的方法,设计制作新颖的微流体池,构建用于活细胞水平分子传感和检测的系统。在此基础上,先检测和分析细胞在微流体池中的培养状态,再检测大蒜素对人胃癌细胞系BGC823刺激响应。实... 详细信息

针对细胞响应传感的要求,提出了SPR干涉成像传感细胞响应的方法,设计制作新颖的微流体池,构建用于活细胞水平分子传感和检测的系统。在此基础上,先检测和分析细胞在微流体池中的培养状态,再检测大蒜素对人胃癌细胞系BGC823刺激响应。实验结果表明,胃癌细胞贴附生长良好,微流体池可提供细胞生存的微环境;6 h后大蒜素刺激和对照的SPR信号响应值分别为0.15 RIRF和0.35 RIRF,大蒜素对胃癌细胞系BGC823细胞具有明显抑制作用。在持续提高精度、可靠性以及丰富有关工艺技术后,有可能建立完整的药物刺激细胞响应检测技术平台,为药物发现和临床化疗方案优化做出贡献。

关键词： SPR干涉成像微流体池活细胞检测大蒜素胃癌细胞系BGC823

基于胞质分裂的增殖心肌细胞探针检测方法的建立

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中国动脉硬化杂志 2022年第10期30卷 890-895页

作者：王静孟新秀刘书琴赵璇肖俊杰上海大学附属南通医院(南通市第六人民医院)上海大学老年医学研究院江苏省南通市226011 上海大学上海器官修复工程技术研究中心上海大学心血管研究所上海市200444

[目的]基于双荧光探针方法,探究全新的在活细胞水平检测心肌细胞增殖的实验方法,该方法能排除多核心肌细胞核复制带来的假阳性细胞,为精准探测心肌细胞增殖提供实验参考。[方法]以细胞内细胞分裂周期蛋白20(CDC20)和痉挛性截瘫蛋白20(SP... 详细信息

[目的]基于双荧光探针方法,探究全新的在活细胞水平检测心肌细胞增殖的实验方法,该方法能排除多核心肌细胞核复制带来的假阳性细胞,为精准探测心肌细胞增殖提供实验参考。[方法]以细胞内细胞分裂周期蛋白20(CDC20)和痉挛性截瘫蛋白20(SPG20)作为探针靶点,构建分子探针,采用脂质体转染试剂2000(Lipo-2000)作为探针载体,将探针转染到细胞中,在活细胞水平检测CDC20和SPG20双阳性的细胞,即为发生胞质分裂的增殖细胞。[结果]细胞不发生增殖时,荧光探针无法检测到目的序列,细胞不发荧光;细胞核复制分裂但不发生胞质分裂时,两个荧光探针不能同时检测到序列,细胞不同时发两种荧光;细胞发生胞质分裂的增殖时,细胞同时发两种荧光。[结论]使用CDC20/SPG20双荧光探针方法,能够准确检测发生胞质分裂的增殖的心肌细胞,从而排除因核增殖产生的细胞增殖假阳性问题,使细胞增殖的检测精准度更高。

关键词：心肌细胞细胞增殖探针活细胞检测胞质分裂

基于氮氮双键异构化机制的新型Cu2+荧光分子探针

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基于氮氮双键异构化机制的新型Cu2+荧光分子探针

作者：曹硕兰州大学

学位级别：硕士

铜是一种对绝大多数生命形式都必不可少的微量金属元素。铜离子作为很多蛋白质和酶的结构和催化因子,对人体的新陈代谢、造血、生长免疫等系统都起着至关重要的调节作用。但是,当体内的铜稳态被破坏时,则会导致多种疾病的发生,例如威尔... 详细信息

铜是一种对绝大多数生命形式都必不可少的微量金属元素。铜离子作为很多蛋白质和酶的结构和催化因子,对人体的新陈代谢、造血、生长免疫等系统都起着至关重要的调节作用。但是,当体内的铜稳态被破坏时,则会导致多种疾病的发生,例如威尔逊氏病、门克斯综合症。此外,铜离子对微生物的生存和植物的生长也有很大影响。因此,微量铜离子的检测在环境和生物学应用中变得越来越重要。但是由于铜离子在生物体内的含量较低,一般的铜离子探针无法灵敏、有效地检测到铜离子,因此设计出一种更灵敏有效的铜离子探针势在必行。本实验旨在基于氮氮双键在光照射下发生可逆的cis、trans构型转换而使激发态电子无法以荧光形式发出从而导致荧光淬灭,并且在Cu2+催化作用下生成新的共价键产物从而抑制氮氮双键异构化而使荧光升起的新机制,设计合成一种基于N=N双键异构化的新型铜离子荧光分子探针。同已报道的Cu2+荧光探针相比,该新型分子探针的环境影响度更小,背景信号更低,反应专一性更好,对检测环境无损伤,并且提高了其溶解性,能良好地应用于细胞内的铜离子检测。

关键词： Cu2+ 荧光探针香豆素氮氮双键异构化活细胞检测

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L-色氨酸发酵过程控制与提取工艺研究

L-色氨酸发酵过程控制与提取工艺研究

作者：刘镇瑜天津科技大学

学位级别：硕士

本文主要对Escherichia coli TRTH(trpEDCBA+TetR)发酵生产L-色氨酸的发酵控制过程和提取工艺进行研究。具体包括以下几个方面:研究活细胞在线监控补料发酵技术对L-色氨酸发酵的影响;从代谢工程角度出发流加琥珀酸以及维持不同的发酵温... 详细信息

本文主要对Escherichia coli TRTH(trpEDCBA+TetR)发酵生产L-色氨酸的发酵控制过程和提取工艺进行研究。具体包括以下几个方面:研究活细胞在线监控补料发酵技术对L-色氨酸发酵的影响;从代谢工程角度出发流加琥珀酸以及维持不同的发酵温度,研究其对色氨酸发酵的影响;采用膜偶联发酵工艺以降低发酵过程中代谢抑制物质的积累量,延长产酸周期;研究L-色氨酸带菌结晶提取工艺流程,确定了最佳的离心因素水平,并比较了不同的脱色工艺效果。主要的实验结果如下所示。(1)采用活细胞在线监控补糖技术,发酵过程严格依据活细胞的量进行补加葡萄糖,避免了糖补加过多导致的乙酸积累问题,且L-色氨酸发酵生产的稳定性较高。发酵过程中乙酸积累量(5 g/L)达到对菌体产生严重抑制作用的时间延迟了 6 h,菌体生物量与L-色氨酸产量较未采用活细胞在线监控发酵而言分别提高了 6.5%、9.8%。整个发酵过程的糖酸转化率提高了 5.7%。细胞内部流向色氨酸的代谢流增加了 3.76%。(2)发酵时长10h随糖流加1 g/L的琥珀酸进行发酵,菌体生物量由48.4g/L提高到51 g/L,L-色氨酸产量由36.1 g/L提高到39.7 g/L。比生长速率与比产酸速率都要高于未流加琥珀酸发酵时的比生长速率与比产酸速率。整个发酵过程的乙酸积累量下降了 10.5%,糖酸转化率提高了 4.21%。(3)分别在34 ℃、36 ℃与38 ℃条件下发酵生产色氨酸,36 ℃发酵条件下的乙酸积累量与糖酸转化率分别为5.27 g/L、17.5%,而34 ℃与38 ℃发酵条件下的乙酸积累量与糖酸转化率分别为4.43 g/L、6.27 g/L与16.4%、15.7%。虽然较低的发酵温度有利于降低乙酸积累量,但由于较低的温度条件下菌体生长受到限制,仍然不利于色氨酸的积累。最终确定发酵温度为36 ℃时更有利于目的产物L-色氨酸的生产。(4)采用膜偶联发酵工艺发酵生产L-色氨酸,与传统发酵过程相比,发酵过程中由于抑制作用的解除,菌体生物量提高了 3.4%。发酵过程中乙酸含量一直控制在5 g/L以下。产酸周期从32h延长至44h,产酸周期延长了 12h,糖酸转化率达到18.5%,膜过滤前后细胞内部流向色氨酸的代谢流并没有显著变化。(5)在罐体带菌结晶提取L-色氨酸的工艺流程中,通过比较不同的相对离心力实验结果,确定采用1800×g(2000r/min)的相对离心力进行离心效果较好。通过分析不同的L-色氨酸脱色工艺,结果表明采用0.5%的活性炭脱色10 min,脱色效果较好。而采用nka-2树脂进行脱色效果优于采用SQD-817树脂进行脱色。nka-2树脂脱色过程中洗脱液选择45%的乙醇进行洗脱效果较好。

关键词： L-色氨酸发酵提取活细胞检测

MnFe PBA纳米材料在生物医药领域的基础应用研究

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MnFe PBA纳米材料在生物医药领域的基础应用研究

作者：苏方方郑州轻工业大学

学位级别：硕士

本论文通过金纳米颗粒(AuNPs)、导电聚合物(PPy)、叶酸(FA)分别对MnFe普鲁士蓝类似物(MnFe PBA)进行改性处理,用于在生物医药领域中的基础应用研究,主要包括三方面:首先,利用AuNPs与MnFe PBA复合的方法解决PBA材料的电化学稳定性问题,... 详细信息

本论文通过金纳米颗粒(AuNPs)、导电聚合物(PPy)、叶酸(FA)分别对MnFe普鲁士蓝类似物(MnFe PBA)进行改性处理,用于在生物医药领域中的基础应用研究,主要包括三方面:首先,利用AuNPs与MnFe PBA复合的方法解决PBA材料的电化学稳定性问题,通过改变AuNPs的用量,合成系列复合材料,优化出MnFePBA@AuNPs-2复合材料中AuNPs不仅尺寸大小均匀,且电化学性能最佳。构筑MnFePBA@AuNPs-2-基电化学适体传感器用于检测肿瘤标志物HER2具有较高的灵敏性(LOD为0.247 pg?mL)、线性测试浓度范围为0.001-1 ng?mL,此外,该适体传感器还表现出高选择性和特异性、良好的稳定性、重复性和适用性。在用于活细胞检测时同样也表现出了优异的灵敏性,LOD为36 cell?m L。其次,受到PB和PBA材料煅烧的启发,在合成MnFe PBA@PPy复合材料后经400°C高温煅烧形成由无定形碳层包覆的双金属氧化物纳米结构-MnO/FeO@aC,并将其构筑电化学适体传感器用于痕量检测肿瘤标记物酪氨酸激酶-PTK7。电极材料优化时发现在系列复合材料和衍生物材料中MnO/FeO@aC与核酸适体链(Apt)和肿瘤标志物-PTK7之间形成的G-四链体的结合力最强,检测PTK7灵敏性最佳,LOD为44 fg?mL同样也表现出优异的选择性、稳定性、重复性和适用性,还可应用于小分子及其它不同蛋白质的检测。最后,通过加入SC和FA功能化改性MnFe PBA材料,使其具有靶向治疗肿瘤的特性,作为抗癌药物载体MnFe-PBA-SC-FA载药率高达94.65%,在模拟生理环境释放药物时具有优异的pH响应性,在pH 5.0条件下10 h内释放量为48.0%,还具有较好的生物相容性,在5-50?g·mL的浓度范围内对MCF-7细胞产生的细胞毒性较弱,激光共聚显微镜成像(CLSM)结果也验证了MnFe-PBA-SC-FA对肿瘤细胞具有高选择性。本研究有望为肿瘤的诊断和治疗提供一种新方法,进一步扩大了PBA-基纳米材料在该领域的应用可能。

关键词：普鲁士蓝类似物纳米复合材料电化学适体传感器癌症标志物检测活细胞检测靶向治疗

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表面增强拉曼光谱及其在活体细胞的应用

表面增强拉曼光谱及其在活体细胞的应用

作者：张枝芝广西师范大学

学位级别：硕士

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)效应是指吸附在金属纳米结构表面的物质,其拉曼光谱信号强度得到极大增强的现象。它是一种灵敏度高且不受水干扰,对细胞损伤小的光谱技术,十分适用于活体细胞等生物体系的研... 详细信息

表面增强拉曼散射(Surface-enhanced Raman scattering, SERS)效应是指吸附在金属纳米结构表面的物质,其拉曼光谱信号强度得到极大增强的现象。它是一种灵敏度高且不受水干扰,对细胞损伤小的光谱技术,十分适用于活体细胞等生物体系的研究。本论文主要研究SERS基底的几种金属纳米粒子的制备、利用SERS光谱研究纳米粒子与红细胞的相互作用等一系列内容。目的在于利用学科之间的互补优势,将激光光镊拉曼光谱技术及纳米技术结合起来,发挥SERS的特有作用,实现应用上的创新和突破。本论文主要研究内容包括以下几点：1.采用柠檬酸钠还原法制备金、银纳米粒子,进而以金纳米粒子为种子制备金核银壳纳米粒子,下文简称银包金纳米粒子(Ag@AuNPs)。在此基础上尝试研究金棒纳米粒子及包裹银层的金棒纳米粒子的制备。采用紫外可见吸收光谱检测纳米粒子表面等离子体共振峰,研究各种纳米粒子的粒径分布及稳定性。并比较系统地研究了这几种纳米粒子对拉曼染料结晶紫(CV)的拉曼信号的增强能力,为接下来红细胞与纳米粒子相互作用的相关研究奠定实验和理论基础。2.利用新型纳米材料银包金纳米粒子作为SERS基底,研究CV信号的增强效果与时间的关系。采用785nm激光激发CV的表面增强拉曼光谱,统计光谱特征峰强度的变化趋势。结果分析发现,CV的725、801、914、1177、1392、1588cm-1等特征峰强度在0-30min内随时间的延长而逐渐升高,达到一个平台后随时间(30-36min)的增加基本保持不变。由此我们知最优最快的CV表面增强光谱的测定时间为30min,从而大大缩短了相关SERS研究的时间周期。3.利用激光光镊拉曼技术追踪红细胞内吞CV包裹的Ag@AuNPs的过程：每隔20秒利用光镊囚禁红细胞并收集该细胞拉曼光谱及邻近溶液的拉曼光谱。光谱分析结果表明,收集到的红细胞光谱包括了归属红细胞与CV的特征峰,其中红细胞的光谱特征峰1001、1128、1213 cm-1和CV的光谱特征峰915、1177、1370、1586、1619 cm-1的强度随着时间上升,表明在红细胞与CV包裹的Ag@AuNPs共培养的过程中,Ag@AuNPs能引起红细胞信号的增强,且CV包裹的Ag@AuNPs在红细胞累积。通过分析红细胞与其邻近溶液这两者的光谱差发现：归属CV的光谱特征峰913、1179、1586cm-1随时间呈类余弦的变化,这表明红细胞内的CV包裹的Ag@AuNPs含量先升高后降低,再升高。通过计算可以得到CV包裹的Ag@AuNPs进入红细胞的时间范围以及进人红细胞的速度、被溶酶体降解的速度。本研究表明表面增强拉曼技术是一种追踪细胞生理过程强有力的工具,为研究外物(纳米粒子、药物等)进入细胞提供了新的实验方法和思路。

关键词：表面增强拉曼光谱纳米粒子结晶紫红细胞内吞作用活细胞检测半定量分析