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羊梨形虫核糖体RNA内转录间隔区序列的测定及反向线状印迹技术的建立

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羊梨形虫核糖体RNA内转录间隔区序列的测定及反向线状印迹技术的...

作者：牛庆丽新疆农业大学

学位级别：硕士

羊梨形虫病（旧称羊焦虫病）是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒属（Theileria）的多种原虫寄生于羊的红细胞或网状内皮细胞内所引起的一类血液原虫病的统称,... 详细信息

羊梨形虫病（旧称羊焦虫病）是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴贝斯科（Babesiidae）巴贝斯属（Babesia）和泰勒科（Theileriidae）泰勒属（Theileria）的多种原虫寄生于羊的红细胞或网状内皮细胞内所引起的一类血液原虫病的统称,临床以高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿或体表淋巴结肿大为主要特征,严重时可引起动物死亡。本病在我国分布广、危害严重,常常给疫区的养羊业造成巨大损失。本研究利用实验室液氮保存的羊梨形虫病病原,包括2种（6株）羊的巴贝斯虫和2种（2株）羊的泰勒虫,采用核糖体RNA的两个内转录间隔区（ITS1和ITS2）基因组区域和5.8S rRNA基因序列分析方法,对我国的新疆喀什地区、河北承德以及甘肃省的临潭、宁县、天祝、麻当六个不同地区羊的巴贝斯虫和甘肃省的渭源、宁夏的隆德两个地区羊泰勒虫进行分子分类学及分子诊断研究。其主要研究结果包括两个方面: 1.利用实验室保存的8株羊梨形虫,提取基因组DNA,测得ITS1-5.8S-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列,分别构建系统发生树,并进行同源性比较。结果显示我国羊的梨形虫可明显分为巴贝斯虫和泰勒虫两枝;其中,莫氏巴贝斯虫株之间的同源性明显高于新疆喀什株未定种巴贝斯虫。巴贝斯虫的ITS1和ITS2核苷酸区段变异较大,种间同源性分别在19.7%-99.4%,河北株、宁县株、临潭株、天祝株和麻当株的巴贝斯虫都是由血蜱属传播的,在遗传演化过程中的亲缘关系较近,同源性比较高,在ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2序列的系统发生树上,共处一枝。新疆喀什株是由璃眼蜱属传播的,被其它的一些巴贝斯虫隔开,独立占有一枝,可以认为是一个独立的种。5.8S rRNA较保守,种间同源性在87.1%-100%之间,系统发生树上各种巴贝斯虫的分布与ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2系统发生树基本一致。两种泰勒虫之间的同源性比较高,同已经测得的18S rRNA基因区段相似,其ITS1和ITS2区段种间变异较小,ITS1-5.8S-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列的同源性分别为96.8%、96.4%、100%和95.2%。该结果与18S rRNA基因序列分类方法基本符合。 2.在已经确定的18S rRNA基因V4高变区段的基础上,利用反向线状印迹杂交技术（RLB）高特异性和高敏感性的特点,设计了梨形虫通用探针和属种特异性探针,用RLB技术检测以上8株羊梨形虫。所有种特异性探针都仅仅和它们各自的靶序列发生反应,无论是在不同虫种,还是不同种群之间都没有交叉反应,与绵羊/山羊基因组对照试验没有杂交信号。将两种羊巴贝斯虫（莫氏巴贝斯虫和巴贝斯虫未定种喀什株）和两种羊泰勒虫（吕氏泰勒虫渭源株,尤氏泰勒虫隆德株）基因组经分光光度计定量在100ng/ul,连续10倍稀释10-1-10-12,用RLB方法检测,结果显示泰勒虫较羊巴贝斯虫的敏感性高,莫氏巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种喀什株、吕氏泰勒虫和尤氏巴贝斯虫的敏感性分别是0.01pg、0.1ng、0.0001pg、0.1pg,吕氏泰勒虫的敏感性明显高于尤氏泰勒虫。该方法还可以用来鉴别诊断吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫感染。对117份野外样品检测,并与ELISA血清检测和PCR结果相比较,发现反向线状印迹的检出率明显高于ELISA和PCR。所建立的方法可用于羊梨形虫病的诊断和流行病学调查。

关键词：梨形虫巴贝斯虫泰勒虫反向线状印迹杂交分子分类

郑州地区犬源梨形虫感染情况调查及种系发育分析

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郑州地区犬源梨形虫感染情况调查及种系发育分析

作者：党冰怡河南农业大学

学位级别：硕士

梨形虫病(Piroplasmosis),旧称焦虫病,是一类由梨形虫纲巴贝斯科或泰勒科原虫引起的寄生于人类和多种动物红细胞内的蜱传性血液原虫疾病,包括巴贝斯虫病(Babesiosis)和泰勒虫病(Theileriosis)。临床表现主要包括贫血、高热、黄疸、消瘦... 详细信息

梨形虫病(Piroplasmosis),旧称焦虫病,是一类由梨形虫纲巴贝斯科或泰勒科原虫引起的寄生于人类和多种动物红细胞内的蜱传性血液原虫疾病,包括巴贝斯虫病(Babesiosis)和泰勒虫病(Theileriosis)。临床表现主要包括贫血、高热、黄疸、消瘦、精神沉郁等症状。梨形虫病分布于世界各地。梨形虫宿主范围较广泛,可感染人类和野生及驯养的哺乳动物,给养殖业造成巨大损失的同时,也威胁着人类健康,具有重要公共卫生学意义。本研究对我国郑州地区犬源梨形虫感染和分布情况进行了调查,并对其遗传进化关系进行了分析,可望对犬梨形虫病的发生、流行与防控提供一定的科学参考。1.2013年4月至2017年7月期间,从河南省郑州市10个不同的地点,采用前肢静脉采血法共收集393份犬新鲜抗凝血样品。对采得的样本进行血液全基因组DNA提取,所获DNA样本分别进行基于18S rRNA基因的常规PCR和巢氏PCR扩增,并对阳性扩增产物进行测序鉴定。结果显示,犬梨形虫的总体感染率为5.34%(21/393)。阳性样品中共检测到三种梨形虫病原,分别为吉氏巴贝斯虫(3.82%,15/393)、吕氏泰勒虫(1.01%,4/393)和环形泰勒虫(0.51%,2/393)。不同采样点犬梨形虫的感染率各异,从0%至100%不等;大型犬吉氏巴贝斯虫的感染率(7.55%,8/106)显著高于中型犬(1.87%,2/107)和小型犬(2.48%,5/180),其中,罗威纳犬和德国牧羊犬的感染率分别达到100%(1/1)和45.45%(5/11)。然而,不同饲养模式下,家庭饲养犬(5.64%,19/337)与流浪犬(3.57%,2/56)的梨形虫感染率无显著差异;雄性犬(5.43%,10/184)与雌性犬(7.19%,11/153)的梨形虫感染率差异也不显著。2.对获得的21份犬梨形虫的18S rRNA基因序列,分别应用SeqMan和ClustalX 2.11软件进行比对和校准。对校准后的犬源巴贝斯虫和泰勒虫序列,同时使用MEGA6.06软件基于Neighbor-Joining法对其进行分子种系发育进化分析,进而构建遗传发育进化树。犬源巴贝斯虫的进化分析结果表明,本研究中鉴定的吉氏巴贝斯虫均聚集于之前报道的吉氏巴贝斯虫分枝中。本研究共鉴定出两种吉氏巴贝斯虫基因型,一种为以DXY7和YD11为代表,与日本的亚洲型(LC012808)和美国的北卡罗来纳型(AF271081)同源性达99%;另一种为以W4和YN21为代表,与我国武汉(KP666166)和美国(EU084677)的吉氏巴贝斯虫同源性达99%。犬源泰勒虫的进化分析结果表明,环形泰勒虫有两种基因型,分别为YN16和YN2。其中,YN16与印度(KT367868)发现的环形泰勒虫同源性为99%,YN2与我国(EU083800)牛源环形泰勒虫的同源性为99%。吕氏泰勒虫有两种基因型,分别为基因型LL16、DXY28、WT10,以及DF84。其中,LL16和DXY28与WT10形成单独的分枝;而DF84与河南嵩县(JX469518)的吕氏泰勒虫同源性为99%。综上所述,本研究报道了我国郑州地区犬源梨形虫的感染和分布情况,并进行了分子种系发育进化分析。研究中发现的犬源巴贝斯虫病原全部为吉氏巴贝斯虫,该病原可能为郑州地区犬源巴贝斯虫的优势种;本研究首次报道了我国环形泰勒虫和吕氏泰勒虫的犬源宿主。研究结果为我国犬源梨形虫病流行病学及遗传进化分析提供一定的数据支持。

关键词：梨形虫巴贝斯虫泰勒虫 PCR 18S rRNA基因流行病学种系发育分析犬

陕西省部分地区硬蜱种类的鉴定及其携带病原的检测

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陕西省部分地区硬蜱种类的鉴定及其携带病原的检测

作者：尹传松西北农林科技大学

学位级别：硕士

硬蜱能够携带和传播广泛的病原体(细菌、病毒和原生动物),这些病原体对全球人类和动物的健康都有很大的威胁。关于蜱虫分布及其携带病原体方面的研究还相对较少。因此,本研究旨在掌握和完善陕西省硬蜱的种类及其携带病原情况,为进一步... 详细信息

硬蜱能够携带和传播广泛的病原体(细菌、病毒和原生动物),这些病原体对全球人类和动物的健康都有很大的威胁。关于蜱虫分布及其携带病原体方面的研究还相对较少。因此,本研究旨在掌握和完善陕西省硬蜱的种类及其携带病原情况,为进一步完善相应的蜱媒疾病的防控和深入研究提供数据支撑。2017年3月至2020年9月,收集陕西省西安市、咸阳市、安康市和汉中市共4个地区分别来自刺猬、犬和牛等动物体表的蜱。通过对蜱采用形态学鉴定以及基于线粒体12S r DNA和16S r DNA基因的分子生物学鉴定,以确定蜱虫种类。采用PCR检测技术,基于不同基因分别检测蜱所携带立克次体、巴贝斯虫、泰勒虫、肝簇虫、嗜吞噬细胞无形体等病原的情况,获得结果如下:1.共采集到129只蜱虫样本,经形态学初步鉴定,并基于12S r DNA、16S r DNA基因的分子生物学方法,结果共鉴定出5种蜱,分别为微小扇头蜱(Rhipicephalus microplus)、长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)、锐跗硬蜱(Ixodes acutitarsus)、褐黄血蜱(Haemaphysalis flava)和铃头血蜱(Haemaphysalis campanulata)。2.对129只蜱虫样品通过PCR扩增与测序,结果显示,这些蜱种中共携带有7种病原,分别是Candidatus Rickettsia jingxinensis、日本立克次体(Rickettsia japonica)、双芽巴贝斯虫(Babesia bigemina)、牛巴贝斯虫(Babesia bovis)、东方泰勒虫(Theileria orientails)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、犬肝簇虫(Hepatozoon canis)。各种蜱种检出携带的病原分别为:微小扇头蜱携带有B.bovis、B.bigemina、T.orientails、Ca.R.jingxinensis、A.phagocytophilum等5种病原;长角血蜱携带有T.orientails、Ca.R.jingxinensis、H.canis等3种病原;褐黄血蜱携带有R.japonica与A.phagocytophilum 2种病原;铃头血蜱携带有T.orientails与Ca.R.jingxinensis 2种病原;锐跗硬蜱只携带A.phagocytophilum这1种病原。3.不同蜱种之间各病原存在混合携带现象,其中长角血蜱中犬肝簇虫与Ca.R.jingxinensis混合携带率为12.4%,褐黄血蜱中日本立克次体与嗜吞噬细胞无形体混合携带率为2.3%,微小扇头蜱中2种及3种病原的混合携带率为47.3%。综上所述,陕西省存在长角血蜱、微小扇头蜱、褐黄血蜱、铃头血蜱、锐跗硬蜱等5个蜱种的分布。这些蜱中携带的病原体至少包括日本立克次体、Ca.R.jingxinensis、双芽巴贝斯虫、牛巴贝斯虫、东方泰勒虫、犬肝簇虫以及嗜吞噬细胞无形体等7种不同病原,并且单个蜱存在2种及3种病原体混合携带的情况。

关键词：硬蜱种类鉴定蜱传病原立克次体巴贝斯虫泰勒虫肝簇虫

感染人的新型梨形虫病原体的动物感染，形态学及分子生物学鉴定

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感染人的新型梨形虫病原体的动物感染，形态学及分子生物学鉴定

作者：崔加瑞第二军医大学

学位级别：硕士

梨形虫(Piroplasma)属顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、梨形虫目(Piroplasmida),对人畜健康影响较大的蜱传种类分别属于巴贝虫属(Babesia spp.)和泰勒虫属(Thelieria spp.),可引起梨形虫病[1],由于过去梨形虫曾译为“焦虫”,... 详细信息

梨形虫(Piroplasma)属顶复门(Apicomplexa)、孢子虫纲(Sporozoa)、梨形虫目(Piroplasmida),对人畜健康影响较大的蜱传种类分别属于巴贝虫属(Babesia spp.)和泰勒虫属(Thelieria spp.),可引起梨形虫病[1],由于过去梨形虫曾译为“焦虫”,故梨形虫病又被称为“焦虫病”,也曾称“红细胞住血原虫(hematocytozoon)"。梨形虫经由蜱传播,在宿主体内的主要形态呈圆形、梨形、杆形、椭圆形、逗点形或阿米巴形等形态,具有顶复细胞器。有性生殖和孢子增殖是在无脊椎动物宿主体内进行,在脊椎动物宿主体内进行无性生殖。梨形虫病一般呈急性过程,通常表现为贫血、血红蛋白尿和黄疸,具有明显的季节性和地区性,巴贝虫是人和动物巴贝虫病的病原,而泰勒虫是动物泰勒虫病的病原[3-6]。一般认为,泰勒虫不感染人类。梨形虫病在世界各地流行,死亡率高,给畜牧业和国民经济造成重大损失。梨形虫的鉴定与分类主要有传统分类学和分子分类学两种方法。传统分类学依据所寄生的宿主、形态、发病动物临床症状等进行分类,但由于病原形态的多变性,生活史较难追踪,传播媒介多样性,种种因素使传统分类学存在一定的局限[8]。随着分子生物学技术的发展,核酸扩增方法在梨形虫的分类鉴定有着决定性的作用。本研究将取自有临床症状的病人带虫血液分别对四种动物(昆明鼠,Balb/c小鼠,沙鼠,新西兰兔)进行感染,感染后定期取血观察血液内病原体的形态特征,并观察超微结构,从形态学上对该梨形虫进行鉴定。在该梨形虫在动物体内的感染量达到峰值的时候,取动物血液提取DNA,扩增梨形虫18S rRNA,对该梨形虫进行分子生物学鉴定。在动物血液涂片的观察中发现,该梨形虫在白细胞内细胞核周围呈密集的点状,类似嗜碱性白细胞。在红细胞中可以观察到梨形、椭圆形、逗点状的外观形态。与巴贝虫和泰勒虫的形态对比有相似之处,具有泰勒虫的特征,即白细胞内裂体增殖,提示该病原体有可能是泰勒虫相关种类。根据文献报道,合成四条针对巴贝虫、泰勒虫18S rRNA的通用引物进行半巢式多重PCR,三次PCR扩增的片段均与泰勒虫具有更高的同源性,对PCR产物经克隆测序364bp序列比对,与泰勒虫18S rRNA同源性达到99%。但是,在多次重复的PCR中,也出现克隆序列与Colpodella序列84%同源性。而我国学者也在发热病人血液中扩增到Colpodella相似序列,Colpodella是一种与其它顶复门原虫(包括疟原虫及梨形虫)具有并列进化关系的自由生活原虫[11]。本研究所鉴定梨形虫取自病人血液,通过传统形态学鉴定与分子生物学鉴定相结合,从动物外周血白细胞中发现裂殖体,提示该虫具有泰勒虫的形态特征。综合多次PCR及测序结果,扩增序列与泰勒虫和Colpodella的相似程度高于巴贝虫,说明该病原体是巴贝虫的可能性小于前两种虫。迄今为止,寄生虫学研究认为,巴贝虫可以感染人和动物,泰勒虫仅在动物中发现,但从NCBI的GenBank中搜索到一个泰勒虫的序列是从发热病人血液扩增得到的[12];Colpodella相似的序列也有从人体扩增的报道。这种现象尚难以解释,不能确定是几种病原体的混合感染,还是一种尚待认知的新虫种。泰勒虫和巴贝虫属于顶体复合物门,而Colpodellids门则是与顶体复合物门相近的一个姊妹世系(sister lineage),因而,该病原体的分类地位可能在囊泡虫总门(Alveolata)。其确切的分类地位有待进一步鉴定。本本研究对一种未知人体寄生原虫的鉴定,其结果对该新病原体的认知又进了一步,对于未知梨形虫病的防治积累基础理论,对临床中的未知原虫感染患者提供了相应的鉴别方法,也为人群中该病的流行病学调查奠定了基础,对防治该新出现的血液感染性病原体具有重要的意义。

关键词：梨形虫鉴定泰勒虫 Colpodella 巴贝虫动物感染半巢式多重PCR

引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度和特异性影响的研究

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引物和探针核苷酸错配对PCR灵敏度和特异性影响的研究

作者：黄可扬州大学

学位级别：硕士

PCR(Polymerase chain Reaction,聚合酶链式反应)是分子生物学中一种重要的诊断技术,灵敏度与特异性是表现其扩增效率的两个重要参考指标。影响PCR扩增效率的因素众多,而引物和探针的设计是一个PCR成功的关键。目前有关引物设计的研究... 详细信息

PCR(Polymerase chain Reaction,聚合酶链式反应)是分子生物学中一种重要的诊断技术,灵敏度与特异性是表现其扩增效率的两个重要参考指标。影响PCR扩增效率的因素众多,而引物和探针的设计是一个PCR成功的关键。目前有关引物设计的研究多集中于引物的长度、GC含量等方面,而引物与模板的错误结合而引起的非特异性扩增或扩增效率下降的相关研究还很匮乏且不系统,并且无适用于临床应用的实例,目前还没有探针核苷酸错配对PCR检测影响的相关研究。为了提高PCR设计的效率和可信度,从引物与探针的核苷酸序列的特异性对扩增效率的影响进行研究十分必要,为引物与探针的设计提供更可靠的参考。在本论文的第二章中,我们以肺炎衣原体的全核酸为模板,在上下游引物的不同位点引入核苷酸错配,研究单个核苷酸错配、多个核苷酸错配在不同位点、数量以及错配类型对扩增效率的影响,并囊括了引物3’端4种碱基突变为其它任何碱基类型对扩增效率的影响;同时考虑到DNA聚合酶的影响,在经过对市场上商业化DNA聚合酶扩增效率的对比后,研究扩增效率较好的Takara和Platinum两种DNA聚合酶在引物发生核苷酸错配时对反应扩增效率的影响情况,本实验对扩增效率的界定是通过实时荧光定量PCR定量的拷贝数进行计算获得的。进一步研究,通过对FRET探针核苷酸进行错配,在FAM探针上的不同位点依次增加核苷酸错配的数量,研究其对PCR检测的核苷酸错配的容忍度。在第三章中,将错配研究所得到的结论应用于实际引物设计,对临床上18SrRNA序列同源性较高的巴贝斯虫以及泰勒虫进行分子区分,设计特异性地扩增巴贝斯虫的PCR,并且通过临床样品和其它参考方法比较,并用电泳和测序验证。上下游引物进行核苷酸错配时,其结果表明,单个核苷酸错配:Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的扩增效率更低,单个核苷酸错配对Takara DNA聚合酶的扩增效率没有太大影响(接近100%);引物3’端核苷酸由C变为A,以及由G变为C时扩增效率最差,由T变为C以及由A变为C时,扩增效率最好;距离3’端4个碱基位置发生错配时,扩增效率为82.3%;Platinum DNA聚合酶在引物3’端使用简并碱基,简并两个,三个,四个碱基的平均扩增效率分别为59.3%、43%、33.9%。多个核苷酸错配时:Platinum DNA聚合酶和Takara DNA聚合酶在引物5’端及引物中间的错配的平均扩增效率为92.6%和100%,对扩增效率影响不明显,5’端能够容忍连续8个核苷酸错配;Takara DNA聚合酶在引物3’端连续4个错配时扩增效率下降最快(15%以下);上下游引物错配位点不在3’端时,其总数加起来为10个时,扩增效率不低于40%。FAM探针进行核苷酸错配时,其结果表明:探针发生少数几个错配时,扩增效率没有影响,但在探针中间位置连续发生5个错配时,将直接导致没有扩增曲线;在任何位点发生错配时,其Tm值会随着错配个数的增加而逐渐下降,且错配位点发生在探针的中间时,其Tm值下降的更明显:发生4个核苷酸错配时,中间位点的Tm值下降10℃,下降幅度明显大于探针3’端与5’端错配4个时Tm下降的3℃。巴贝斯虫和泰勒虫是以蜱虫为传播媒介、胞内寄生的原虫,它们的18SrRNA序列高度相似,临床症状极度相近,实际检测中难以区分。本研究的文献查阅和初步试验表明,被大家最广泛认可的PCR方法不可以区分这二种病原体。本研究应用错配结论进行引物设计,建立区分巴贝斯虫与泰勒虫的PCR方法。在使用设计的巴贝斯虫特异性引物扩增人工构建的泰勒虫18S rRNA质粒时,当特异性引物与泰勒虫只差引物3’端最后一个核苷酸且模板浓度为100拷贝/反应时,若引物由G变为C,两种聚合酶都没有扩增出泰勒虫产物;由T变为G时,Takara DNA聚合酶扩增出泰勒虫产物,Platinum DNA聚合酶没有扩增出泰勒虫产物;由A变为C时,两种聚合酶都能扩增出泰勒虫产物。使用由G变为C这套特异性引物扩增40个来源不同的临床样品时,结果显示阳性率为7.5%,测序结果表明扩增序列正确,低于引用的常用的引物的50%与30%,且其测序结果中有泰勒虫序列出现。综上所述,本研究关于引物与探针核苷酸错配对扩增效率的影响表明,在引物3’端发生核苷酸错配时,不同DNA聚合酶的效率有差别,Platinum DNA聚合酶比Takara DNA聚合酶的特异性更强,而Takara DNA聚合酶的灵敏度更高,能够容忍较多的错配;引物3’端由G变为C和由T变为G时对PCR扩增效率影响最大;错配发生在距离3’端4个碱基或发生在5’端(能容忍连续8个错配)和中间时,对扩增效率的影响不大;上下游引物除3’端以外的其它位点错配在错配数量达到10个时仍然能有扩增反应。探针核苷酸在中间发生错配时对扩增效率的影响较大,能容忍的错配个数为5个核苷酸。本研究关于引物设计的实际应用表明:基于上

关键词： FRET-qPCR 核苷酸错配扩增效率 DNA聚合酶简并碱基引物设计探针设计巴贝斯虫泰勒虫

我国部分地区羊球虫种类及梨形虫病分子流行病学调查

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我国部分地区羊球虫种类及梨形虫病分子流行病学调查

作者：卫九健河南农业大学

学位级别：硕士

寄生虫病（Parasitic disease）是严重危害养羊业健康发展的主要疾病之一，而球虫病（Coccidiosis）和梨形虫病（Piroplasmosis）则是常见的寄生虫病。这两种疾病在世界范围内均有分布，绵羊和山羊均易感染。绵羊和（或）山羊感染球虫（... 详细信息

寄生虫病（Parasitic disease）是严重危害养羊业健康发展的主要疾病之一，而球虫病（Coccidiosis）和梨形虫病（Piroplasmosis）则是常见的寄生虫病。这两种疾病在世界范围内均有分布，绵羊和山羊均易感染。绵羊和（或）山羊感染球虫（Coccidian）或梨形虫（Piroplasma）后，生长发育迟缓和繁殖性能下降，羊肉、羊奶、羊毛（绒）、羊肠衣及皮革的产量和品质均降低，严重时感染甚至死亡。该病在世界范围内造成了巨大的经济损失，严重阻碍了绵羊和山羊养殖业的健康发展。本研究从2011年1月至2012年11月，应用饱和蔗糖溶液漂浮法和麦克马斯特计数法对采自我国部分地区的2639份粪便样品进行了检查，对球虫阳性样品中的球虫卵囊进行收集和培养，并对球虫种类进行了鉴定。应用基于梨形虫18S rRNA基因序列的PCR对采自我国部分地区的465份血液样品进行了检查，并对梨形虫阳性样品进行虫种鉴定和种系进化分析。1.为了解我国部分地区羊球虫种类感染情况，为羊球虫病的防制提供科学的参考和依据，于2011年1月至2012年11月，应用饱和蔗糖溶液漂浮法和麦克马斯特计数法对采自河南省部分地区、安徽省合肥市、重庆市云阳县、辽宁省朝阳市、吉林省双辽市、山东省东营市、内蒙古自治区乌兰察布市商都县和锡林郭勒盟苏尼特右旗、贵州省贵阳市花溪区和黔西南布依族苗族自治州晴隆县、云南省昆明市等23个县市的2639份粪便样品（其中绵羊粪便样品1150份，山羊粪便样品1489份）进行了检查，对球虫阳性样品中的球虫卵囊进行收集和培养，并对球虫种类进行了鉴定。结果，球虫总感染率为95.72%（2526/2639），其中绵羊球虫感染率为96.43%（1109/1150），山羊球虫感染率为95.16%（1417/1489）;共检出13种绵羊艾美尔球虫和12种山羊艾美尔球虫，绵羊艾美尔球虫分别为阿撒他艾美尔球虫（Eimeria ahsata）、巴库艾美尔球虫（E. bakuensis）、小型艾美尔球虫（E. parva）、贡氏艾美尔球虫（E. gonzalezi）、苍白艾美尔球虫（E. pallida）、颗粒艾美尔球虫（E. granulose）、温布里吉艾美尔球虫（E. weybridgensis）、类绵羊艾美尔球虫（E.ovinoidalis）、马尔西卡艾美尔球虫（E. marsica）、槌形艾美尔球虫（E. crandallis）、错乱艾美尔球虫（E. intricate）、浮氏艾美尔球虫（E. faurei）和斑点艾美尔球虫（E. punctata），山羊艾美尔球虫分别为阿普艾美尔球虫（E. apsheronica）、阿氏艾美尔球虫（E. arloingi）、艾丽艾美尔球虫（E. alijevi）、斑点艾美尔球虫（E. punctata）、苍白艾美尔球虫（E. pallida）、家山羊艾美尔球虫（E. hirci）、柯察艾美尔球虫（E. kocharli）、克氏艾美尔球虫（E. christenseni）、妮氏艾美尔球虫（E.ninakohlyakimovae）、山羊艾美尔球虫（E. caprina）、羊艾美尔球虫（E. caprovina）和约奇艾美尔球虫（E. jolchijevi）。羊球虫多为混合感染，其中绵羊为81.19%（807/994），山羊为71.39%（604/846）;绵羊混合感染2～10种艾美尔球虫，优势虫种为马尔西卡艾美尔球虫、巴库艾美尔球虫和小型艾美尔球虫;山羊混合感染2～9种艾美尔球虫，优势虫种为家山羊艾美尔球虫、阿氏艾美尔球虫、克氏艾美尔球虫和艾丽艾美尔球虫。不同地区、不同年龄、不同月份、不同品种、不同饲养方式的绵羊和山羊感染的球虫种类不一，感染率也不相同，但优势虫种基本一致。本研究首次对湖羊球虫及其种类和不同月份羊球虫种类进行了调查。研究表明，绵羊和山羊球虫感染普遍，且多为混合感染，严重感染时可导致疾病的发生，在生产中，我们应该采取综合的防制措施来防止羊球虫病的发生，将其带来的损失降到最低。2.为了解我国部分地区羊梨形虫感染情况及其分子流行病学特征，为羊梨形虫病的防制提供科学的参考和依据，于2011年11月至2012年11月应用血液涂片姬姆萨染色镜检法和PCR（常规PCR和巢式PCR）对采自河南省部分地区、贵州省贵阳市花溪区和黔西南布依族苗族自治州晴隆县、云南省昆明市、山西省运城市万荣县、内蒙古自治区乌兰察布市商都县和锡林郭勒盟苏尼特右旗等22县市的465份羊血液样品进行了检查。结果，血液涂片姬姆萨染色镜检法共检出52份梨形虫阳性样品，感染率为11.18%（52/465）;PCR共检出78份梨形虫阳性样品，感染率为16.77%（78/465）。应用特异性引物进行PCR扩增后证明，所分离的羊梨形虫为吕氏泰勒虫（Theilerialuwenshuni）和莫氏巴贝斯虫（Babesia motasi）。研

关键词：球虫泰勒虫巴贝斯虫 18SrRNA基因 PCR 种系发育分析绵羊山羊

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新疆喀什部分地区驴梨形虫病检测初报

中国动物传染病学报 2015年第3期23卷 65-68页

作者：卡丽比努尔.尔肯海尼木古丽.艾合买提图尔荪.萨迪尔沙塔尔.卡哈尔巴音查汗新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052 新疆维吾尔自治区托克逊县夏乡畜牧业服务中心托克逊838100 新疆维吾尔自治区吐鲁番市畜牧兽医站吐鲁番838000

为了解新疆维吾尔自治区南疆部分地方驴泰勒虫和驽巴贝斯虫病的存在情况,本文采用PCR技术和竞争性酶联免疫吸附试验(c-ELISA)检测喀什部分地区驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的流行情况。调查结果显示,喀什地区疏勒县和疏附县驴寄生虫总感染... 详细信息

为了解新疆维吾尔自治区南疆部分地方驴泰勒虫和驽巴贝斯虫病的存在情况,本文采用PCR技术和竞争性酶联免疫吸附试验(c-ELISA)检测喀什部分地区驴泰勒虫病和驽巴贝斯虫病的流行情况。调查结果显示,喀什地区疏勒县和疏附县驴寄生虫总感染率为45.17%。通过PCR方法检测出19份血样感染泰勒虫病,感染率为36.84%;未检出驽巴贝斯虫病。通过c-ELISA方法检测出96份血清感染泰勒虫病,感染率为7.29%;驽巴贝斯虫的感染率为1.04%。通过本次驴寄生虫感染调查,对喀什部分地区驴寄生虫感染情况有了初步了解,为该地区驴的健康发展提供了科学依据。

关键词：泰勒虫驽巴贝斯虫 PCR c-ELISA 检测驴

牛羊梨形虫PCR-RFLP分类方法的建立及部分标志基因的克隆与测序

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牛羊梨形虫PCR-RFLP分类方法的建立及部分标志基因的克隆与测序

作者：徐宗可中国农业科学院

学位级别：硕士

梨形虫是经由蜱传播的血液寄生原虫,包括泰勒虫和巴贝斯虫,在世界热带和亚热带地区广泛流行,使动物患巴贝斯虫病和泰勒虫病。牛巴贝斯虫病病原有牛巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、大巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫。... 详细信息

梨形虫是经由蜱传播的血液寄生原虫,包括泰勒虫和巴贝斯虫,在世界热带和亚热带地区广泛流行,使动物患巴贝斯虫病和泰勒虫病。牛巴贝斯虫病病原有牛巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫、巴贝斯虫未定种、大巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、分歧巴贝斯虫。牛泰勒虫病病原有环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫、中华泰勒虫、小泰勒虫和突变泰勒虫。梨形虫病一般呈急性过程,通常表现贫血、血红蛋白尿和黄疸。本病在世界各地流行,且死亡率高,给畜牧业和国民经济造成巨大损失。本实验利用实验室保存的梨形虫虫种,对梨形虫的标志基因（18S、Co I和cyt b）进行初步探索,并应用Co I和cyt b对巴贝斯虫和泰勒虫进行系统发育关系分析,验证几个在传统分类地位上有争议的梨形虫虫种。主要的研究内容包括以下几个方面: 1.从NCBI数据库中调取梨形虫18S rRNA基因的序列,保存为FASTA格式并用CLUSTAL-X软件对序列进行比对分析,缺省参数。每一条比对的序列都在1.7Kb左右。然后,选择不同的限制性内切酶,对梨形虫18S rRNA基因的PCR扩增产物进行酶切分析。通过酶切图谱的不同而达到鉴定不同巴贝斯虫和泰勒虫虫种的目的。为梨形虫的分类和流行病学调查提供了新的方法。 2.利用实验保存的梨形虫虫种,提取虫种的基因组DNA,运用PCR方法扩增梨形虫的Co I和cyt b基因,经测序分析后构建系统进化树,并进行亲缘关系比较。结果显示:我国梨形虫CoI基因序列的同源性在99.6%—38.1%之间,巴贝斯虫Co I基因之间的同源性在98.9%—74.1%之间,泰勒虫Co I基因之间的同源性在98.6%—38.1%之间。其中泰勒虫Co I基因之间的差异性较巴贝斯虫大。我国梨形虫cyt b基因序列的同源性在37.2%—99.4%之间,泰勒虫之间的同源性在52.5%—99.4%之间,巴贝斯虫之间的同源性在83.8%—97.9%之间。其中巴贝斯虫之间的同源性比较高。在遗传进化关系上梨形虫和疟原虫之间的亲缘关系比较近,处于一个大的分支上;与草履虫之间的进化关系比较远,处于不同的分枝上。该结果与传统的利用18S rRNA基因序列建立的系统发育树基本符合。

关键词：梨形虫泰勒虫巴贝斯虫细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ 细胞色素b 系统进化树

牛梨形虫核糖体RNA转录间隔区序列的测定及应用

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牛梨形虫核糖体RNA转录间隔区序列的测定及应用

作者：刘军龙中国农业科学院

学位级别：硕士

牛梨形虫病(旧称焦虫病)是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的多种原虫寄生于牛的红细胞或网状内皮细胞内所引起的一类疾病的统称，以高热、贫血、黄疸... 详细信息

牛梨形虫病(旧称焦虫病)是由顶复门、梨形虫纲、梨形虫目中的巴贝斯科(Babesiidae)巴贝斯属(Babesia)和泰勒科(Theileriidae)泰勒属(Theileria)的多种原虫寄生于牛的红细胞或网状内皮细胞内所引起的一类疾病的统称，以高热、贫血、黄疸、血红蛋白尿或体表淋巴结肿大为主要特征，严重时可引起动物死亡。本病在我国分布广、危害严重，常常给疫区的养牛业造成巨大损失。本研究用实验室内分离保藏的牛梨形虫病病原，包括：5种牛巴贝斯虫(9株)和3种泰勒虫(7株)，感染实验动物，采集染虫血液，提取基因组DNA，设计适当引物，利用PCR方法扩增核糖体RNA基因转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)，将扩增产物连接到pGEM-T easy载体，进行核苷酸序列测定。结果显示，巴贝斯虫转录间隔区核苷酸片段的大小在577bp-750bp之间，泰勒虫在916-1074bp。用所测得的ITS1-5.8S-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列分别构建系统发生树，并进行同源性比较。结果显示：我国牛的梨形虫可明显分为泰勒虫和巴贝斯虫两枝，与传统分类方法及18S rRNA系统发生树的结果基本一致。巴贝斯虫的ITS1和ITS2核苷酸区段变异较大，种间同源性分别在4.4％-97.7％，有时甚至超过种内不同地方株之间的关系，但在ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2序列的系统发生树上，牛巴贝斯虫、大巴贝斯虫和牛巴贝斯虫未定种新疆株均自成一枝，双芽巴贝斯虫与卵形巴贝斯虫共处一枝，位于卵形巴贝斯虫汶川株与卵形巴贝斯虫其它3个分离株之间;5.8S较保守，种间同源性在61.3％-100％之间，系统发生树上各种巴贝斯虫的分布与ITS1-5.8S-ITS2、ITS1和ITS2系统发生树基本一致。泰勒虫ITS1和ITS2区段种内变异较小，种内地方分离株之间的同源性远远大于种间同源性：环形泰勒虫3个地方株之间ITS1-5.8S-ITS2、ITS1、5.8S和ITS2序列的同源性分别为92.2％-94.2％、91.2％-93.1％、97.5％-98.1％和92.7％-95.3％，瑟氏泰勒虫3个地方株之间4个核苷酸区段的同源性分别为97.0％-97.9％、96.2％-97.3％、98.7％-99.4％和97.8％-99.3％，中华泰勒虫3个地方株之间4个核苷酸区段的同源性分别为98.3％-99.6％、98.2％-99.5％、99.4％-100.0％和97.7％-100.0％;而环形泰勒虫与瑟氏泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为18.3％-35.7％、5.4％-5.6％、95.6％-98.1％和12.3％-14.8％，环形泰勒虫与中华泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为18.7％-36.5％、8.9％-11.8％、94.9％-97.5％和9.1％-20.7％，瑟氏泰勒虫与中华泰勒虫4个核苷酸区段之间的同源性分别为54.2％-55.3％、29.7％-33.0％、96.2％-98.1％和61.0％-61.7％;在所建立的4个系统发生树上，环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫分处于3个分枝上。该结果比18SrRNA基因更清楚的揭示：我国存在三种牛的泰勒虫，它们是环形泰勒虫、瑟氏泰勒虫和中华泰勒虫，中华泰勒虫是不同于其它泰勒虫的一个有效种。根据已测定的核糖体转录间隔区基核苷酸列设计牛巴贝斯虫和双芽巴贝斯虫的特异性引物，建立了一种能够同时检测牛巴贝斯虫和牛双芽贝斯虫的多重PCR检测方法，且与其它梨形虫病病原没有交叉反应，对双芽巴贝斯虫和牛巴贝斯虫混合感染血样的检测敏感性分别可达到10、10。通过对114份人工感染及治疗后所采血样的检测，PCR方法检测阳性率为50.88％，显微镜检测阳性率23.68％，显示多重PCR检测方法明显优于显微镜检测。

关键词：梨形虫巴贝斯虫泰勒虫多重PCR 分子分类