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Interleukin-34对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的调控研究

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Interleukin-34对巨噬细胞源性泡沫细胞形成的调控研究

作者：刘庆艳中国人民解放军医学院

学位级别：硕士

研究背景:巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质(特别是氧化低密度脂蛋白oxidized Low-density Lipoprotein, ox-LDL)形成泡沫细胞(Foam Cell)是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)病理过程的中心环节,贯穿在早期脂纹形成到斑块破裂的整个... 详细信息

研究背景:巨噬细胞和血管平滑肌细胞吞噬脂质(特别是氧化低密度脂蛋白oxidized Low-density Lipoprotein, ox-LDL)形成泡沫细胞(Foam Cell)是动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)病理过程的中心环节,贯穿在早期脂纹形成到斑块破裂的整个过程。多种细胞因子可调节泡沫细胞的形成。白介素-34 (Interleukin-34,IL-34)是2008年发现的一种新细胞因子,与类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)、溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis,UC)等多种慢性免疫性炎症疾病患者有明显相关性,被认为是一种致炎因子。近来研究发现其在冠状动脉粥样硬化患者血清水平中高表达,且与冠脉病变严重程度呈正相关性。研究目的:IL-34在冠状动脉粥样硬化性心脏病等慢性炎症疾病患者血清水平中高表达,提示其可能是一种致炎因子,而IL-34是否影响泡沫细胞的形成还未见报道,因此探究IL-34对泡沫细胞形成的影响及探究其可能的机制,为进一步阐明动脉粥样硬化病理过程可能的机制、寻找新的临床治疗靶点提供重要线索。研究方法与结果:1. 本研究首先利用ox-LDL诱导原代小鼠骨髓源性巨噬细胞(Bone Marrow-derived Macrophages, BMDMs),建立体外巨噬细胞源性泡沫细胞模型。将细胞分为对照组、oxLDL组(40 μg/ml)、低剂量组(oxLDL40 μg/ml +IL-34 20 ng/ml)、高剂量组(oxLDL40 ug/ml+IL-34 50 ng/ml)。油红O染色及测定细胞内胆固醇含量,观察每组泡沫细胞形成情况,结果显示高剂量组(IL-34 50 ng/ml)泡沫细胞形成明显加重,而低剂量组(IL-34 20ng/ml)与oxLDL组相比未见明显变化,提示IL-34 50ng/ml可以促进泡沫细胞的形成。因此,接下来我们的实验均基于IL-34 50 ng/ml探究其对泡沫细胞形成的影响。2. 泡沫细胞的形成是脂质摄取与流出的动态平衡受损。为探究IL-34是通过影响巨噬细胞哪个过程促进泡沫细胞的形成,我们分别检测了巨噬细胞脂质摄取及胆固醇流出过程,结果表明:IL-34增加巨噬细胞脂质的摄取(差异有统计学意义),而不影响胆固醇的流出过程。3. 巨噬细胞主要通过细胞表面的清道夫受体摄取脂质。利用western blot技术、RT-PCR技术分别检测四组细胞清道夫受体CD36、SR-A、Lox-1的蛋白、mRNA表达水平,结果提示只有CD36的表达显著上调(有统计学差异)。利用特异性抗体阻断CD36受体,IL-34诱导不能增加巨噬细胞脂质的摄取。结果提示:IL-34是通过上调巨噬细胞清道夫受体CD36的表达而增加脂质的摄取。另外,IL-34能够使增加oxLDL诱导的细胞炎症因子IL-6、TNF-α、IL-1β分泌,炎症反应的加重可能与脂质摄取过程协同加重泡沫细胞的形成。4. 为研究IL-34调节巨噬细胞脂质摄取过程的下游信号转导通路,我们利用蛋白电泳技术测定了 NF-κB、MAPK信号通路相关分子的表达,结果提示IL-34影响p38的表达。利用特异性阻断剂阻断p38途径后,IL-34诱导的脂质摄取过程也相应的被阻断。研究结论:IL-34(50 ng/ml)可以通过上调CD36的表达而增加巨噬细胞脂质的摄取,继而加重泡沫细胞的形成,这一过程可能是通过p38途径实现的。

关键词： interleukin-34 巨噬细胞泡沫细胞 CD36 oxLDL

人胆固醇酯水解酶对泡沫细胞的影响及相关机制的研究

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中国医科大学学报 2014年第9期43卷 773-776页

作者：关宁王超霍晓川顾立学罗俊生辽宁医学院附属第一医院神经外科辽宁锦州121001

目的探讨人胆固醇酯水解酶（hCEH）表达对泡沫细胞的影响及相关机制。方法利用含hCEH的慢病毒转染RAW264．7小鼠单核巨噬细胞，转染成功后巨噬细胞泡沫化。油红O染色和高效液相色谱分析hCEH对细胞内脂滴堆积情况及游离胆固醇含量变化的... 详细信息

目的探讨人胆固醇酯水解酶（hCEH）表达对泡沫细胞的影响及相关机制。方法利用含hCEH的慢病毒转染RAW264．7小鼠单核巨噬细胞，转染成功后巨噬细胞泡沫化。油红O染色和高效液相色谱分析hCEH对细胞内脂滴堆积情况及游离胆固醇含量变化的影响；Western blot检测ATP结合盒转运蛋白A1（ABCA1）、ATP结合盒转运蛋白G1（ABCG1）的表达情况。结果转染72h后，荧光细胞数量最多，接近50％，hCEH在细胞内大量表达；随着时间的延长，油红O染色阳性细胞数逐渐减少，细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量逐渐下降；Western blot显示在0～8h，ABCA1和ABCG1表达逐渐增加，8h达高峰，以后逐渐减少。结论hCEH表达可以促进巨噬细胞表面ABCA1、ABCG1的表达，并且ABCA1、ABCG1之间存在一定的协同性，从而有效增加了游离胆固醇外流、减少胆固醇酯在细胞内聚积，抑制泡沫细胞形成。

关键词：人胆固醇酯水解酶 ATP结合盒转运蛋白A1 ATP结合盒转运蛋白G1 游离胆固醇泡沫细胞

PPARγ激动剂对RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量及ABCG1、LXRα表达的影响

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PPARγ激动剂对RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量及...

作者：赵婷婷山西医科大学

学位级别：硕士

目的:通过体外培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,诱导分化建立泡沫细胞模型,然后测定PPARγ激动剂盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride,PG）对泡沫细胞内胆固醇含量及ABCG1、LXRα表达的影响,旨在初步探究PG对泡沫细胞内胆固醇含量的调... 详细信息

目的:通过体外培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,诱导分化建立泡沫细胞模型,然后测定PPARγ激动剂盐酸吡格列酮（pioglitazone hydrochloride,PG）对泡沫细胞内胆固醇含量及ABCG1、LXRα表达的影响,旨在初步探究PG对泡沫细胞内胆固醇含量的调控机制。方法:1.体外培养RAW264.7小鼠巨噬细胞,再用50mg/L ox-LDL孵育48h,最后以油红O染色并在光镜下观察细胞形态及变化。2.以不同浓度的PG（对照组0μmol/L、实验组5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L）作用泡沫细胞24h后,酶比色法测定泡沫细胞内胆固醇酯（Cholesterol Ester,CE）的含量;以30μmol/L的PG作用泡沫细胞不同时间（对照组Oh、实验组6h、12h、24h、48h）后,酶比色法测定泡沫细胞内CE的含量。3.将诱导分化好的RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞,给予不同浓度的PG（对照组0μmol/L、实验组5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L）作用24h后,RT-PCR和Western blot分别测定ABCG1、LXRα的基因及蛋白表达水平。结果:（1）体外培养的RAW264.7小鼠巨噬细胞半贴壁生长,主要呈类圆形和不规则多边形,细胞体积较小,含1-2个核,有伪足伸出,经50mg/L ox-LDL孵育48h后,细胞体积显著变大,油红O染色胞质内可见大量红染脂滴。（2）与对照组相比,不同浓度的PG干预RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞24h后,细胞内的CE含量均显著减少,差异有统计学意义（P＜0.01）;与对照组相比,30μmol/LPG作用RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞0h、6h、12h、24h、48h后,细胞内的CE含量均显著减少,差异有统计学意义（P＜0.01）。（3）与对照组相比,不同浓度PG组巨噬细胞ABCG1、LXRα的m RNA及蛋白的水平呈浓度依赖性增高,差异有统计学意义（P＜0.01）。结论:1.PPARγ激动剂可减少RAW264.7小鼠巨噬细胞源性泡沫细胞内胆固醇含量,并呈浓度和时间依赖性。2.PPARγ激动剂可呈浓度依赖性增加小鼠RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞内ABCG1、LXRα的m RNA及蛋白表达。3.PPARγ激动剂减少泡沫细胞内胆固醇酯的含量可能是通过上调ABCG1、LXRα的表达来实现的,此机制介导的胆固醇流出将成为改善AS的主要途径之一。

关键词：吡格列酮过氧化物酶受体γ激动剂泡沫细胞胆固醇含量肝X受体α 三磷酸腺苷转运体G1

脂肪分化相关蛋白在巨噬细胞和泡沫细胞中的表达

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细胞与分子免疫学杂志 2009年第4期25卷 309-311页

作者：宋越李航张丽英叶菁李青第四军医大学基础部病理学与病理生理学教研室陕西西安710032

目的:观察脂肪分化相关蛋白(ADRP)在单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞分化过程中的表达变化。方法:体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞和泡沫细胞,应用RealtimeRT-PCR和Western blot测定ADRP在基因水平和蛋白水平的表达。结果:单核细胞... 详细信息

目的:观察脂肪分化相关蛋白(ADRP)在单核细胞向巨噬细胞和泡沫细胞分化过程中的表达变化。方法:体外诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞和泡沫细胞,应用RealtimeRT-PCR和Western blot测定ADRP在基因水平和蛋白水平的表达。结果:单核细胞分化为巨噬细胞时ADRP的表达水平无明显变化,当进一步分化为泡沫细胞时,ADRP的mR-NA和蛋白表达水平均显著增加。结论:单核细胞向巨噬细胞分化时对ADRP的表达无影响,而由巨噬细胞进一步向泡沫细胞分化时ADRP的表达升高。

关键词：脂肪分化相关蛋白脂滴巨噬细胞泡沫细胞动脉粥样硬化

羧甲基赖氨酸对RAW264.7源性泡沫细胞迁移的影响

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中华老年心脑血管病杂志 2013年第9期15卷 969-972页

作者：李丽华严金川王中群徐洪增袁伟梁仪江苏大学附属医院病理科镇江212001 江苏大学附属医院心内科镇江212001 东南大学附属中大医院心内科

目的探讨糖基化终末产物关键活性成分羧甲基赖氨酸(CML)对泡沫细胞迁移能力的影响。方法 RAW264.7单核巨噬细胞制备成荷脂细胞后,分为对照组、氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)组和干预组(CML+oxLDL孵育)。采用Boyden小室细胞迁移实验体外观... 详细信息

目的探讨糖基化终末产物关键活性成分羧甲基赖氨酸(CML)对泡沫细胞迁移能力的影响。方法 RAW264.7单核巨噬细胞制备成荷脂细胞后,分为对照组、氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)组和干预组(CML+oxLDL孵育)。采用Boyden小室细胞迁移实验体外观察泡沫细胞跨膜迁移能力,胆固醇氧化酶法检测细胞内游离胆固醇(FC)、胆固醇酯(CE)及总胆固醇(TC)的含量;RT-PCR和Western blot法检测清道夫受体CD36表达的变化。结果与oxLDL组比较,干预组细胞内FC、CE和TC持续增多(P泡沫细胞荧光强度下调59.79%(P泡沫细胞荧光强度下调73.46%(P泡沫细胞迁移。

关键词：泡沫细胞巨噬细胞细胞运动脂蛋白类,LDL 受体,清道夫动脉粥样硬化

银杏叶提取物对U937泡沫细胞IL-1β、TNF-α及IL-10表达的影响(英文)

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药学学报 2007年第9期42卷 930-934页

作者：焦亚斌芮耀诚杨鹏远李铁军邱彦第二军医大学药学院药理学教研室上海200433

本研究考察了氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激的U937细胞致炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)及其受体(IL-10R)的蛋白及mRNA的表达,同时观察银杏叶提取物(GbE)对它们的作用。U93... 详细信息

本研究考察了氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)刺激的U937细胞致炎细胞因子白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、抗炎细胞因子白细胞介素10(IL-10)及其受体(IL-10R)的蛋白及mRNA的表达,同时观察银杏叶提取物(GbE)对它们的作用。U937细胞用100 mg.L-1ox-LDL刺激24 h形成泡沫细胞,同时分别加入不同浓度的GbE(0.1,1及10μg.L-1)共孵育,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)及逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测IL-1β、TNFα-、IL-10和IL-10R的蛋白或mRNA表达。U937泡沫细胞组IL-1β、TNF-α、IL-10和IL-10R的蛋白或mRNA的表达较对照组显著增加(P泡沫细胞组相比差异显著(P泡沫细胞致炎细胞因子IL-1β及TNF-α表达的显著抑制作用,对抗炎细胞因子IL-10及其受体IL-10R表达的显著上调作用可能是其抗atherosclerosis(AS)的机制之一。

关键词： U937细胞泡沫细胞细胞因子白细胞介素1 肿瘤坏死因子α 白细胞介素10 银杏

STAT4基因敲除通过miR-9促进泡沫细胞形成及动脉粥样硬化

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中国动脉硬化杂志 2020年第5期28卷 410-420页

作者：许莉莉丁素玲张伟伟朱小伟朱宝玲邹云增杨向东葛均波上海市心血管病研究所复旦大学附属中山医院心内科上海市200032

目的探究动脉粥样硬化斑块发生发展过程中信号转导与转录激活因子4(STAT4)信号通路在巨噬细胞分化及泡沫细胞形成中的作用及调控机制。方法将STAT4基因敲除(STAT4-/-)小鼠与载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠进行杂交,筛选出ApoE/STAT4纯... 详细信息

目的探究动脉粥样硬化斑块发生发展过程中信号转导与转录激活因子4(STAT4)信号通路在巨噬细胞分化及泡沫细胞形成中的作用及调控机制。方法将STAT4基因敲除(STAT4-/-)小鼠与载脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)小鼠进行杂交,筛选出ApoE/STAT4纯合子双基因敲除(DKO)小鼠,研究新型动脉粥样硬化相关小鼠模型的易感性和机制。将3月龄小鼠分为野生型(WT)、STAT4-/-、ApoE-/-、DKO共4组,经过12周高脂胆固醇饮食喂养,分别采用油红O染色及石蜡切片HE/Masson染色检测主动脉斑块形成情况。采用流式细胞术分析小鼠外周血、骨髓及脾脏髓系细胞各亚群比例。从小鼠骨髓分离CD11b+髓系细胞进行体外培养,采用巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)进行诱导,流式分析巨噬细胞不同亚型分化情况。采用实时定量聚合酶链反应(PCR)及Western blot分别检测基因表达水平及蛋白水平。结果ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块局部的CD11b+细胞中可检测到STAT4表达。ApoE-/-及DKO小鼠经12周高脂喂养,油红O染色阳性的主动脉斑块主要分布在主动脉根部至髂动脉分叉处,DKO小鼠的斑块较ApoE-/-小鼠明显增多;HE及Masson染色显示DKO小鼠的主动脉斑块较ApoE-/-小鼠具有更薄的纤维帽及更大的脂质核心,且斑块中的纤维更稀疏,排列也相对更紊乱。体外细胞实验显示STAT4基因敲除可促进CD11b+Gr-1+未成熟髓系细胞的异常动员、巨噬细胞的M1极化以及泡沫化。STAT4基因缺失通过磷酸肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)/核因子κB(NF-κB)通路下调miR-9的表达,上调酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT-1)表达,进而促进巨噬细胞的脂质蓄积及泡沫细胞形成,最终加速动脉粥样硬化斑块的发生发展。结论STAT4通过调控免疫炎症反应及脂质代谢,在巨噬细胞分化及泡沫细胞形成过程中发挥关键作用。STAT4相关信号通路可作为未来动脉粥样硬化性疾病的潜在治疗靶点。

关键词：动脉粥样硬化巨噬细胞泡沫细胞 STAT4通路

EZH2在Hcy致泡沫细胞胆固醇聚集中的作用

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实用医学杂志 2017年第19期33卷 3176-3180页

作者：郝银菊丁宁李淑强徐灵博李南姜怡邓杨晓玲宁夏医科大学药学院药理学系/宁夏医科大学基础医学院心脑血管疾病基础研究重点实验室银川市750004

目的研究Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在同型半胱氨酸(Hcy)致泡沫细胞胆固醇聚集中的作用。方法将THP-1源性泡沫细胞分为对照组、100μmol/L Hcy组和叶酸组,油红O检测细胞内脂滴聚集;酶法检测细胞内TC和TG含量;Western-blot检测H3K27me... 详细信息

目的研究Zeste基因增强子同源物2(EZH2)在同型半胱氨酸(Hcy)致泡沫细胞胆固醇聚集中的作用。方法将THP-1源性泡沫细胞分为对照组、100μmol/L Hcy组和叶酸组,油红O检测细胞内脂滴聚集;酶法检测细胞内TC和TG含量;Western-blot检测H3K27me3水平;q-PCR和Western-blot检测EZH2表达;分别将EZH2过表达和干扰后检测泡沫细胞H3K27水平及TG和TC含量。结果 Hcy干预后,细胞内TC和TG含量显著增加(P细胞TC和TG含量增多(P泡沫细胞胆固醇聚集的重要机制。

关键词： EZH2 同型半胱氨酸泡沫细胞胆固醇

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泡沫细胞靶标蛋白的适配子筛选

泡沫细胞靶标蛋白的适配子筛选

作者：张慧南华大学

学位级别：硕士

目的:运用SELEX技术筛选出与泡沫细胞特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找泡沫细胞特异性蛋白质,为动脉粥样硬化的早期体内诊断和治疗确立靶标。方法:体外合成随机单链DNA文库,通过反复筛选、富集,得到与THP-1巨噬细胞源性的泡沫... 详细信息

目的:运用SELEX技术筛选出与泡沫细胞特异性结合的寡核苷酸适配子,寻找泡沫细胞特异性蛋白质,为动脉粥样硬化的早期体内诊断和治疗确立靶标。方法:体外合成随机单链DNA文库,通过反复筛选、富集,得到与THP-1巨噬细胞源性的泡沫细胞特异性结合的单链寡核苷酸适配子。将体外合成的适配子与不同细胞来源的泡沫细胞及脂肪肝、脂肪和动脉组织进行特异性结合实验。通过油红O染色和HPLC检测细胞内荷脂情况,运用荧光显微镜观察适配子结合的特异性。用终浓度为100nmol/L的PMA诱导THP-1细胞72小时,使其分化成巨噬细胞,再用80mg/Lox-LDL共孵育72小时,诱导成泡沫细胞。将泡沫细胞与生物素标记的适配子共孵育40分钟,裂解细胞,利用生物素链霉亲和素磁珠分离得到结合适配子的泡沫细胞蛋白,经1D-SDS-PAGE（一维聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离、LC-ESI-TRAP（液相色谱-电喷雾离子阱质谱）串联质谱鉴定,分析。通过蛋白质免疫印迹方法,验证蛋白质在泡沫细胞中表达的特异性。结果:运用SELEX技术平台筛选得到了与巨噬细胞源性的泡沫细胞特异结合的23号适配子,为长81nt,5’端标记生物素的单链寡核苷酸。ox-LDL诱导的THP-1细胞、平滑肌细胞、RAW264.7细胞,经油红O染色和HPLC验证细胞泡沫化程度;荧光检测结果显示:23号适配子仅与THP-1细胞源性、RAW264.7细胞源性的泡沫细胞及有粥样硬化病变斑块的主动脉有特异性结合,和平滑肌细胞、平滑肌源性的泡沫细胞及脂肪肝、脂肪组织不结合。生物素-链霉亲和素系统提取THP-1细胞源性的泡沫细胞蛋白,1D-SDS-PAGE分离蛋白质,分别经银染和R-250考马斯亮蓝染色后,显示有三个蛋白组分,这三个蛋白组分分别经串联质谱检测得到部分序列信息,使用Mascot软件搜寻NCBInr数据库。共有包括Vimentin（波形蛋白）在内的12种蛋白得到鉴定,且得分均不低于域值42。经比对和分析,挑选出靶蛋白2和波形蛋白,经WESTERN-BLOTTING实验检测发现,靶蛋白2在ox-LDL诱导的THP-1泡沫细胞高表达,而在未处理的THP-1巨噬细胞中无表达;波形蛋白在未用ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞有少量表达,ox-LDL处理后蛋白显著增加。结论: 1.证明本研究采用的SELEX技术平台筛选出的适配子（23号适配子,为长81nt,5’端标记生物素/FITC的单链寡核苷酸）具有巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变结合的特异性。 2.利用适配子特异性结合蛋白的特性,通过生物素链霉亲和素磁珠分离、串联质谱鉴定,分析,得到泡沫细胞候选靶标蛋白12个。 3.初步鉴定出候选靶标2号具有THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞的特异性,可能成为动脉粥样硬化的早期体内诊断和治疗的新靶标。

关键词：动脉粥样硬化适配子泡沫细胞生物素-链霉亲和素蛋白质谱