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食品科学 2019年第11期40卷 139-145页

作者：何萍萍韦敬柳乙姜泽东朱艳冰倪辉李清彪集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用与深加工重点实验室福建厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

目的:对从泡叶藻(Ascophyllum nodosum)中提取的泡叶藻聚糖进行化学法降解,将得到的低分子质量降解产物进行分离纯化,分析其基本组成特征和体外免疫诱导活性,为泡叶藻聚糖或其他海藻多糖的生物活性和基本结构特征研究提供参考。方法:通... 详细信息

目的:对从泡叶藻(Ascophyllum nodosum)中提取的泡叶藻聚糖进行化学法降解,将得到的低分子质量降解产物进行分离纯化,分析其基本组成特征和体外免疫诱导活性,为泡叶藻聚糖或其他海藻多糖的生物活性和基本结构特征研究提供参考。方法:通过酸水解法和双氧水氧化降解法制备泡叶藻聚糖低分子质量降解片段,利用超滤法和Sephadex G-50凝胶柱层析分离纯化得到4个泡叶藻聚糖低分子质量片段:HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1、H2O2-F2;采用对氨基苯甲酸乙酯柱前衍生样品后进行高效液相色谱及化学方法分析其单糖组成和化学组成;采用高效分子排阻色谱法测定其重均分子质量;通过小鼠巨噬细胞RAW264.7模型分析HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1、H2O2-F2的体外免疫诱导活性。结果:泡叶藻聚糖低分子质量片段的组成特征表明HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1、H2O2-F2均为杂多糖,且单糖组成存在较大差异,其重均分子质量分别为4.80、4.20、5.30、2.30 kDa。免疫活性分析细胞模型结果表明,HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F2在所测定质量浓度范围(0~200μg/mL)内能明显诱导RAW264.7细胞活化,释放NO和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α),而H2O2-F1诱导RAW264.7细胞释放NO和TNF-α的活性明显低于HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2。结论:泡叶藻聚糖低分子质量降解片段(HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2)具有明显的免疫诱导活性,其中HCl-F1和H2O2-F2的免疫诱导活性明显高于泡叶藻聚糖。结合其化学组成分析的结果,提示泡叶藻聚糖低分子质量降解片段的免疫诱导活性是由单糖组成和硫酸根质量分数共同决定的。

关键词：泡叶藻聚糖低分子质量降解片段分离纯化化学组成体外免疫诱导活性

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响应面法优化纤维素酶辅助从泡叶藻中提取泡叶藻聚糖的工艺

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过程工程学报 2018年第3期18卷 632-638页

作者：鲍青云韦敬柳乙姜泽东余刚黄高凌朱艳冰肖安风倪辉李清彪集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 厦门南方海洋研究中心海藻资源化利用与深加工重点实验室福建厦门361021 厦门市食品与生物工程技术研究中心福建厦门361021

通过单因素实验研究纤维素酶辅助提取泡叶藻聚糖时液料比、酶添加量、酶解温度、酶解时间等关键因素对泡叶藻聚糖提取率的影响,并进一步采用Box-Behnken实验设计和响应面分析法优化其工艺参数.结果表明,纤维素酶辅助提取泡叶藻聚糖的优... 详细信息

通过单因素实验研究纤维素酶辅助提取泡叶藻聚糖时液料比、酶添加量、酶解温度、酶解时间等关键因素对泡叶藻聚糖提取率的影响,并进一步采用Box-Behnken实验设计和响应面分析法优化其工艺参数.结果表明,纤维素酶辅助提取泡叶藻聚糖的优化工艺条件为液料比30 mL/g、酶浓度200 IU/mL、酶解时间2.0 h、酶解温度50℃,该条件下多糖提取率为14.65%±0.73%,与模型预测值14.75%非常接近,采用响应面法对泡叶藻聚糖提取条件进行优化合理可行.

关键词：纤维素酶辅助提取泡叶藻聚糖工艺优化响应面法

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泡叶藻聚糖及其低分子量聚糖抑制肝癌转移活性研究

泡叶藻聚糖及其低分子量聚糖抑制肝癌转移活性研究

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作者：詹慧集美大学

学位级别：硕士

本研究从泡叶藻（Ascophyllum nodosum）中提取泡叶藻聚糖（Ascophyllan,分子量390k Da）并通过褐藻胶裂解酶酶解获得低分子量泡叶藻聚糖（LMWAs-L,分子量6.9 k Da）。首先,利用Hep G2细胞和Huh-7细胞模型分析Ascophyllan和LMWAs-L抑制... 详细信息

本研究从泡叶藻（Ascophyllum nodosum）中提取泡叶藻聚糖（Ascophyllan,分子量390k Da）并通过褐藻胶裂解酶酶解获得低分子量泡叶藻聚糖（LMWAs-L,分子量6.9 k Da）。首先,利用Hep G2细胞和Huh-7细胞模型分析Ascophyllan和LMWAs-L抑制肝癌转移的活性。其次,利用Caco-2模型分析Ascophyllan和LMWAs-L经Caco-2细胞单层转运的效率。在细胞水平的研究基础上,进一步建立C57BL/6小鼠荷瘤模型分析Ascophyllan和LMWAs-L体内抗肿瘤的活力。然后,应用代谢组学的方法深度挖掘Ascophyllan和LMWAsL调控Huh-7细胞代谢的信息、探究抗肝癌转移活性的机制。主要研究结果如下:（1）Ascophyllan对肝癌细胞有毒性作用,但LMWAs-L对肝癌细胞无直接毒性。Ascophyllan和LMWAs-L通过抑制MAPK的信号传导抑制上皮-间质转化、从而抑制肿瘤细胞黏附、迁移、浸润;在这一过程中E-Cadherin表达上调,N-Cadherin、MMP1、MMP2和MMP9表达下调。（2）Ascophyllan和LMWAs-L均可经肠上皮细胞吸收转运,Ascophyllan较难吸收,LMWAs-L易穿过Caco-2细胞单层膜,吸收良好。（3）Ascophyllan和LMWAsL激活小鼠免疫系统,增强机体免疫力,抑制体内异种移植瘤的发生和生长。（4）Ascophyllan和LMWAs-L调控肝癌细胞代谢发挥抗肿瘤活性,包括逆转Warburg效应,使癌细胞获取能量的方式从糖酵解转变为TCA循环和糖异生,以及降低肝癌细胞中乳酸、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸等含量,调控氨基酸代谢和氨酰t RNA生物合成等。（5）在细胞和动物实验中,LMWAs-L表现出比Ascophyllan更强的抗肿瘤活性,这是由二者不同的细胞学机制导致的。代谢组学结果发现LMWAs-L抑制肿瘤转移与HIF-1α信号通路显著相关,而Ascophyllan不影响HIF-1α信号通路。（6）LMWAs-L通过ERK1/2、PI3K/AKT/m TOR、IL-6/STAT3信号轴抑制HIF-1α表达,上调抗坏血酸含量促进PHD酶作用,降解HIF-1α,抑制肿瘤的转移。结论:Ascophyllan和LMWAs-L通过抑制MAPK信号通路的活化、激活宿主免疫系统并调控肿瘤细胞代谢来抑制肝癌的发生和转移。此外,与Ascophyllan相比,LMWAs-L具有更显著的抗肿瘤活性和易经口服吸收利用特征,且LMWAs-L通过抑制HIF-1α信号通路发挥抗肝癌转移活性。

关键词：泡叶藻聚糖低分子量泡叶藻聚糖抑制肝癌转移代谢组学 MAPK信号通路

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泡叶藻聚糖提取、脱色及强免疫刺激活性低分子量降解片段制备的研究

泡叶藻聚糖提取、脱色及强免疫刺激活性低分子量降解片段制备的研...

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作者：韦敬柳乙集美大学

学位级别：硕士

本文以泡叶藻为原料,主要对泡叶藻聚糖的提取、脱色、分离纯化、降解、低分子量降解片段的免疫刺激活性及结构组成进行研究。首先,本论文通过纤维素酶辅助提取法对泡叶藻聚糖的提取工艺进行了研究。以液料比、酶浓度、酶解时间、酶解温... 详细信息

本文以泡叶藻为原料,主要对泡叶藻聚糖的提取、脱色、分离纯化、降解、低分子量降解片段的免疫刺激活性及结构组成进行研究。首先,本论文通过纤维素酶辅助提取法对泡叶藻聚糖的提取工艺进行了研究。以液料比、酶浓度、酶解时间、酶解温度进行单因素试验,以泡叶藻聚糖提取率为响应值,通过响应面分析,确定纤维素酶辅助提取法的最佳提取工艺为:液料比30:1、酶浓度200 U/m L、酶解时间2 h、酶解温度50℃。在此条件下泡叶藻聚糖提取率为14.65±0.21%,与理论值相对误差0.68%,说明与模型预测值相符。与传统的热水浸提法相比,其提取率提高了62.06%。其次,本论文通过比较活性炭吸附、有机溶剂萃取、大孔树脂吸附、HO氧化等不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色的影响,选取最优的HO氧化法,并进一步以脱色时间、脱色温度、HO浓度和脱色p H值进行单因素试验,采用L(3)正交设计进行试验,以泡叶藻聚糖的白度值和多糖保留率为指标,并分析经各优化工艺脱色后的泡叶藻聚糖对诱导小鼠吞噬细胞产生一氧化氮活性。确定HO氧化法脱除泡叶藻聚糖色素最佳工艺条件为:HO浓度为8.6%、脱色时间4 h、脱色温度80℃、p H 11.0,泡叶藻聚糖白度达到61.05±1.12%,其白度值提高了4.1倍,多糖保留率为90.02±0.03%。接着,本论文采用三氧化硫-吡啶法对泡叶藻聚糖(NA)进行硫酸化修饰,旨在改善其免疫刺激活性,结果发现,经硫酸化修饰后的泡叶藻聚糖(MA)的硫酸根含量虽然提高,但其不能增强免疫刺激活性。进一步以Na Cl溶液作为梯度洗脱液,采用阴离子纤维素交换层析柱分别对MA、NA进行分级分离,对获得6种组分进行体外免疫刺激活性的研究。结果发现,这6种组分都能明显诱导小鼠巨噬细胞放出NO。为进一步解释抑制NA免疫刺激活性现象,使用EDTA螯合剂处理NA获得NA-EDTA。结果显示,NA-EDTA能够诱导RAW264.7细胞放出NO,表明NA中可能存在金属离子如Fe、Zn等与泡叶藻聚糖结合从而影响其免疫刺激活性。最后,本论文分别采用酸水解法和自由基氧化降解法制备低分子量泡叶藻聚糖。酸法以盐酸浓度、降解时间和降解温度为试验因素,氧化法以双氧水浓度、降解时间和降解温度为试验因素,对低分子量降解片段制备分别进行单因素试验研究,选取三种最佳酸法降解体系和三种最佳氧化法降解体系制备低分子量泡叶藻聚糖,并利用凝胶柱分别对这六种低分子量聚糖进行纯化,获得分子量在1000-10000 Da范围的四种分级组分并对它们进行体外免疫刺激活性和基本结构的研究,发现这四种低分子量多糖的免疫刺激活性强弱由单糖、硫酸根及糖醛酸共同构成一定构象决定的。

关键词：泡叶藻聚糖工艺优化降解分离纯化螯合剂免疫刺激活性结构特征

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泡叶藻聚糖脱色工艺的研究

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集美大学学报（自然科学版） 2017年第6期22卷 24-33页

作者：韦敬柳乙陈艳红杜希萍倪辉朱艳冰肖安风蔡慧农姜泽东集美大学食品与生物工程学院福建厦门361021 厦门南方海洋研究中心经济海藻资源化利用重点实验室福建厦门361021 福建省食品微生物与酶工程重点实验室福建厦门361021 厦门市食品生物工程技术研究中心福建厦门361021

为了选取最优的脱色工艺以脱除泡叶藻(Ascophyllum nodosum)聚糖发色基团或物质,通过比较活性炭吸附、有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和四氢呋喃)萃取、大孔树脂(D101、D101-1、DM130)吸附、H_2O_2氧化等不同脱色方法对泡叶藻聚糖... 详细信息

为了选取最优的脱色工艺以脱除泡叶藻(Ascophyllum nodosum)聚糖发色基团或物质,通过比较活性炭吸附、有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮和四氢呋喃)萃取、大孔树脂(D101、D101-1、DM130)吸附、H_2O_2氧化等不同脱色方法对泡叶藻聚糖脱色效果的影响,研究结果表明,H_2O_2氧化法优于大孔树脂吸附法、活性炭吸附法和有机溶剂萃取法。进一步以脱色时间、脱色温度、H_2O_2质量分数和脱色pH值为因素,进行单因素试验确定关键影响因素及其水平,并采用L9(34)正交设计进行试验,以泡叶藻聚糖的白度值和脱色后聚糖保留率为指标,并分析脱色后的泡叶藻聚糖对诱导小鼠吞噬细胞RAW264.7生成一氧化氮活性的影响,筛选出具有较好保留泡叶藻聚糖免疫诱导潜力的H_2O_2氧化法的脱色工艺条件。结果表明,H_2O_2氧化法脱除泡叶藻聚糖发色基团或物质最佳工艺条件为:H_2O_2质量分数8.6%,脱色时间4.0 h,脱色温度60℃,pH值11.0,泡叶藻聚糖白度值达到(61.05±1.12)%,提高了4.1倍,聚糖保留率为(90.02±0.03)%。

关键词：泡叶藻聚糖脱色工艺优化白度值保留率活性

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酶法制备泡叶藻聚糖具免疫诱导活性低分子量多糖的研究

酶法制备泡叶藻聚糖具免疫诱导活性低分子量多糖的研究

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作者：鲍青云集美大学

学位级别：硕士

泡叶藻含有丰富的有机营养物质及矿质营养元素,其中泡叶藻聚糖占13%。泡叶藻聚糖是具有强免疫诱导活性、抗氧化等活性并在功能性食品及医药领域有着重要的开发应用价值的天然高分子活性物质。泡叶藻聚糖具有较大的分子量(约为390 kDa),... 详细信息

泡叶藻含有丰富的有机营养物质及矿质营养元素,其中泡叶藻聚糖占13%。泡叶藻聚糖是具有强免疫诱导活性、抗氧化等活性并在功能性食品及医药领域有着重要的开发应用价值的天然高分子活性物质。泡叶藻聚糖具有较大的分子量(约为390 kDa),这一特点限制了泡叶藻聚糖活性以及结构解析的进一步研究。将泡叶藻聚糖降解为低分子量多糖不仅可以提高泡叶藻聚糖的利用率,还能为泡叶藻聚糖具体结构的解析奠定基础,因此本文以泡叶藻为原料,酶法对泡叶藻聚糖进行水解,对制备得到的泡叶藻聚糖低分子量降解片段进行免疫诱导活性及基本组成分析;最后对得率和活性较好的酶解片段的结构及酶解工艺进一步研究。主要研究结果如下:1.通过单因素实验对褐藻胶裂解酶、纤维素酶、木聚糖酶3种酶酶解泡叶藻聚糖降解工艺进行优化。泡叶藻聚糖的酶解产物通过Sephadex G-75层析柱分离纯化制备得到As-A,As-C和As-X。褐藻胶裂解酶制备As-A的最佳工艺条件为:酶浓度0.024 U/mL、pH 6.5、酶解温度40℃,得率为8.63±0.17%;纤维素酶制备As-C的最佳工艺条件为:酶浓度5.0 U/mL、pH 5.0、酶解温度55℃,得率为3.26±0.09%;木聚糖酶制备As-X的最佳工艺条件为:酶浓度15.0× 103 U/mL、pH6.0、酶解温度60℃,得率为1.78±0.27%。2.以小鼠巨噬细胞RAW264.7为体外细胞模型,研究泡叶藻聚糖低分子量降解片段对其免疫诱导活性的影响,实验结果表明,As-A和As-C在诱导RAW264.7细胞释放NO、TNF-α能力在多糖浓度为6.25～200 μg/mL范围内呈现浓度依赖性,随着多糖浓度的升高而增加。在诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7生成ROS的能力上,As-A和As-C在1～100 μg/mL随着浓度的增大而增强。As-A和As-C的诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7生成ROS的能力在1～100 μg/mL范围内随着浓度的增大而增强。As-X诱导RAW264.7发挥免疫诱导活性的能力较低。3.通过高效液相色谱、离子色谱、红外光谱等方法对As-A,As-C和As-X进行基本结构测定,分析结果表明:As-A的化学组成为木糖(1.00)、甘露糖(1.60)、糖醛酸(1.29)、葡萄糖(0.99)和硫酸根(0.21);As-C的化学组成为木糖(1.00)、甘露糖(0.79)、糖醛酸(1.18)、葡萄糖(0.35)和硫酸根(0.10);As-X化学组成为葡萄糖(1.00)、糖醛酸(0.20)和硫酸根(0.02)。最后通过核磁共振对活性及产率较高的As-A片段进行进一步结构解析,As-A 的主链是β-(1→2)-D-Manp,支链是α-L-Guluronate(古罗糖醛酸),β-D-Mannuronate(甘露糖醛酸),β-D-Glcp,α-D-Xylp。4.通过响应面法对褐藻胶裂解酶降解泡叶藻聚糖的工艺进行了优化,优化工艺条件为:酶浓度为0.02 U/mL,pH为6.8,酶解温度为43℃,优化条件下泡叶藻聚糖酶解液中还原糖浓度为0.284 mg/mL,与实验值的相对误差约为0.71%,表明所建模型合理可靠,拟合程度良好。

关键词：泡叶藻聚糖优化降解分离纯化免疫诱导活性结构解析

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