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泛素e3连接酶TRIM10在心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用及机制

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心肺血管病杂志 2019年第5期38卷 566-572页

作者：刘洋陈东侯翠柳来松杨慧肖雪王筱筱田翠王红霞首都医科大学基础医学院 100069 首都医科大学附属安贞医院-北京市心肺血管疾病研究所病理科大连医科大学附属第一医院

目的:探讨泛素e3连接酶TRIM10在心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用及机制。方法:培养原代的SD大鼠乳鼠心肌细胞,siRNA-TRIM10与Ad-TRIM10转染细胞48 h,再加入缺血缓冲液复制心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型(缺氧30 min,复氧24 h)。转染siR... 详细信息

目的:探讨泛素e3连接酶TRIM10在心肌细胞缺氧/复氧(H/R)损伤中的作用及机制。方法:培养原代的SD大鼠乳鼠心肌细胞,siRNA-TRIM10与Ad-TRIM10转染细胞48 h,再加入缺血缓冲液复制心肌细胞缺氧/复氧(H/R)模型(缺氧30 min,复氧24 h)。转染siRNA-TRIM10敲低其表达的实验分为四组:siRNA-Scramble组(转染空白对照siRNA)、siRNA-TRIM10组(转染siRNA-TRIM10)、H/R+si-Scramble组(转染siRNA-Scramble 48 h,进行H/R处理)和H/R+siRNA-TRIM10组(转染siRNA-TRIM10 48 h,进行H/R处理);转染Ad-TRIM10使其高表达分组同上(Ad-GFP作为对照)。DHe染色观察细胞氧化应激情况;TUNeL染色观察细胞凋亡情况;Western blot检测TRIM10、BAX、p-P38/P38MAPK、p-JNK/JNK及p-eRK/eRK蛋白的表达水平。结果:与Control组相比,H/R组心肌细胞中ROS的产生增加了5.8%、凋亡的发生增加了7.9%、p-JNK和p-P38MAPK蛋白的表达分别增加了21.8%和47.1%(n=5,均P3%、凋亡的发生增加了15.6%、p-JNK和p-P38MAPK蛋白的表达分别增加了26.8%和25.7%(n=5,均Pe3连接酶TRIM10加重心肌细胞缺氧/复氧损伤,其机制可能通过p-JNK/p-P38MAPK途径介导。

关键词：泛素e3连接酶 TRIM10 缺血-再灌注损伤

稻瘟病菌若干假定泛素e3连接酶基因的功能研究

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稻瘟病菌若干假定泛素E3连接酶基因的功能研究

作者：方坤海福建农林大学

学位级别：硕士

泛素化修饰是转录后的修饰方式之一,是蛋白质降解的信号,泛素e3连接酶是泛素化进程中的关键酶之一。泛素e3连接酶与细胞周期调控、肿瘤发生、细胞增殖、细胞凋亡、信号转导、细胞免疫、生长发育、炎症反应以及调控DNA的复制与修复等密... 详细信息

泛素化修饰是转录后的修饰方式之一,是蛋白质降解的信号,泛素e3连接酶是泛素化进程中的关键酶之一。泛素e3连接酶与细胞周期调控、肿瘤发生、细胞增殖、细胞凋亡、信号转导、细胞免疫、生长发育、炎症反应以及调控DNA的复制与修复等密切相关。本研究试图了解稻瘟病菌中泛素e3连接酶家族蛋白的功能。首先,利用稻瘟病菌的基因组数据库和相关的生物信息学软件进行分析,结果表明在稻瘟病菌基因组中预测有11个泛素e3连接酶家族成员,这些e3连接酶家族成员都具有其保守的结构域。然后利用同源重组的原理,构建基因敲除载体,转化原生质体,成功获得了4个基因的敲除突变体。对4个基因的突变体进行表型分析,发现四个基因敲除突变体的菌丝生长速度均减慢,其中Mgg3841.6和Mgg3252.6基因敲除突变体的产孢量均显著下降、孢子萌发有稍微的延迟、附着胞形成严重滞后以及对洋葱的侵染能力下降。观察还发现,Mgg3841.6和Mgg3252.6基因敲除突变体致病性严重减弱。这些结果表明,泛素化降解途径可能参与了稻瘟病菌的营养生长、孢子萌发、附着胞的形成以及致病过程。

关键词：稻瘟病菌泛素e3连接酶同源重组敲除突变体孢子萌发附着胞

G2/M期特异性e3泛素连接酶（G2e3）在宫颈癌中表达及其在Hela细胞中功能的初步研究

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G2/M期特异性E3泛素连接酶（G2E3）在宫颈癌中表达及其在Hela细胞...

作者：王玲慧南方医科大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤严重危害着人类的健康,而宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,它在女性生殖系统肿瘤发病率位居第二,在女性生殖系统肿瘤死亡率位居第五。每年全世界新发病例约有50万,其中约30万的患者因宫颈癌死亡。宫颈癌在中国的发病率排名... 详细信息

恶性肿瘤严重危害着人类的健康,而宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤,它在女性生殖系统肿瘤发病率位居第二,在女性生殖系统肿瘤死亡率位居第五。每年全世界新发病例约有50万,其中约30万的患者因宫颈癌死亡。宫颈癌在中国的发病率排名世界第二位,严重危害着女性健康。目前HPV感染被公认为宫颈癌的必要条件,但并非充分条件。HPV的终身感染率累积可高达60%-70%,但其中仅2-3%的女性最终会发展成为宫颈癌患者。这表明还有其他辅助因素共同参与宫颈癌发病的病理机制。泛素—蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径,参与细胞内80%以上蛋白质的降解,与疾病的发生发展关系密切。泛素—蛋白酶体系统包含多步骤酶聚反应,UPS由泛素、泛素活化酶e1、泛素结合酶e2、泛素连接酶e3、蛋白酶体及其蛋白质底物构成。e3酶通过泛素多聚化,在蛋白酶体降解蛋白的底物特异性中起到决定性的作用。显然若UPS的关键蛋白e3酶出现异常,很有可能导致机体发生疾病,包括癌症的发生发展。目前已知的e3泛素连接酶分成三大类：氨基端泛素连接酶、RING型锌指蛋白和HeCT连接酶。迄今在人类组织细胞中发现了28个HeCTe3连接酶。关于HeCT结构e3连接酶的功能,最新研究显示其可调节包括基因转录和抑癌因子的降解等多种胞内进程。 HeCT结构的e3连接酶是一类单体酶,在心血管疾病(Liddle’s综合症)、神经紊乱(安琪儿综合症),以及一些疾病相关的过程如免疫反应、骨骼平衡和逆转录病毒出芽中起着重要作用,还参与癌症的发生、发展。通过调节(?)IeCTe3酶的活性及其作用底物来探索恶性肿瘤的治疗方法：从底物蛋白中识别抑癌基因,或从癌症家族成员中发现基因突变和表达模式的改变来研究HeCTe3连接酶与癌症之间的关系,从而寻找出专门针对HeCT结构域的特异抑制剂来治疗恶性肿瘤等等,已经成为了目前国际上新的研究方向。 G2e3是一个新的SI(ngle)-HeCT e3酶,基因全长5581个碱基,编码706个氨基酸的蛋白,此蛋白含有一个HeCT结构域及三个PHD结构域。2007年Brooks等首次证实G2e3具有e3酶活性。它只在细胞有丝分裂G2/M期表达,正常时定位于核仁,DNA受损后迅速重新穿过核膜进入细胞质,在发育中的神经系统内表达量较高。G2e3在早期胚胎发育中发挥重要作用,且表达下调引起凋亡增加。G2e3-/-囊泡在发育早期即大量凋亡,Yalan Xing等发现与G2e3具有相同高度保守RING域的pie对于果蝇生殖干细胞的自我更新及分化及早期胚胎发育至关重要。然而对于G2e3的其他生理功能特别是在肿瘤中的作用,均是一片空白。 RNA干扰(RNA interfering,RNAi)现象是在体内的一种利用特异性的序列在转录后沉默基因的过程。如今在实验中采用化学合成法合成的siRNA对目的基因进行干扰的技术已经非常普遍和成熟,因此在本研究中也将采用化学合成siRNA-G2e3作为干扰G2e3表达的处理方法。为了探讨G2e3这个拥有特殊结构域的蛋白与肿瘤的关系,本研究以宫颈癌为研究对象,采用组织化学分析、干扰G2e3干扰等方法,对G2e3在宫颈癌中的表达以及其在Hela细胞中的功能进行研究,阐明G2e3的生理功能,探索G2e3可能参与肿瘤发生、发展过程的调节网络途径。研究方法： 1.通过免疫组化结合组织芯片的方法,分析G2e3在12种器官肿瘤中的表达。 2.采用免疫组化的方法分析36对宫颈癌组织,分析G2e3在宫颈癌及其匹配的癌旁组织中的表达。采用qPCR的方法分析19对宫颈癌组织,分析G2e3mRNA在宫颈癌及其匹配的癌旁组织中的表达。 3.设计了三对干扰G2e3的siRNA序列,分别感染Hela细胞,Real-Time PCR和WB筛选出干扰效率最高的siRNA序列,用于后续实验。 ***8法检测转染后siRNA组,NC组及空转染组Hela细胞增殖的变化,细胞划痕实验检测细胞迁移能力的变化,流式细胞仪检测各组细胞细胞周期及细胞凋亡情况。研究结果： 1.通过对组织芯片分析,研究G2e3在12种器官肿瘤中的表达。结果显示,G2e3在12种人器官组织除乳腺癌中均有表达。G2e3在这12中器官组织细胞中主要表达在细胞质中,呈弥散性或颗粒性表达;部分组织细胞出现膜表达(宫颈癌旁组织和肾癌组织);部分组织细胞出现核表达(胰腺癌旁组织和直肠癌组织),G2e3在其中5种器官肿瘤(结肠、卵巢、宫颈、皮肤和脑组织)中相对癌旁组织表达明显升高,在3种器官肿瘤(前列腺、胃、和肾)中相对癌旁组织表达明显降低,而另外四种器官肿瘤(肺、乳腺、食管和肝)中表达未见明显差异。 2.对36对宫颈癌组织进行免疫组化分析,对19对宫颈癌组织进行

关键词：泛素e3连接酶 G2e3 宫颈癌 Hela细胞增殖迁移细胞周期

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靶向诱导蛋白降解作为药物开发新策略

药学学报 2017年第12期52卷 1777-1782页

作者：尤启冬陆朦辰姜正羽中国药科大学江苏省药物分子设计与成药性优化重点实验室江苏南京210009 中国药科大学药学院药物化学系江苏南京210009

基于机制药物研发的核心问题是寻找和发现可靠的药物靶标。随着基因组学和蛋白质组学的理论及实验技术的快速发展,有不少非酶蛋白被确定为药物靶标。这些非酶蛋白类药物靶标难以用传统的、通过占据活性位点的调控方式来设计和发现疾病... 详细信息

基于机制药物研发的核心问题是寻找和发现可靠的药物靶标。随着基因组学和蛋白质组学的理论及实验技术的快速发展,有不少非酶蛋白被确定为药物靶标。这些非酶蛋白类药物靶标难以用传统的、通过占据活性位点的调控方式来设计和发现疾病治疗药物。近年来,利用人体自身的泛素-蛋白酶体系统靶向诱导目的蛋白降解方法,可实现对众多非酶蛋白的有效抑制,成为创新药物研究的又一新的亮点。该方法通过设计靶向诱导蛋白降解的缀合物,该缀合物含有双功能单元分别识别和结合目的蛋白和泛素e3连接酶,诱导泛素化复合体组装,实现对特定的目的蛋白泛素化,最后诱导目的蛋白降解。这一创新的药物直接调控体内蛋白含量的策略极大拓展了潜在药物靶标的范围,为创新药物研究提供了广阔的新思路。

关键词：泛素e3连接酶蛋白降解靶向诱导蛋白降解缀合物

泛素蛋白酶体途径在癫痫发病机制中的作用研究进展

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中国当代医药 2020年第29期27卷 21-24页

作者：张贺博刘晓亮赵彦艳中国医科大学附属盛京医院临床遗传科辽宁沈阳110001

癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,其特征是由大脑神经元过度放电引起的突发性和复发性发作以及暂时性中枢神经系统功能障碍。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有密切联系。泛素蛋白酶体途径是生物体内蛋白... 详细信息

癫痫是一种常见的慢性神经系统疾病,其特征是由大脑神经元过度放电引起的突发性和复发性发作以及暂时性中枢神经系统功能障碍。近年来研究表明,癫痫的发生与离子通道、神经递质、突触连接等有密切联系。泛素蛋白酶体途径是生物体内蛋白质降解的重要途径,其调控了细胞的许多重要生理过程。泛素化修饰的底物中有很多是影响中枢神经兴奋性的离子通道蛋白,如钠离子通道、钾离子通道等电压门控离子通道,以及AMPA受体、NMDA受体等配体门控离子通道。泛素化修饰通过调控这些通道蛋白表达水平,进一步影响神经元的兴奋性,与癫痫的发生密切相关。

关键词：泛素化泛素e3连接酶癫痫离子通道

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eRα辅调节因子在乳腺癌中的双重调控作用

中国细胞生物学学报 2014年第10期36卷 1437-1442页

作者：许兆伟赵锋伍会健大连理工大学生命科学与技术学院大连116024

在发达国家,乳腺癌一直是威胁女性健康的恶性肿瘤之一。雌激素受体α(estrogen receptor alpha,eRα)是一种配体依赖性的转录因子,其介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭和转移等过程中发挥重要作用。eRα主要依赖于辅调节因... 详细信息

在发达国家,乳腺癌一直是威胁女性健康的恶性肿瘤之一。雌激素受体α(estrogen receptor alpha,eRα)是一种配体依赖性的转录因子,其介导的基因转录调控在乳腺癌的增殖、分化、侵袭和转移等过程中发挥重要作用。eRα主要依赖于辅调节因子共同调控下游靶基因的表达。近年来,有研究证实,一些关键转录辅调节因子在调节eR转录活性的同时,也可以作为泛素e3连接酶,促进eRα的降解。该文详细介绍几种辅调节因子对eRα的双重调节作用,有助于从分子水平阐明不同类型乳腺癌中造成eRα表达量差异的机制,为乳腺癌的靶向治疗和预防提供理论依据。

关键词： eRα 辅调节因子乳腺癌转录调控泛素e3连接酶

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F-box蛋白家族在肿瘤发生中的作用

中国细胞生物学学报 2015年第8期37卷 1180-1186页

作者：杨杨杨李淑晶伍会健大连理工大学生命科学与技术学院大连116024

SCF(Skp1-Cullin1-F-box)复合体是一类泛素e3连接酶,F-box蛋白是构成SCF复合体的亚基之一,在泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中介导SCF复合体特异性的识别底物。SCF复合体通过降解特定底物在多种细胞进程中发挥关... 详细信息

SCF(Skp1-Cullin1-F-box)复合体是一类泛素e3连接酶,F-box蛋白是构成SCF复合体的亚基之一,在泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)中介导SCF复合体特异性的识别底物。SCF复合体通过降解特定底物在多种细胞进程中发挥关键调节作用,如细胞增殖、细胞周期进程、转录和细胞凋亡等。F-box蛋白参与的蛋白降解过程的失调会导致肿瘤的发生,所以可针对F-box蛋白进行癌症药物的设计。该文主要对F-box蛋白家族的结构特征和它们在肿瘤发生中的功能进行了系统阐述,为其将来作为药物靶点应用于癌症临床治疗提供理论基础。

关键词： F-box SCF复合体泛素e3连接酶肿瘤发生

水稻根向重力性调控蛋白OsGLS1的功能验证

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水稻根向重力性调控蛋白OsGLS1的功能验证

作者：周志鹏浙江大学

学位级别：硕士

植物根系对植物锚定、土壤水分和养分的吸收以及正常生理过程都很重要。植物根向重力性是决定根系在土壤中空间分布的主要因素之一。因此,深入研究植物根系向重力性的分子机理及生化网络对指导根系遗传改良具有理论和实践意义。本研究... 详细信息

植物根系对植物锚定、土壤水分和养分的吸收以及正常生理过程都很重要。植物根向重力性是决定根系在土壤中空间分布的主要因素之一。因此,深入研究植物根系向重力性的分子机理及生化网络对指导根系遗传改良具有理论和实践意义。本研究基于水稻根系向重力性缺失突变体glsl,对其蛋白进行功能研究。研究发现,GLS1蛋白在体外具有泛素e3连接酶活性,且仅含RING finger结构域的氨基酸序列即具有连接酶活性。系统进化分析表明,OsGLS1在拟南芥中的同源基因为WAV3。而在控制根系向重力性的WAV3家族中,拟南芥中有三个成员,而在水稻中仅含有GLS1一个成员。进一步将水稻GLS1CDS导入拟南芥wav3突变体发现,转基因T2代阳性苗在一定程度上能回复wav3表型。这表明,GLS1及WAV3在功能上具有一定的相似性。

关键词：水稻向重力性缺失 RING finger结构域泛素e3连接酶

新型Skp2-Cks1小分子抑制剂的发现和抗肿瘤活性及机制评价

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新型Skp2-Cks1小分子抑制剂的发现和抗肿瘤活性及机制评价

作者：胡开召郑州大学

学位级别：硕士

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内介导蛋白降解的水解体系,可通过调控细胞中蛋白泛素化进程参与多种生命活动。UPS降解蛋白是一个三酶级联反应,在泛素激活酶e1、泛素结合酶e2和泛素连接酶e3共同作用下将泛素... 详细信息

泛素蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS)是细胞内介导蛋白降解的水解体系,可通过调控细胞中蛋白泛素化进程参与多种生命活动。UPS降解蛋白是一个三酶级联反应,在泛素激活酶e1、泛素结合酶e2和泛素连接酶e3共同作用下将泛素分子转移到靶蛋白上,对其进行泛素化修饰。泛素化的靶蛋白最终在蛋白酶体内降解。在整个泛素化过程中,e3泛素连接酶对靶蛋白的特异性识别起关键主导作用。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2,Skp2)是SCF类(Skp1-Cullin1-F-box)e3泛素连接酶识别底物的反应原件,有研究表明Skp2在多种癌症中高表达且与肿瘤的不良预后密切相关。Skp2主要通过降解周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKIs)如p27,p21和p57等,进而调节肿瘤增殖和转移。Skp2在Cks1(Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1)参与下可以直接降解磷酸化的p27,促进肿瘤细胞的增殖。因此通过靶向Skp2-Cks1相互作用的小分子化合物来抑制p27的泛素化降解是一种有效的新型抗癌策略。本论文建立了靶向Skp2-Cks1小分子抑制剂的高通量筛选平台,通过对课题组已有的化合物库进行筛选,在得到先导化合物Selexipag的基础上并对其结构进行优化。通过初步的抗肿瘤生物活性评价,我们发现化合物ZK-288对多种Skp2高表达的肿瘤细胞表现出较强的抗肿瘤活性,在PC-3前列腺癌细胞和MGC-803胃癌细胞中其IC为4.76μM和7.06μM。随后,我们在PC-3和MGC-803细胞中进行了深入的抗肿瘤机制探究。通过细胞热迁移实验、Skp2-sh RNA实验和免疫共沉淀实验证明化合物ZK-288在细胞内能靶向Skp2与Cks1的结合。Western Blot实验表明化合物ZK-288能以时间依赖和浓度依赖的方式抑制Skp2底物p21和p27的蛋白降解。Hoechst 33342染色和AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡实验进一步证实了化合物ZK-288能够以浓度依赖的方式诱导PC-3和MGC-803细胞凋亡的发生。细胞周期实验显示化合物ZK-288可以阻滞细胞周期于S期,抑制肿瘤细胞的增殖。小鼠体内抗肿瘤活性研究表明化合物ZK-288可以显著抑制PC-3和MGC-803肿瘤的生长,且未显示出明显的毒副作用。以上结果表明化合物ZK-288在细胞与动物水平均具有较强的抗肿瘤活性,可以用于靶向Skp2抗肿瘤药物的研发。

关键词：泛素e3连接酶 Skp2 Cks1 p27 抗肿瘤活性