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泛素特异性蛋白酶18在HBV慢性感染及干扰素抵抗中的作用机制

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中华肝脏病杂志 2014年第5期22卷 386-388页

作者：周俊英杨柳石家庄市河北医科大学第三医院感染科 050051

干扰素（interferon，IFN）α在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）抗病毒治疗中的优势为有限疗程和相对较高的HBeAg和HBsAg的血清学转换率，但是其疗效尚不尽人意。在造成IFN应答不佳的众多影响因素中，IFN抗病毒作用信号通路... 详细信息

干扰素（interferon，IFN）α在慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）抗病毒治疗中的优势为有限疗程和相对较高的HBeAg和HBsAg的血清学转换率，但是其疗效尚不尽人意。在造成IFN应答不佳的众多影响因素中，IFN抗病毒作用信号通路尤其是对IFN刺激基因（interferonstimulatedgene，ISG）的研究逐渐成为热点，

关键词：肝炎病毒乙型干扰素类抵抗泛素特异性蛋白酶18

泛素特异性蛋白酶18抑制IFNα抗HBV活性但并不抑制IFNλ抗HBV的活性（英文）

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中国生物化学与分子生物学报 2018年第9期34卷 954-961页

作者：张小梅雷青松秦波李麟重庆医科大学附属第一医院感染科重庆400016 重庆市中医研究院肝病科重庆400021

干扰素α(IFN-α)是临床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物之一。泛素特异性蛋白酶18(USP18)被证实是抑制IFN-α抗HBV活性的因子,但USP18是否对干扰素λ(IFN-λ)抗HBV有影响还尚未可知。为了明确USP18对IFNλ抗HBV活性的影响,本研究以Hep... 详细信息

干扰素α(IFN-α)是临床最常用的抗乙型肝炎病毒(HBV)药物之一。泛素特异性蛋白酶18(USP18)被证实是抑制IFN-α抗HBV活性的因子,但USP18是否对干扰素λ(IFN-λ)抗HBV有影响还尚未可知。为了明确USP18对IFNλ抗HBV活性的影响,本研究以Hep G2. 2. 15细胞作为乙肝体外模型,采用脂质体转染法分别向细胞转染p EGFP-USP18、PEGFP-N1经48 h,再经IFN-α和IFN-λ处理24 h,分为阴性对照组﹑USP18过表达+IFN-α组﹑空载组+IFN-α组﹑USP18过表达+IFN-λ组﹑空载组+IFN-λ组。采用Western印迹、RT-q PCR和ELISA检测各组的乙肝病毒标志物、STAT1/p STAT1和下游的干扰素刺激基因(ISGs)的表达。结果显示,与阴性对照组和空载组相比,USP18蛋白在过表达组明显升高(P 18过表达组,差异有统计学意义(P 18过表达组,差异有统计学意义(P 18可通过抑制JAK/STAT信号通路的激活来减弱IFN-α抗HBV的活性。研究还证实,IFN-λ可发挥抗HBV的作用,USP18不通过JAK/STAT信号通路抑制其抗HBV活性。

关键词：乙型肝炎病毒泛素特异性蛋白酶18 干扰素α 干扰素λ

乳腺癌组织中泛素特异性蛋白酶18/干扰素刺激基因15表达水平及其临床意义

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安徽医药 2023年第7期27卷 1449-1454,I0003页

作者：蔡冰尹香利刘静渭南市中心医院病理科陕西渭南714000

目的探究泛素特异性蛋白酶18(USP18)、干扰素刺激基因15(ISG15)在乳腺癌组织中的表达水平及临床意义。方法采用Ualcan数据库分析USP18、ISG15在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达情况及二者与乳腺癌预后的关系;选取渭南市中心医院2012年... 详细信息

目的探究泛素特异性蛋白酶18(USP18)、干扰素刺激基因15(ISG15)在乳腺癌组织中的表达水平及临床意义。方法采用Ualcan数据库分析USP18、ISG15在正常乳腺组织和乳腺癌组织中的表达情况及二者与乳腺癌预后的关系;选取渭南市中心医院2012年5月至2015年7月诊治的99例乳腺癌病人癌组织、癌旁正常组织进行研究。分别检测USP18、ISG15mRNA及其蛋白表达情况;分析乳腺癌组织USP18、ISG15表达水平与病人临床病理特征、预后的关系;Cox回归分析乳腺癌病人预后的影响因素。结果Ualcan数据库中乳腺癌组织USP18为18.40±4.17、ISG15 mRNA表达水平为168.56±43.95高于正常乳腺组织(10.00±3.14、30.76±8.23)(P18、ISG15 mRNA表达水平高低与乳腺癌预后无明显相关性。乳腺癌组织USP18为1.67±0.53、ISG15 mRNA为1.86±0.61及蛋白阳性表达率均高于癌旁正常组织(1.03±0.34、0.99±0.33)(P18、ISG15表达水平均与淋巴结转移、乳腺癌分子亚型、肿瘤分化程度、TNM分期相关(P18表达水平与ISG15呈正相关(P18阳性组、ISG15阳性组乳腺癌病人术后60个月生存率均低于USP18阴性组、ISG15阴性组(P18、ISG15均是影响乳腺癌病人不良预后的独立危险因素(P18、ISG15表达水平均较高,两者均与乳腺癌病人预后关系密切,检测乳腺癌组织USP18、ISG15水平有助于评估乳腺癌病人预后。

关键词：乳腺肿瘤干扰素刺激基因15 泛素特异性蛋白酶18 预后

下调泛素特异性蛋白酶18抑制胃癌细胞的侵袭和增殖

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肿瘤研究与临床 2018年第7期30卷 433-437页

作者：钟显飞易礼智邓学杰程征宇王琴王舰梅四川省乐山市人民医院消化内科 614000 西南医科大学病理教研室四川泸州646000

目的分析泛素特异性蛋白酶18（USP18）在人胃癌细胞株中的表达及其作用,探讨其与胃癌发生、发展的关系.方法蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测永生化胃黏膜上皮细胞株GSE和胃癌细胞株（AGS、MKN45、MKN25、BGC823... 详细信息

目的分析泛素特异性蛋白酶18（USP18）在人胃癌细胞株中的表达及其作用,探讨其与胃癌发生、发展的关系.方法蛋白质印迹法和实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测永生化胃黏膜上皮细胞株GSE和胃癌细胞株（AGS、MKN45、MKN25、BGC823、BGC803、SGC7901）中USP18蛋白和mRNA表达水平;CCK-8法和Transwell实验检测USP18在胃癌细胞侵袭和增殖中的作用.结果 GSE细胞中USP18 mRNA的含量表达低于各胃癌细胞株（F=794.052,P＜0.000 1）.6种胃癌细胞株中,BGC823和BGC803中USP18 mRNA的相对含量高,分别为17.62±0.55和13.52±0.50,而在MKN28和MKN45细胞中的含量低,分别为1.40±0.17和4.23±0.26.在蛋白水平上,USP18在GSE细胞中的表达最低,在6株胃癌细胞中,USP18在侵袭能力较强的SGC7901和BGC803细胞中的表达最高,而在AGS和MKN45细胞中的表达最低.与对照组相比,干扰USP18后SGC7901和BGC803的侵袭和增殖能力降低,差异均具有统计学意义（P＜0.01）.结论 USP18在侵袭能力较强的胃癌细胞株中高表达,下调USP18能抑制胃癌细胞的侵袭和增殖.

关键词：胃肿瘤泛素特异性蛋白酶18 肿瘤侵润细胞增殖

USP18对不同干扰素抗HBV的影响及可能机制

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USP18对不同干扰素抗HBV的影响及可能机制

作者：张小梅重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:慢性乙型肝炎是全球关注的健康问题,泛素特异性蛋白酶18属于干扰素刺激基因,本研究旨在探讨USP18对Ⅰ型干扰素(IFNα)及Ⅲ型干扰素(IFNλ)抗HBV的影响及其相关机制。方法:将HepG2.2.15细胞随机分为空白对照组、USP18过表达+IFNα... 详细信息

目的:慢性乙型肝炎是全球关注的健康问题,泛素特异性蛋白酶18属于干扰素刺激基因,本研究旨在探讨USP18对Ⅰ型干扰素(IFNα)及Ⅲ型干扰素(IFNλ)抗HBV的影响及其相关机制。方法:将HepG2.2.15细胞随机分为空白对照组、USP18过表达+IFNα组、空载+IFNα组、USP18过表达+IFNλ组、空载+IFNλ组。空白对照组未经任何处理,其余几组采用脂质体转染法分别转染pEGFP-USP18,PEGFP-N1 质粒 DNA 48 小时后,采用 Western blot 检测USP18的相对表达量。其次,分别用IFNα及IFNλ对转染48小时后的细胞进行24小时的药物干预,采用Western blot,RT-qPCR检测JAK/STAT信号通路和ISG15,MXA,IFIT1及HBcAg的表达情况;化学发光法检测细胞上清中的HBeAg及HBsAg;PCR荧光探针法检测细胞上清中的HBV-DNA表达情况。结果:首先,USP18蛋白相对表达量在USP18过表达组中最高,USP18成功过表达,差异有统计学意义(P18过表达组,差异有统计学意义(P蛋白ISG15,MxA,IFIT1表达均高于USP18过表达组,差异有统计学意义(P18过表达组明显低于空载组,差异有统计学意义(P18通过抑制JAK/STAT信号通路的激活,从而减少抗病毒蛋白的表达,最终降低了 IFNα抗HBV的活性及复制能力。相比之下,USP18对IFNλ通过JAK/STAT通路抗HBV无明显抑制作用。

关键词：乙型肝炎病毒泛素特异性蛋白酶18 干扰素α 干扰素λ

ISG15在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与USP18和PKM2的相关性

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ISG15在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与USP18和PKM2的相关性

作者：罗冬云郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的食管癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均较高,严重威胁了人类的生命健康。我国是食管癌发病率最高的国家之一,其中河南尤为高发,组织学类型以鳞状细胞癌为主。大量文献资料已经证实与食管癌发病相关的因... 详细信息

背景和目的食管癌是全球范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率及死亡率均较高,严重威胁了人类的生命健康。我国是食管癌发病率最高的国家之一,其中河南尤为高发,组织学类型以鳞状细胞癌为主。大量文献资料已经证实与食管癌发病相关的因素有很多,但食管癌的发生发展机制尚不清楚,临床大多数患者的治疗效果不好,预后差。因此,对食管癌的发生发展机制进行更深入的探讨成为目前研究的重点和难点。能量代谢是肿瘤发生的关键因素,近年来研究发现有氧糖酵解是大多数肿瘤细胞的主要代谢方式,与肿瘤的发生发展密切相关。M2型丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase M2,PKM2）是糖酵解途径中关键的限速酶,其在肿瘤的能量代谢过程中发挥了重要作用。我们在前期研究中通过免疫组织化学检测证实,PKM2在食管鳞癌组织中高表达,可能与其发生发展有关。PKM2在体内的功能及活性受到多种因素的调节,干扰素刺激基因15（Interferon-stimulated gene15,ISG15）参与的类泛素化修饰也是其主要调控途径之一。泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin specific protease 18,USP18）是ISG15的特异性解聚酶,主要通过去类泛素化作用参与蛋白质的功能调节。近年来研究发现USP18也可以通过调控干扰素的产生及细胞增值等途径影响肿瘤的发生。我们的前期实验结果显示USP18在食管鳞癌组织中的表达升高,且与食管鳞癌的发生有关,由此引发了后续的研究。ISG15是第一个被鉴定的类泛素蛋白（Ubiquitin-like protein,UBL）,和泛素相似,它可以对多种目标蛋白质进行共价修饰,参与多个信号通路的调节,对机体的天然免疫反应非常重要。近年来研究发现,类泛素修饰酶系的功能紊乱可以导致肿瘤的发生,在多种肿瘤细胞中ISG15的表达水平明显升高,并且与肿瘤细胞的增值、侵袭和转移有关。然而,关于ISG15蛋白在食管鳞癌组织中的表达情况及其与食管鳞癌的发生发展及PKM2、USP18的相关性,目前尚未见相关文献报道。本研究采用免疫组织化学和Western Blot方法分别检测ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌组织和细胞株中的表达水平,探讨ISG15在食管鳞状细胞癌的发生发展中的意义,并分析ISG15、USP18和PKM2的表达在食管鳞状细胞癌组织中的相关性。为进一步探讨ISG15在肿瘤中的作用及食管癌的发生发展机制提供理论基础。方法1.收集食管鳞状细胞癌组织70例、食管鳞状上皮内瘤变组织60例及正常食管粘膜组织30例,制成组织切片备用;培养食管鳞状细胞癌细胞株KYSE70及正常食管粘膜上皮细胞株HET-1A,提取细胞蛋白。2.采用免疫组织化学SP-9000三步法检测ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮内瘤变及正常食管粘膜组织中的定位及表达情况。通过Western Blot方法检测HET-1A和KYSE70两种食管细胞株中ISG15蛋白的表达水平。3.统计学分析:采用SPSS 21软件进行数据分析与处理,计数资料采用t检验分析,结果以均数±标准差表示;分类资料采用χ~2检验分析;相关性分析采用Spearman等级相关分析。检验水准（双侧）α=0.05。结果1.免疫组化结果显示:ISG15在食管鳞状细胞癌、食管鳞状上皮内瘤变及正常食管粘膜组织中的阳性表达率分别为74.3%、33.3%、6.7%,3组间的差异显著,具有统计学意义（χ~2=45.1,P＜0.05）,然后分别进行两两比较,组间差异均有统计学意义。在食管鳞状上皮内瘤变组中,高级别鳞状上皮内瘤变组的ISG15阳性表达率（46.7%）明显高于低级别鳞状上皮内瘤变组（20%）,差异具有统计学意义（χ~2=4.8,P＜0.05）。对相关临床病理参数的分析显示,ISG15的表达水平在不同性别、年龄、肿物大小、分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移组别间的差异均无统计学意义（P＞0.05）。相关性分析表明,食管鳞状细胞癌组织中ISG15和PKM2的表达呈正相关（r=0.672,P＜0.05）,而ISG15和USP18以及PKM2和USP18的表达均无相关性（P＞0.05）。2.Western Blot结果显示:HET-1A细胞株中ISG15蛋白的表达水平为0.23±0.07,KYSE70细胞株中ISG15蛋白的表达水平为1.20±0.34,食管鳞状细胞癌细胞株中ISG15的表达水平明显高于其在正常食管粘膜上皮细胞中的表达水平,差异具有统计学意义（t=8.04,P＜0.05）。结论1.ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌中高表达,提示ISG15可能与食管鳞状细胞癌的发生有关。2.PKM2蛋白和ISG15蛋白在食管鳞状细胞癌的发生中可能存在协同作用,共同促进肿瘤的发生。

关键词：食管癌干扰素刺激基因15 M2型丙酮酸激酶泛素特异性蛋白酶18 相关性

PKM2和USP18在食管鳞癌组织中的表达及临床病理意义

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PKM2和USP18在食管鳞癌组织中的表达及临床病理意义

作者：张晶郑州大学

学位级别：硕士

背景与目的食管癌在全球恶性肿瘤中排名第四位,病理类型以鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）最为多见。据大数据统计报道,食管癌的5年生存率在30%左右（15%~42%）。我国河南省林县是食管癌的高发区,相对于其他恶性上皮源性的肿... 详细信息

背景与目的食管癌在全球恶性肿瘤中排名第四位,病理类型以鳞状细胞癌（squamous cell carcinoma,SCC）最为多见。据大数据统计报道,食管癌的5年生存率在30%左右（15%~42%）。我国河南省林县是食管癌的高发区,相对于其他恶性上皮源性的肿瘤,该区域的食管癌死亡率明显高于全国平均水平。就肿瘤的发病机制来讲,肿瘤的异质化是由多元素导致的,例如外界化学物质刺激、基因突变、内环境紊乱或者是机体自身正常代谢停滞、异常代谢活跃等。某种因子在机体代谢活动中生成增多会影响正常的代谢过程,导致在细胞水平或者是基因水平上对整个机体的稳态构成威胁,进而出现肿瘤样变。因此,确定肿瘤基因突变位点是研究肿瘤发展进程的关键。M2型丙酮酸激酶（pyruvate kinase M2,PKM2）作为糖酵解途径中最重要的调节酶,能够对糖酵解过程产生的大分子物质的数量起到了关键性的掌控作用,同时为肿瘤细胞的生长代谢提供了所需的能量和原料,也对肿瘤细胞的生长周期起到了调控作用。泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin specific protease 18,USP18）作为一种干扰素诱导基因,在人体内环境中主要扮演去泛素化的作用,受损组织被机体识别后会与ISG15（类泛素干扰素刺激基因）形成泛素化复合物,进而被吞噬细胞或水解酶降解清除。而USP18阻断ISG15发挥泛素化作用,进而防止损伤的靶细胞被吞噬细胞降解或被水解酶水解,导致损伤细胞在体内堆积不能及时清除,使肿瘤细胞处在营养丰富的环境内,达到促进肿瘤异质化进程的效果,进而对肿瘤的生长代谢起到推动作用。近年来寻找生物学标记物成为了了解食管癌的肿瘤发病机制以及探索食管癌的早期筛查指标和靶向治疗位点的研究热点,既能在探索食管癌发生发展的同时对食管癌做出早期诊断,又能进行靶向对症治疗以提高生存率。明确肿瘤的突变点能够从根本上遏制食管癌的发生,也能够从分子角度扭转肿瘤的单克隆现象,促进有肿瘤化趋势的细胞发生凋亡,调节正常细胞进行常规的新陈代谢。进而,能够响应“早发现、早诊断、早治疗”的医疗目标,对于提高食管癌患者的生存率、减少患者的致死率起到决定性的作用,也对食管癌的临床治疗效果和结局起到显著改善和指导的效果。本研究通过免疫组织化学法观察PKM2和USP18在食管鳞状细胞癌组织、正常食管黏膜组织以及食管鳞状上皮内瘤变组织（低级别和高级别）中的表达情况,以及分析在不同分化程度、浸润深度、年龄、性别、淋巴结转移等情况下的食管鳞癌组织中的差异性表达状况,观察其表达差异性是否与食管鳞状上皮的异型增生的进程以及各临床指标有关,对于探讨PKM2和USP18在推进食管癌发生过程中的作用有很大的帮助作用。方法1.筛选60例于2015年01月~2015年12月间由郑州大学第一附属医院病理科诊断为食管鳞状细胞癌的病例,其中高分化、中分化、低分化鳞状细胞癌组织各20例。病例标本均为手术切除后的食管大标本,经常规病理取材,病理报告中有明确的肿物大小、位置、分化程度、浸润深度、淋巴结转移以及切缘是否取干净等情况。另外选取60例正常食管黏膜组织,以及60例经ESD或EMR切除后诊断为鳞状上皮内瘤变的组织,其中高级别、低级别鳞状上皮内瘤变组织各30例。2.实验运用免疫组织化学技术对食管鳞癌组织、食管鳞状上皮内瘤变组织以及正常食管黏膜组织进行USP18和PKM2的染色,严格按照SP免疫组化二步染色法的步骤进行。免疫标记物PKM2的阳性对照采用胃腺癌组织,免疫标记物USP18的阳性对照采用肝癌组织,两者阳性染色位于细胞核和细胞质中,阴性对照均为不加一抗染色的食管鳞癌组织。3.统计学处理:运用SPSS 17.0统计软件进行分析处理,对癌组织、食管鳞状上皮内瘤变组织、正常食管黏膜组织以及不同临床指标下的食管癌组织进行独立的两组二分类和多组二分类比较,检验水准α=0.05。结果1、PKM2在食管鳞癌组织、食管鳞状上皮内瘤变组织以及正常食管黏膜组织中的阳性表达率分别为63.3%、30%、11.7%,且3组间比较,差异具有统计学意义（χ2=36.19,P＜0.05）。可见,PKM2在食管鳞癌组织中的表达显著高于其在食管鳞状上皮内瘤变组织以及食管正常黏膜组织中的表达。另外在低级别和高级别鳞状上皮内瘤变组织中PKM2的表达阳性率分别是16.7%和43.3%,差异具有统计学意义（χ2=5.08,P＜0.05）。2、USP18在食管鳞癌组织、食管鳞状上皮内瘤变组织以及正常食管黏膜组织中的阳性表达率分别为65%、31.7%、3.3%,3组间比较,差异具有统计学意义（χ2=51.45,P＜0.05）。可见,USP18在食管鳞癌组织中的表达程度也是明显高于其在食管鳞状上皮内瘤变组织以及正常食管黏膜组织中的表达。USP18在低级别和高级别鳞状上皮内瘤变组织中的阳性表达率分别为23.3%和40.0%,虽然阳性表达有逐渐增加的趋势,但是与PKM2不同,USP

关键词：食管癌发病机制 M2型丙酮酸激酶泛素特异性蛋白酶18

USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

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USP18对干扰素α和干扰素λ抗病毒信号通路的影响及意义

作者：朱战涛河北医科大学

学位级别：硕士

目的：干扰素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治疗过程中一个重要的组成部分。在抗乙型肝炎病毒药物中，IFN与核苷（酸）类似物相比... 详细信息

目的：干扰素（interferon，IFN）是目前慢性乙型病毒性肝炎（ChronicHepatitis B，CHB）和慢性丙型病毒性肝炎（Chronic Hepatitis C，CHC）抗病毒治疗过程中一个重要的组成部分。在抗乙型肝炎病毒药物中，IFN与核苷（酸）类似物相比具有疗程短、停换药方便等优势;在慢性丙型病毒肝炎治疗中，IFN联合利巴韦林还是其标准治疗方案。虽然目前已有数十种干扰素被发现，然而在中国仅有隶属于Ⅰ型干扰素的IFN-α应用到病毒性肝炎的抗病毒治疗中。但是，在此治疗过程中仅有30%-40%CHB患者能达到e抗原的血清学转换，约有60%的患者对其治疗应答不佳;而且有50%-60%的基因1型CHC患者无法得到持续病毒学应答（SustainedVirological Response，SVR）。与此同时，由于IFN-α的诸多副作用，部分患者在治疗过程中还因为严重的副反应而终止治疗。近期研究发现泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18，USP18）是IFN-α疗效的重要影响因子，并且进一步研究证实USP18是IFN-α治疗效果的重要负性调节因子。IFN-λ是最新发现的一类新型干扰素，隶属于Ⅲ型干扰素;与IFN-α类似它也是通过激活JAK-STAT（Janus activated kinase-signal transducerand activator of transcription，JAK-STAT）通路并调控一系列抗病毒蛋白如：双链RNA依赖的蛋白激酶R（PKR)和抗黏病毒蛋白（mixovirus resistanceprotein A，MxA）来发挥抗病毒作用。最新体外研究发现在IFN-α应答不佳的细胞中IFN-λ仍然可以发挥抗病毒作用。关于USP18在IFN-α的抗病毒通路中的研究进展很多，但对于其在IFN-λ的抗病毒信号转导通路中的影响报道甚少。本研究旨在探讨USP18对IFN-α和IFN-λ抗病毒信号通路的不同影响及其临床意义。方法：复苏Huh-7细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的高糖DMEM培养基在5%CO2，37℃条件下培养至对数生长期，然后分为空白对照组、IFN-α实验组和IFN-λ实验组。 1IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激，空白对照组常规培养并加入等体积无菌生理盐水，分别于6h，12h，24h，48h后收细胞。 2空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后分别再次给予无菌生理盐水、IFN-α2a（20IU/ml）和IFN-λ1（10ng/ml）刺激12h后收细胞。 3空白对照组常规培养并加入无菌生理盐水，IFN-α实验组给予IFN-α2a（20IU/ml），IFN-λ实验组给予IFN-λ1（10ng/ml）进行刺激12小时，然后三组细胞用预冷的PBS缓冲液漂洗三遍后重新置入新鲜的无干扰素培养基中培养16h，然后再分别给予无菌生理盐水、IFN-λ1（10ng/ml）和IFN-α2a（20IU/ml）刺激12h后收细胞。实时荧光定量聚合酶连反应（Real Time-quantitative Polymerase ChainReaction, RT-qPCR）法检测Huh-7细胞USP18、STAT1、PKR和MxA的mRNA表达水平。Western-blot检测USP18、P-STAT1、STAT1、PKR及MxA的蛋白表达水平。结果： 1不同干扰素刺激时间（6h，12h，24h，48h）各组Huh-7细胞指标的变化： 1.1各组细胞USP18的表达变化：随着干扰素刺激时间的延长，IFN-α实验组和IFN-λ实验组Huh-7细胞内USP18mRNA的表达增加，但IFN-α组比IFN-λ组增加更为明显且在24h、48h USP18mRNA的表达明显高于IFN-λ组（5.33±0.47VS4.60±0.42，5.41±0.46VS4.76±0.78），差异有统计学意义（P18mRNA均高于空白对照组，差异有统计学意义（P18蛋白的表达也开始增加，IFN-α组比IFN-λ组增加更明显且在48h时USP18蛋白的升高明显大于IFN-λ组（1.61±0.04VS1.46±0.03），差异有统计学意义（P蛋白的变化： 1.2.1随着

关键词：泛素特异性蛋白酶18 干扰素-α 干扰素-λ JAK-STAT 双链RNA依赖的蛋白激酶R 抗黏病毒蛋白A

USP18在干扰素-α治疗慢乙肝过程中的预测意义及作用机制

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USP18在干扰素-α治疗慢乙肝过程中的预测意义及作用机制

作者：张坤坤河北医科大学

学位级别：硕士

目的：乙型肝炎病毒（HBV）感染已经成为全球公共健康问题，每年约有100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。活动性HBV复制是导致肝脏损伤和疾病进展的关键因素，因此最大限度地长期抑制或清除HBV成为慢性乙型肝炎治疗的总体目标。目前用... 详细信息

目的：乙型肝炎病毒（HBV）感染已经成为全球公共健康问题，每年约有100万人死于HBV感染相关的肝脏疾病。活动性HBV复制是导致肝脏损伤和疾病进展的关键因素，因此最大限度地长期抑制或清除HBV成为慢性乙型肝炎治疗的总体目标。目前用于慢性乙型肝炎抗病毒治疗的药物主要有两大类：1、核苷（酸）类似物;2、干扰素（interferon, IFN）。干扰素具有抗病毒和免疫调节双重作用，治疗疗程短而确定、耐药少见，故逐渐成为临床治疗慢性乙型肝炎的主要选择。然而，目前干扰素治疗只能达到30%-40%的HBeAg血清学转换，约有60%的患者尽管接受干扰素抗病毒治疗，但仍然遭受乙肝病毒的侵害，因此短期内预测干扰素治疗疗效显得尤为重要，最新研究热点是干扰素抗病毒作用信号通路中的干扰素刺激基因，泛素特异性蛋白酶18（Ubiquitin-specific protease18, USPl8）是其中重要的一个干扰素刺激基因。本研究旨在探讨USPl8在干扰素-α治疗慢乙肝过程中的预测意义及作用机制。方法：选取慢性HBV感染者70例，均为免疫清除期患者，所有患者均进行肝组织活检，无明显干扰素抗病毒治疗禁忌症。留取受试者治疗前新鲜外周血提取PBMCs进行体外干扰素-α孵育刺激试验，并对受试者应用干扰素-α抗病毒治疗，进行随访观察24周，其中无病毒学应答患者（nonvirological response, NVR）18例，完全病毒学应答患者（complete virologicalresponse,CVR）32例，部分病毒学应答患者（partial virological response,PVR）20例，健康对照10例。 1体外干扰素-α孵育PBMCs：留取70例受试者治疗前新鲜外周静脉血，密度梯度离心法分离PBMCs，无血清培养基悬浮沉淀细胞，分为两组：第一组空白对照组（不加任何因子）;第二组加入干扰素-α因子刺激孵育PBMCs,4h后收集细胞。 2对所有受试者应用干扰素-α抗病毒治疗随访观察，留取治疗0周、1周、12周、24周时新鲜外周血，密度梯度离心法分离收集PBMCs。 3Trizol法抽提外周血单个核细胞总RNA，应用Real-time PCR法检测USP18、STAT1mRNA的表达水平。 4RIPA法提取细胞总蛋白应用western blot法检测USP18、STAT1、P-STAT1蛋白的表达水平。结果： 1健康对照组外周血PBMCs中USP18的表达为阴性 2干扰素-α治疗过程外周血PBMCs中USP18mRNA水平变化 70例CHB患者在干扰素-α治疗过程中接受mRNA水平检测，将PBMCs中内参GAPDH相对表达量设定为1.00，与GAPDH表达量相比较，干扰素-α治疗前NVR组PBMCs中USP18的表达水平（0.073±0.026）较CVR组（0.043±0.023）及PVR组（0.044±0.022）高，差异有统计学意义（F=10.665，P＜0.01）;治疗1周时，各组PBMCs中USP18的表达水平明显升高，NVR组（0.098±0.023）、CVR组（0.071±0.027）、PVR组（0.074±0.027），NVR组表达水平最高，差异有统计学意义（F=6.781，P=0.002）;治疗12周及24周时，各组表达水平为NVR组（0.097±0.024）（0.096±0.023）、CVR组（0.069±0.025）（0.066±0.025）、PVR组（0.075±0.026）（0.074±0.025），NVR组表达水平仍最高，差异有统计学意义（F1=7.140，p=0.002;F2=8.654, P＜0.01）。 3干扰素-α治疗过程外周血PBMCs中USP18蛋白水平变化将PBMCs中内参β-actin相对表达量设定为1.00，与β-actin表达量相比较，干扰素-α治疗前NVR组外周血PBMCs中USP18的表达水平（0.308±0.046）较CVR组（0.250±0.044）及PVR组（0.248±0.048）高，差异有统计学意义（F=11.151，P＜0.01）;治疗1周后，各组USP18的表达水平明显升高，NVR组（0.563±0.050）、CVR组（0.431±0.047）、PVR组（0.428±0.047），NVR组表达水平最高，差异有统计学意义（F=51.722，P＜0.01）;治疗12周及24周时，各组表达水平为NVR组（0.568±0.051）（0.566±0.049）、CVR组（0.430±0.047）（0.429±0.045）、PVR组（0.426±0.047）（0.430±0.049），NVR组表达水平仍最高，差异有统计学意义（F1=55.958，P＜0.01;F2=55.841, P＜0.01）。 4体外干扰素-

关键词：乙型肝炎病毒慢性乙型肝炎干扰素-α 泛素特异性蛋白酶18