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牡丹泛素延伸蛋白基因片段克隆与表达分析

扬州大学学报（农业与生命科学版） 2013年第1期34卷 79-83页

作者：王彦杰张超王晓庆马越刘爱青张淑玲董丽北京林业大学园林学院/国家花卉工程技术研究中心北京100083 国家知识产权局专利局专利审查协作北京中心北京100190 曹州牡丹花木开发总公司山东菏泽274000 洛阳市花木公司河南洛阳471000

采用RT-PCR技术从牡丹(Paeonia suffruticosa)花瓣中克隆得到泛素延伸蛋白基因的cDNA片段,该片段长423bp,编码140个氨基酸残基,命名为PsUBQ,GenBank登录号为JN699053。PsUBQ编码的蛋白是在泛素单体后融合了1个核糖体S27a多肽,经多重序... 详细信息

采用RT-PCR技术从牡丹(Paeonia suffruticosa)花瓣中克隆得到泛素延伸蛋白基因的cDNA片段,该片段长423bp,编码140个氨基酸残基,命名为PsUBQ,GenBank登录号为JN699053。PsUBQ编码的蛋白是在泛素单体后融合了1个核糖体S27a多肽,经多重序列比对发现该蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜樱桃(Prunus avium)、葡萄(Vitis vinifera)等高等植物泛素延伸蛋白的氨基酸序列具有很高的一致性。实时荧光定量PCR分析表明:PsUBQ在牡丹不同组织间表达较稳定,且在切花开放各级别花瓣中呈组成型表达。PsUBQ的克隆与表达为进一步探讨牡丹开放衰老进程中泛素对激素信号的作用机制打下基础,同时为研究牡丹目标基因的表达提供校正标准。

关键词：牡丹泛素延伸蛋白基因克隆序列分析表达

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桑树泛素延伸蛋白基因的原核表达

丝绸 2013年第1期50卷 1-3,18页

作者：周晓慧戴斌王韡陆小平苏州大学金螳螂建筑与城市环境学院江苏苏州215123

对前期克隆的桑树泛素延伸蛋白基因进行了生物信息学及原核表达分析,以pGEX-4T-1为载体,构建了桑树泛素延伸蛋白基因重组表达质粒,转入受体菌*** BL21。经IPTG诱导后,基因在大肠杆菌中得到有效表达。为提高表达效果,从不同诱导时间对目... 详细信息

对前期克隆的桑树泛素延伸蛋白基因进行了生物信息学及原核表达分析,以pGEX-4T-1为载体,构建了桑树泛素延伸蛋白基因重组表达质粒,转入受体菌*** BL21。经IPTG诱导后,基因在大肠杆菌中得到有效表达。为提高表达效果,从不同诱导时间对目的蛋白表达条件进行优化,用SDS-PAGE电泳检测,结果表明在经37℃条件下,经1.0 mmol/L的IPTG诱导6 h后,原核表达效果明显提高。研究表明,桑树泛素延伸蛋白基因与其他植物具有较高的同源性,因此利用模式植物研究其功能及分子进化分析更加高效,为进一步探讨桑树的逆境生理机制提供了理论依据。

关键词：桑树泛素延伸蛋白载体构建原核表达

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不同昆虫泛素延伸蛋白基因的生物信息学分析

河南农业科学 2011年第3期40卷 92-95页

作者：强承魁王胜永凤舞剑于玲雅秦越华徐州生物工程职业技术学院农林工程系江苏徐州221006 山东省植物保护总站山东济南250100

采用生物信息学方法系统分析了甜菜夜蛾、菜粉蝶、烟夜蛾和黑腹果蝇泛素延伸蛋白（UBE）基因序列的遗传多样性、分子进化及其编码氨基酸序列的结构功能域和基序特点。结果显示,4种昆虫UBE基因序列的同源性较高（81.8%~99.7%）,且遗传距... 详细信息

采用生物信息学方法系统分析了甜菜夜蛾、菜粉蝶、烟夜蛾和黑腹果蝇泛素延伸蛋白（UBE）基因序列的遗传多样性、分子进化及其编码氨基酸序列的结构功能域和基序特点。结果显示,4种昆虫UBE基因序列的同源性较高（81.8%~99.7%）,且遗传距离较近（0.003~0.199）,均编码ubiquitin/L40 UBE。共检出81个多态位点,生成4个单倍型,单倍型多样性（Hd=1.000）、平均核苷酸差异数（K=45.883）、核苷酸多样性（Pi=0.112 97）、同义替换核苷酸多样性均值（Pi（s）=0.415 01）、非同义替换核苷酸多样性均值（Pi（a）=0.024 89）、密码子有效值（ENC=38.070~53.458〈61）、偏爱指标（CBI=0.437~0.729〉0）和χ2检验计算值（χ2=0.454~0.960）表明这4种昆虫UBE基因的遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性。4条氨基酸序列均含泛素同系物结构域和Ribosomal/L 40结构域各1个,未见信号肽和跨膜结构域;共含14条基序,其中Se-UBE和Dm-UBE基因编码的氨基酸序列各具1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶C磷酸化位点,Pr-UBE和Ha-UBE基因编码的序列则各含2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶C磷酸化位点。研究结果为进一步开展UBE基因分子进化机制、表达特性及昆虫病毒侵染关系等方面的研究提供基础信息。

关键词：泛素延伸蛋白甜菜夜蛾菜粉蝶烟夜蛾黑腹果蝇生物信息学

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本氏烟泛素延伸蛋白基因的功能分析

本氏烟泛素延伸蛋白基因的功能分析

作者：宋晓毅浙江大学

学位级别：硕士

泛素(ubiquitin)是在生物中普遍存在的一种由76个氨基酸组成的小分子量蛋白。它通过对靶标蛋白进行泛素化修饰,在26S蛋白酶体的作用下将靶标蛋白降解,或通过与包含各种泛素结合结构域(ubiquitin binding domain)的蛋白的互作调节蛋白的... 详细信息

泛素(ubiquitin)是在生物中普遍存在的一种由76个氨基酸组成的小分子量蛋白。它通过对靶标蛋白进行泛素化修饰,在26S蛋白酶体的作用下将靶标蛋白降解,或通过与包含各种泛素结合结构域(ubiquitin binding domain)的蛋白的互作调节蛋白的细胞定位、活性以及蛋白的相互作用,从而参与各种生物学功能的调控。泛素延伸蛋白(ubiquitin extension protein,UEP),是氨端一个泛素分子和羧端一个核糖体蛋白分子的融合蛋白。泛素延伸蛋白在植物生物学功能中的调控作用及其作用机理还不清楚。本研究克隆了一个本氏烟(Nicotianabenthamiana)泛素延伸蛋白基因,采用病毒诱导的基因沉默(virus induced genesilencing,VIGS)和超表达等多种调节基因表达的技术方法研究了其对本氏烟生长发育、细胞坏死、抗病性和抗逆性等重要生物学功能的调控作用及其作用机理,获得以下主要结果:1.采用RT-PCR方法克隆了一个本氏烟泛素延伸蛋白基因NbUEP。NbUEPcDNA编码区长471 bp。NbUEP蛋白为氨端76个氨基酸的泛素分子和羧端80个氨基酸的s27a 40s类核糖体蛋白分子的融合蛋白。NbUEP与烟草(Nicotianatabacum)UEP基因TUQG3(AJ223329)和本氏烟的一个UEP基因(AY912494)的核苷酸序列同源性最高,一致率分别达96%和91%,分别只有15个和42个核苷酸不同。2.分析了病害抗性诱导剂处理以及病原物接种对NbUEP基因表达的影响。病害抗性诱导剂BTH、SA和乙烯丰处理以及菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)和黑胫病菌(Phytophthora parasitica ***)接种改变了NbUEP基因及其单体NbUBI和NbRLP基因在本氏烟植株中的表达,其中NbUEP基因及其单体NbUBI基因在各种处理后表达改变的动态都很相似。3.采用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默技术分析了NbUEP基因在本氏烟生长发育、坏死和抗病性等方面的生物学功能。发现,NbUEP及其NbUBI序列的基因沉默处理导致植株迅速产生坏死,处理后7-8天导致全株死亡;而NbRLP的沉默处理不导致系统性坏死,但严重抑制了植株的生长和发育,新生叶不能完全扩展,畸形,并完全阻止了Avr4/Cf-4介导的过敏性坏死反应的产生。4.采用瞬时超表达技术分析了NbUEP基因在本氏烟细胞坏死、抗病性及耐盐性等方面的生物学功能。发现,NbUEP基因的超表达导致强烈的本氏烟细胞坏死,但其单体基因NbUbi和NbRLP的超表达则不影响本氏烟细胞坏死。NbUEP基因及NbUbi和NbRLP的超表达增强了本氏烟对黑胫病菌的抗性,但对菌核病菌的抗性没有显著影响。此外,高浓度NaCl抑制了NbUEP超表达介导的细胞坏死。NbUEP及其NbUbi和NbRLP的超表达降低了本氏烟的耐盐性。综上所述,NbUEP基因可能通过其单体产物NbUbi和NbRLP在植物生长发育、细胞坏死、抗病性和抗逆性等重要生物学功能中起重要调控作用。

关键词：泛素延伸蛋白泛素核糖体蛋白坏死抗病性耐盐性本氏烟 Cf Sclerotinia sclerotiorum Phytophthora parasitica var. nicotianae

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烟夜蛾泛素延伸蛋白基因的克隆与表达

农业生物技术学报 2006年第6期14卷 884-888页

作者：涂洪涛安世恒郭线茹罗梅浩吴少英原国辉河南农业大学植物保护学院郑州450002 河南农业大学植物保护学院

应用RT-PCR技术,从烟夜蛾(Helicoverpaassulta)幼虫脂肪体组织总RNA中反转录扩增泛素延伸蛋白基因(ubiqui-tin-53aaextensionprotein,UBE)的cDNA片段,扩增得到的片段全长390bp,编码129个氨基酸残基的蛋白质(GenBank登录号为DQ286557),预测分子量为14.8kD。同源性分析表明,该蛋白在泛素蛋白后融合了一个核糖体L40蛋白(ribosomalL40protein),多重序列比对发现其氨基酸序列与其它真核生物的泛素延伸蛋白氨基酸序列一致性为90%～98%,与棉铃虫核多角体病毒(HaSNPV)泛素的一致性为69%。将烟夜蛾的UBE基因克隆到原核表达载体pGEX-4T-2上,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳检测出约40kD的融合蛋白。

关键词：烟夜蛾泛素延伸蛋白基因克隆原核表达

玉米泛素延伸蛋白ZmERD16的基因克隆与功能分析

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玉米泛素延伸蛋白ZmERD16的基因克隆与功能分析

作者：陆月赏东北农业大学

学位级别：硕士

玉米是重要的粮、经、饲兼用作物。在世界粮食作物中其种植面积和总产量已超过水稻和小麦,处于所有作物之首。低温、干旱、盐碱等逆境条件严重影响玉米的质量和产量,其中水分胁迫是影响玉米产量最主要非生物胁迫因素之一。近年来研究发... 详细信息

玉米是重要的粮、经、饲兼用作物。在世界粮食作物中其种植面积和总产量已超过水稻和小麦,处于所有作物之首。低温、干旱、盐碱等逆境条件严重影响玉米的质量和产量,其中水分胁迫是影响玉米产量最主要非生物胁迫因素之一。近年来研究发现,许多受水分胁迫影响的植物基因在响应多种胁迫中发挥着重要作用。发掘抗旱相关基因及研究抗旱基因在植物逆境信号转导中的调控作用,对于提高水分利用率,节省水资源,减少干旱危害,实现可持续发展,具有重要的现实意义。ERD(early responsive to dehydration)基因是一类对水分胁迫做出快速应答的基因。Kiyosue等最先在拟南芥水分胁迫1小时后分离到16个ERD基因全长cDNA序列,其中包括一个泛素延伸蛋白AtERD16。泛素延伸蛋白可通过降解异常的蛋白而对植物细胞起保护作用。本研究以抗旱玉米自交系CN165为试材,克隆玉米中与拟南芥AtERD16基因序列同源的泛素延伸蛋白基因,命名为ZmERD16。通过生物信息学手段预测该基因结构和序列特点;采用实时荧光定量PCR方法对ZmERD16进行表达谱分析;通过农杆菌转化拟南芥对其进行功能的初步研究。主要研究结果如下:1. ZmERD16基因的克隆应用同源克隆技术从抗旱玉米自交系CN165中得到1个泛素延伸蛋白序列,与AtERD16基因序列高度相似,命名为ZmERD16。同时利用PCR方法得到了ZmERD16的基因组DNA序列3252 bp和其上游启动子序列2190 bp。2. ZmERD16的序列分析在线分析表明ZmERD16的开放阅读框为390 bp,编码129个氨基酸,等电点pI为9.94,分子量为14.7582KD。ZmERD16蛋白包含1个泛素单体蛋白,其后融合了一个53个氨基酸的核糖体多肽,属于ubiquitin/L40泛素延伸蛋白亚族。ZmERD16具有由4个外显子3个内含子构成的基因组结构。3.同源性比对和进化树分析ZmERD16蛋白与其他真核生物中的ubiquitin/L40泛素延伸蛋白序列具有高度同源性。聚类分析将所聚类的植物分为单子叶植物、双子叶植物和绿藻3类,此结果与生物进化有高度的相关性。4.亚细胞定位利用绿色荧光蛋白(GFP)融合蛋白技术来进行洋葱表皮实验,将ZmERD16定位于细胞质和细胞核中。5.顺式作用元件分析该基因的启动子区域具有多个光应答、发育、激素、干旱、病害防御、真菌等胁迫应答元件。6. ZmERD16的表达谱分析利用实时荧光定量PCR对ZmERD16的组织特异性和在不同胁迫条件下的表达谱进行分析,结果显示ZmERD16在正常生长条件下玉米的雌穗、雄穗、幼胚、花丝、穗位叶、幼叶和根中均具有一定量的积累;ZmERD16受盐、脱水、PEG、低温、高温、茉莉酸甲酯和水杨酸等多种胁迫的诱导表达,而不受ABA和类生长素处理诱导表达。7. ZmERD16基因转化野生型拟南芥ZmERD16过表达影响了拟南芥的生长发育,转基因株系的幼苗比野生型的幼苗明显要小,且转基因株系的抽薹期延迟;ZmERD16过表达提高了拟南芥在盐处理条件下的萌芽率和拟南芥在盐和干旱处理下的存活率。

关键词：玉米泛素延伸蛋白克隆逆境胁迫 ZmERD16

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杜仲EuERD16基因的克隆及功能分析

基因组学与应用生物学 2023年第4期42卷 373-383页

作者：李波曾琴赵丹赵德刚贵州大学农业生物工程研究院/生命科学学院山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵阳550025 贵州省农业科学院贵州省生物技术研究所/植物保育技术应用工程研究中心贵阳550006

脱水诱导早期应答(Early Responsive to Dehydration,ERD)基因是在干旱胁迫下可以快速应答的基因。本研究克隆了杜仲(Eucommia ulmoides)EuERD16基因,对其进行生物信息学分析,采用实时定量PCR技术分析EuERD16基因在杜仲不同组织和胁迫... 详细信息

脱水诱导早期应答(Early Responsive to Dehydration,ERD)基因是在干旱胁迫下可以快速应答的基因。本研究克隆了杜仲(Eucommia ulmoides)EuERD16基因,对其进行生物信息学分析,采用实时定量PCR技术分析EuERD16基因在杜仲不同组织和胁迫下的表达情况,进而构建过表达载体,采用农杆菌介导法获得过表达EuERD16基因烟草(Nicotiana tabacum)植株,分析EuERD16基因在烟草中的抗旱功能。结果发现,EuERD16基因的CDS序列长度为387 bp,编码128个氨基酸,与拟南芥(Arabidopsis thaliana)AtERD16序列相似性较高,均为1个泛素单体(76个氨基酸)融合1个60S核糖体亚基L40(52个氨基酸),属于泛素延伸蛋白亚族,该基因启动子区域含有光、干旱和低温等响应元件。在杜仲幼苗中,EuERD16基因在茎和根中表达较高,在成年期杜仲树中,EuERD16基因在3月、5月的雌雄叶和7月的雌果中表达较高,并受到20%PEG6000模拟干旱、蓝光和低温胁迫的信号诱导。干旱胁迫下,转EuERD16基因烟草比野生型烟草的萎蔫程度轻,且其CAT、SOD、POD酶活性和脯氨酸含量显著高于对照组的(P<0.05),H2O2、O2-和MDA含量显著低于对照组的(P<0.05)。结果表明EuERD16参与杜仲干旱胁迫反应,为进一步研究杜仲抗旱分子机制提供了参考。

关键词：杜仲 EuERD16基因泛素延伸蛋白表达分析干旱胁迫

紫萼藓科植物GH120、GH395基因同源序列克隆与进化关系分析

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紫萼藓科植物GH120、GH395基因同源序列克隆与进化关系分析

作者：于冰齐齐哈尔大学

学位级别：硕士

干旱是影响植物生长发育的主要环境因素,在我国干旱已成为制约农业发展的瓶颈。利用生物技术来增强农作物的抗旱性,成为解决干旱问题的有效途径。藓类植物由于特殊而极端的抗逆能力,成为研究抗旱机理和相关基因克隆的模式植物。紫萼藓科... 详细信息

干旱是影响植物生长发育的主要环境因素,在我国干旱已成为制约农业发展的瓶颈。利用生物技术来增强农作物的抗旱性,成为解决干旱问题的有效途径。藓类植物由于特殊而极端的抗逆能力,成为研究抗旱机理和相关基因克隆的模式植物。紫萼藓科（Grimmiaceae）中绝大所数藓类能在环境恶劣的条件下生存,本身有较强的抗性,对它们进行分子生物学的研究,对改良农作物和经济作物有很大的意义。（1）以毛尖紫萼藓（Grimmia pilifera）为实验材料，提取植物的总RNA，根据本实验室构建的毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中得到的泛素延伸蛋白基因EST序列设计引物，利用3’RACE （Rapid Amplification of cDNA End）技术分离克隆到全长cDNA序列，GenBank接收号为JQ659260。序列全长673bp，开放阅读框长471bp，编码156个氨基酸残基。预测该蛋白分子量为17.8kD，理论等电点为9.81，主要分布在细胞核和线粒体基质中。通过BlastP对其编码的氨基酸序列进行比对，结果显示毛尖紫萼藓泛素延伸蛋白与小立碗藓、北美云杉、葡萄、毛果杨的泛素延伸蛋白的同源性均在96％以上。（2）以东亚砂藓（Racomitrium japonicum）为材料，提取植物的总RNA，反转录成cDNA，利用同源序列法，根据毛尖紫萼藓Cu/Zn SOD基因cDNA序列设计特异引物，克隆得到了大小为565bp的基因片段，该片段ORF框长465bp，编码154个氨基酸残基，GenBank接收号为JQ659261。预测该蛋白分子量是15.5kD，理论等电点是5.77。负电荷残基（Asp+Glu）总数为18个，正电荷残基（Arg+Lys）总数为12个，不稳定系数是13.36。其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区，均为铜锌超氧化物歧化酶超家族（Cu-Zn Superoxide Dismutase superfamily），与NCBI数据库中其他植物的Cu/ZnSOD蛋白同源性很高。Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。（3）根据GH395、GH120基因的保守区设计特异引物，在紫萼藓科中的砂藓属、紫萼藓属与连轴藓中，通过RT-PCR在22个种中扩增到GH395基因同源序列，在18个种中扩增到GH120基因同源序列。对它们的核苷酸序列进行比对，发现GH395基因同源序列的核苷酸相似性均在80%以上，GH120基因同源序列的核苷酸相似性均在90%以上。根据这些同源序列构建的系统发育树，可以推测紫萼藓属与连轴藓属在进化过程中的关系较近。细叶连轴藓与紫萼藓属中的直叶紫萼藓、钝叶紫萼藓、卵叶紫萼藓、北方紫萼藓总是聚为一类，说明细叶连轴藓与这四种紫萼藓的植物遗传距离较近。

关键词：紫萼藓科植物泛素延伸蛋白 Cu/Zn超氧化物歧化酶基因克隆序列比对进化分析