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沟叶结缕草耐旱体细胞无性系变异筛选及体细胞胚胎发生分子机制初探

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沟叶结缕草耐旱体细胞无性系变异筛选及体细胞胚胎发生分子机制初...

作者：周认浙江大学

学位级别：硕士

沟叶结缕草[Zoysia matrella(L.)Merr.]茎叶美观纤细,形成的草坪低矮、平整,其耐热、耐践踏,广泛应用于热带、亚热带地区的观赏、休闲及运动场草坪建植。但沟叶结缕草结实率极低,难以通过杂交育种进行性状改良,因此体细胞无性系变异技... 详细信息

沟叶结缕草[Zoysia matrella(L.)Merr.]茎叶美观纤细,形成的草坪低矮、平整,其耐热、耐践踏,广泛应用于热带、亚热带地区的观赏、休闲及运动场草坪建植。但沟叶结缕草结实率极低,难以通过杂交育种进行性状改良,因此体细胞无性系变异技术成为培育新品系的重要途径。本研究以诱导于匍匐茎并已继代培养17年的沟叶结缕草愈伤组织为材料,在再生培养基中添加模拟干旱剂聚乙二醇-6000(polyethylene glycol,PEG),筛选耐旱的再生植株,并探究外源褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺,melatonin,MEL)和表油菜素内酯(epibrassinolide,EBL)对沟叶结缕草体细胞胚胎发生的作用,旨在提高长期继代愈伤组织的再生能力,优化细胞无性系变异筛选体系,获得耐旱沟叶结缕草植株。同时在转录水平上分析其体细胞胚胎发生过程中的基因表达水平并鉴定差异表达基因,筛选潜在的植物激素信号转导(plant hormone signal transduction)途径等,从分子水平初步揭示体细胞胚胎发生发育机制。主要研究结果如下:一、外源褪黑素提高长期继代的沟叶结缕草体细胞胚胎发生能力。继代培养17年的沟叶结缕草愈伤组织,再生率为17.4%。添加0.20 mmol/L MEL对沟叶结缕草愈伤组织的再生能力具有显著的促进作用,再生率达到61.1%,并显著提高其过氧化氢酶(catalase,CAT)活性。二、干旱胁迫显著抑制沟叶结缕草愈伤组织的再生,随着再生培养基中PEG-6000浓度的增加,再生率由17.4%降低至0%。5%、10%PEG胁迫下可获得耐旱性强的再生植株;PEG-6000浓度大于15%时,愈伤组织丧失分化能力,最终褐化死亡。三、干旱胁迫时添加适宜浓度的MEL或EBL促进沟叶结缕草体细胞胚胎发生,10%PEG胁迫时添加0.20 mmol/L MEL为耐旱体细胞无性系变异筛选的最佳组合。在5%～15%PEG胁迫下,添加0.05 mmol/L～0.20 mmol/L MEL或0.05～0.50μmol/L EBL对愈伤组织再生具有恢复作用;10%PEG胁迫时,0.20mmol/L MEL为促进干旱胁迫下愈伤组织再生的最佳浓度,再生率为55.6%。MEL和EBL浓度过高则抑制再生。此外,5%、10%PEG胁迫下添加0.05mmol/L～0.20 mmol/L MEL时,愈伤组织CAT活性显著升高;添加0.05～0.10μmol/L EBL时,愈伤组织过氧化物酶(peroxidase,POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性显著升高,两种外源激素诱发沟叶结缕草再生过程中不同抗氧化酶的响应。四、以非胚性愈伤组织(non-embryogenic callus,NEC)为对照,对体细胞胚胎发生过程中的胚性愈伤组织(embryogenic callus,EC)进行转录组分析,筛选出3620个差异表达基因(DEGs),其中2108个基因上调,1512个基因下调。植物激素信号转导通路中131个相关基因差异表达,涉及细胞分裂素、赤霉素和油菜素内酯的合成,脱落酸、乙烯生成的抑制;97个植物-病原互作通路相关基因,82个苯丙烷生物合成通路相关基因差异表达。WGCNA分析结果表明,再生相关基因SERK、WOX,转录因子AP2/ERF以及抗氧化酶基因CATC、POD1、POD11和Fe SOD调控沟叶结缕草体细胞胚胎发生。本研究优化了沟叶结缕草长期保存的离体再生体系和耐旱变异植株的筛选条件,探究沟叶结缕草体细胞胚胎发育的相关激素信号转导途径、候选基因,为培育沟叶结缕草新种质提供理论依据和技术支撑。

关键词：沟叶结缕草体细胞胚胎发生体细胞无性系变异干旱胁迫转录组

模拟干旱胁迫下褪黑素和表油菜素内酯对沟叶结缕草长期继代培养愈伤组织再生的影响

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浙江大学学报（农业与生命科学版） 2022年第1期48卷 36-44页

作者：周认蔡宇林恬逸柴明良浙江大学农业与生物技术学院杭州310058

本试验探究了外源褪黑素(melatonin, MEL)和表油菜素内酯(epibrassinolide, EBL)对继代培养17年的沟叶结缕草[Zoysia matrella (L.) Merr.]愈伤组织在干旱胁迫下再生的影响,旨在筛选干旱胁迫下提高长期继代培养的愈伤组织再生率的最优浓... 详细信息

本试验探究了外源褪黑素(melatonin, MEL)和表油菜素内酯(epibrassinolide, EBL)对继代培养17年的沟叶结缕草[Zoysia matrella (L.) Merr.]愈伤组织在干旱胁迫下再生的影响,旨在筛选干旱胁迫下提高长期继代培养的愈伤组织再生率的最优浓度,并获得耐旱性强的再生植株。结果表明:0.20 mmol/L MEL能显著促进沟叶结缕草愈伤组织再生,再生率为61.1%。干旱胁迫显著抑制了愈伤组织的再生,随着聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)浓度的增加再生率降低,5%、10%PEG-6000胁迫下可获得耐旱性强的再生植株。在5%~15%PEG-6000胁迫下,添加0.05~0.20 mmol/L MEL或0.05~0.50μmol/L EBL对愈伤组织再生具有恢复作用;在10%PEG-6000胁迫下,0.20 mmol/L MEL是促进干旱胁迫下愈伤组织再生的最佳浓度,再生率为55.6%;MEL和EBL浓度过高则抑制再生。此外,在5%、10%PEG-6000胁迫下添加0.05~0.20 mmol/L MEL时,愈伤组织过氧化氢酶(catalase,CAT)活性显著升高;添加0.05~0.10μmol/L EBL时,愈伤组织过氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性显著升高,2种外源激素诱发沟叶结缕草再生过程中不同抗氧化酶的响应。由此可见,0.05~0.20 mmol/L MEL或0.05~0.10μmol/L EBL对其再生能力具有显著的提升作用。本研究为提高沟叶结缕草长期继代的愈伤组织再生能力以及耐旱植株的筛选提供了新思路。

关键词：沟叶结缕草干旱胁迫褪黑素表油菜素内酯长期继代的愈伤组织抗氧化酶活性

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沟叶结缕草遗传转化体系的建立

热带作物学报 2020年第8期41卷 1566-1573页

作者：王凯汪毅曲爱爱王蕊郭海林李晓慧佘建明宗俊勤李建建刘建秀江苏省中国科学院植物研究所(南京中山植物园) 江苏南京210014

为构建有效的沟叶结缕草遗传转化体系,以沟叶结缕草愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将笔者单位克隆的耐盐相关基因ZmPDI基因转入野生型植株中,研究共培养时间、侵染液浓度、侵染时间和抗生素浓度等因子对转化效率的影响。结果表明... 详细信息

为构建有效的沟叶结缕草遗传转化体系,以沟叶结缕草愈伤组织为受体材料,通过农杆菌介导法将笔者单位克隆的耐盐相关基因ZmPDI基因转入野生型植株中,研究共培养时间、侵染液浓度、侵染时间和抗生素浓度等因子对转化效率的影响。结果表明:最佳遗传转化体系为菌株OD600值为0.4,侵染30 min,共培养3 d后进行选择培养。特美汀在选择培养阶段最适抑菌浓度为250 mg/L,潮霉素愈伤组织筛选的最适选择压力为40 mg/L,苗筛的最适浓度为15 mg/L。通过GUS活性的组织化学分析和PCR鉴定,显示目的基因已成功转入沟叶结缕草基因组中。

关键词：沟叶结缕草蛋白二硫键异构酶(PDI) 根癌农杆菌遗传转化

沟叶结缕草八氢番茄红素基因ZmPSY的克隆、亚细胞定位及表达分析

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草业学报 2017年第11期26卷 69-76页

作者：董笛滕珂于安东檀鹏辉梁小红韩烈保北京林业大学草坪研究所北京100083 北京草业与环境研究发展中心北京100097

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是生物类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶。本实验从沟叶结缕草中克隆得到ZmPSY基因(Genbank登录号为:KY264128)。该基因开放阅读框为1230bp,编码409个氨基酸残基。亚细胞定位结果显示,ZmPSY... 详细信息

八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)是生物类胡萝卜素合成途径中的一个关键酶。本实验从沟叶结缕草中克隆得到ZmPSY基因(Genbank登录号为:KY264128)。该基因开放阅读框为1230bp,编码409个氨基酸残基。亚细胞定位结果显示,ZmPSY定位于叶绿体中。实时荧光定量分析表明,ZmPSY基因在沟叶结缕草幼嫩的叶片中表达量最高。ZmPSY可受外施激素脱落酸(ABA)的诱导,但受外施激素水杨酸(SA)、茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制。本实验为深入研究沟叶结缕草八氢番茄红素合成酶基因的功能奠定了基础。

关键词：沟叶结缕草八氢番茄红素基因克隆亚细胞定位表达分析

沟叶结缕草ZmPSY基因启动子对拟南芥的转化及功能分析

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中国草地学报 2018年第3期40卷 1-7页

作者：于安东滕珂檀鹏辉董笛尚明娟常智慧北京林业大学草坪研究所北京100083 北京草业与环境研究发展中心北京100097

利用染色体步移法克隆得到沟叶结缕草(Zoysia matrella)ZmPSY基因的启动子序列。将ZmPSY起始密码子上游的1512bp的启动子序列与GUS基因融合,构建了ZmPSYpro::GUS载体,并利用农杆菌介导的方法转化拟南芥。经潮霉素筛选和PCR鉴定,共获得8... 详细信息

利用染色体步移法克隆得到沟叶结缕草(Zoysia matrella)ZmPSY基因的启动子序列。将ZmPSY起始密码子上游的1512bp的启动子序列与GUS基因融合,构建了ZmPSYpro::GUS载体,并利用农杆菌介导的方法转化拟南芥。经潮霉素筛选和PCR鉴定,共获得8个转基因株系。GUS染色结果表明,ZmPSY基因启动子能够驱动GUS基因在拟南芥中表达,且集中在茎叶部位。利用荧光定量技术(qRT-PCR)分析了外施激素和非生物胁迫处理下GUS基因的表达量,结果表明:5μM ABA可诱导GUS表达增强,10μM MeJA和黑暗处理抑制GUS表达,而100μM GA3处理无显著变化。研究成功克隆ZmPSY基因的启动子序列,并证明ZmPSY基因的表达可受ABA、MeJA和黑暗处理的调控,为深入研究ZmPSY基因的转录调控提供了依据。

关键词：沟叶结缕草八氢番茄红素合成酶基因启动子 GUS染色

沟叶结缕草蛋白质二硫键异构酶(ZmPDIs)基因家族耐盐功能分析

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草地学报 2018年第5期26卷 1181-1189页

作者：肖晓琳王凯张兵刘建秀江苏省中国科学院植物研究所江苏南京210014

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)及其类蛋白,是硫氧还蛋白超家族的重要成员,具有分子伴侣活性及钙离子结合位点,负责催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构。本研究从沟叶结缕草基因组中鉴定获得了5个蛋白质二硫键... 详细信息

蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomerase,PDI)及其类蛋白,是硫氧还蛋白超家族的重要成员,具有分子伴侣活性及钙离子结合位点,负责催化蛋白质二硫键的氧化、还原和异构。本研究从沟叶结缕草基因组中鉴定获得了5个蛋白质二硫键异构酶(ZmPDIs)基因,对其进行了系统进化与基因结构的生物信息学分析,利用同源基因缺失酵母突变体对其耐盐功能进行了初步分析。荧光定量RT-PCR结果表明5个ZmPDIs基因的表达均受到盐胁迫的诱导。这些结果为进一步研究ZmPDIs的耐盐生理功能及分子机制提供参重要参考。

关键词：蛋白质二硫键异构酶沟叶结缕草生物信息学分析基因表达

水分异质性对克隆植物沟叶结缕草生理和生长的影响

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节水灌溉 2023年第2期 89-95页

作者：蔡烨琳景欣悦朱丁香胡化广张振铭盐城师范学院海洋与生物工程学院江苏盐城224007

以具有6个连续节间的沟叶结缕草的克隆片段为实验材料,母株正常浇水,子株分别种在正常含水量的100%、60%、40%和20%的水分条件下,匍匐茎被切断或连接,处理14 d后通过测定子株的生理和生长指标来研究沟叶结缕草的生理整合方向和特点,以... 详细信息

以具有6个连续节间的沟叶结缕草的克隆片段为实验材料,母株正常浇水,子株分别种在正常含水量的100%、60%、40%和20%的水分条件下,匍匐茎被切断或连接,处理14 d后通过测定子株的生理和生长指标来研究沟叶结缕草的生理整合方向和特点,以期从群体上揭示沟叶结缕草的抗旱机理。结果表明,克隆整合显著降低了水分异质条件下连接子株的超氧阴离子产率、H_(2)O_(2)含量、丙二醛含量和相对电导率,其连接子株的过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性也显著低于断开子株,但匍匐茎连接状态对过氧化物酶(POD)活性没有显著影响。克隆整合促进了子株和克隆片段的生长,子株的根冠比也发生了显著变化,但母株的生长没有受到显著影响。综上所述,在水分异质生境下,沟叶结缕草存在着母株对子株的生理整合作用,有助于缓解干旱胁迫对子株的不利影响。

关键词：水分异质性沟叶结缕草生理生长克隆整合

沟叶结缕草愈伤组织生长及再生对铜胁迫的响应

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核农学报 2015年第1期29卷 161-168页

作者：邵丽达吴艳歌毕波柴明良浙江大学农业与生物技术学院园艺系浙江杭州310058

为探索不同胁迫对沟叶结缕草（Zoysia matrella[L.]Merr.）愈伤组织生长及再生的影响,以继代了9年的胚性愈伤组织为材料,以MS（murashige and skoog）为基本培养基添加不同浓度的铜（Cu2＋）,研究其对继代培养中愈伤组织的直径、鲜重增... 详细信息

为探索不同胁迫对沟叶结缕草（Zoysia matrella[L.]Merr.）愈伤组织生长及再生的影响,以继代了9年的胚性愈伤组织为材料,以MS（murashige and skoog）为基本培养基添加不同浓度的铜（Cu2＋）,研究其对继代培养中愈伤组织的直径、鲜重增长率和再生培养中的植株再生率,以及愈伤组织及再生植株根和叶的过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）和抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性、铜含量、叶绿素含量、丙二醛（MDA）含量的影响。结果表明,在铜浓度为10.0μM时,愈伤组织直径、鲜重增长率、植株再生率及叶绿素含量均达最大值;愈伤组织可生长和再生的铜的临界浓度分别在300.0~500.0μM、50.0~100.0μM间。经长期处理（12周）的愈伤组织和24周再生的植株叶片和根系中,4种抗氧化活性酶活性和MDA含量在10.0μM下均为最低;经短期处理（10 d）的愈伤组织,SOD、POD、APX的活性及MDA含量持续上升,而CAT先上升后下降。愈伤组织、再生植株叶片和根系中铜含量随培养基中铜浓度的升高而增加。本试验为进一步筛选耐铜突变体提供了试验依据。

关键词：沟叶结缕草愈伤组织铜胁迫生理特性

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沟叶结缕草耐铁体细胞变异筛选研究

沟叶结缕草耐铁体细胞变异筛选研究

作者：周雨湾浙江大学

学位级别：硕士

沟叶结缕草（Zoysia matrella（L）Merr.）又名马尼拉草,是禾本科（Gramineae）虎尾草（画眉草）亚科（Chloridoideae）结缕草属（ZoysiaWilld）的一种多年生草本植物。沟叶结缕草是一种非常优良的暖季型草坪草,具有叶片细、颜色绿、绿... 详细信息

沟叶结缕草（Zoysia matrella（L）Merr.）又名马尼拉草,是禾本科（Gramineae）虎尾草（画眉草）亚科（Chloridoideae）结缕草属（ZoysiaWilld）的一种多年生草本植物。沟叶结缕草是一种非常优良的暖季型草坪草,具有叶片细、颜色绿、绿期较长的特点,耐旱性、耐盐碱性、耐荫性均较强,是一种高质量的草坪草,在休憩广场、景点绿化和高尔夫球场的草坪建植中广泛应用,是我国南方大部分地区的主要草坪栽培种。在自然界中,沟叶结缕草的繁殖方法主要是通过匍匍茎,在遗传改良的过程中难以利用杂交育种等的传统手法,因此,体细胞无性系变异这种操作较为简单的方法是筛选沟叶结缕草的抗性植株的有效育种途径。铁是植物正常生长必须的微量元素之一,是植物体合成叶绿素必不可少的元素,也是构成一些酶的成分。植物缺铁时会出现叶片失绿黄化,因此,探索植物体内铁含量与植株绿期的相关性尤为重要。本试验利用继代保存了 8年的沟叶结缕草胚性愈伤组织作为试验材料,研究不同铁浓度胁迫下沟叶结缕草的愈伤组织和再生植株的叶片和根的生理特性,探究离体条件筛选出高耐铁的植株是否田间条件下绿期长。初次筛选时继代培养基中的铁浓度分别为100.0μM（MS基本培养基内的铁浓度）、200.0μM、500.0μM、1000.0μM,进一步筛选耐铁愈伤组织继代培养基中的铁浓度分别为1OO.OμM、200.0μM、550.0LM、650.0μM、750.0μM、850.OμM、950.0μM。经过铁筛选后的愈伤组织接入基本再生培养基中再生培养,经过16周培养,获得少量耐铁植株,而后对植株进行生理生化分析并测定植株体内铁含量。主要研究结果如下:1.经过含有不同浓度的铁的继代培养基处理之后,沟叶结缕草愈伤组织在200.0μM时,其平均直径和鲜重增长率的最大。而愈伤组织的平均直径和鲜重增长率在850.0μM时明显减小。所以愈伤组织的耐铁极限在850.0μM左右。另外,为了更有利于沟叶结缕草的愈伤组织的继代培养和保存,可以相对增加MS基本培养基中的铁含量。2.经过耐铁筛选的愈伤组织在再生培养基中进行再生,在500.OμM浓度下沟叶结缕草生长最好,750.0μM浓度下不能再生。因此铁胁迫下沟叶结缕草再生的耐铁极限为650.0-750.0μM左右。3.铁胁迫下,沟叶结缕草愈伤组织的CAT、POD、SOD抗氧化酶活性以及MDA含量在200.0μM时最低,随后抗氧化酶活性和MDA含量继续上升,直到850.0μM浓度时,几种酶活性和MDA含量又呈下降趋势。4.铁胁迫下,沟叶结缕草再生植株的根和叶片的CAT、POD、SOD抗氧化酶活性以及MDA含量均在500.0μM时最低,而叶绿素含量在500.0μM时达到最大。根中的抗氧化酶、MDA及叶绿素含量都远远小于叶片中的含量。5.随着培养基中的铁浓度的增加,沟叶结缕草的愈伤组织以及再生植株的根和叶片中的铁含量都随着培养基中铁含量的增加而增加。另外本试验研究表明,愈伤组织与再生植株相比,其耐铁胁迫能力更强,而且根中铁的积累高于叶片。6.本试验表明,沟叶结缕草愈伤组织存在对铁的抗性。200.0μM浓度最适宜愈伤组织的继代和保存,500.0μM浓度胁迫后再生的植株生长最好,叶绿素含量较高。但移栽至大田实验,是否能够大批量培养以延长沟叶结缕草绿期还有待后续研究。

关键词：沟叶结缕草铁胁迫体细胞无性系变异绿期