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沙眼衣原体在肠道定殖中的作用机制

中国人兽共患病学报 2023年第4期39卷 390-396页

作者：周倩婷陈虹亮南华大学衡阳医学院附属郴州医院(郴州市第一人民医院)检验科衡阳421001

生殖道沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种最常见的细菌性传播病原体之一。最新研究表明68%的泌尿生殖道Ct核酸阳性的患者中,在其直肠中也能检测到Ct;由于小鼠生殖道感染鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)后与人类生殖道感染C... 详细信息

生殖道沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种最常见的细菌性传播病原体之一。最新研究表明68%的泌尿生殖道Ct核酸阳性的患者中,在其直肠中也能检测到Ct;由于小鼠生殖道感染鼠衣原体(Chlamydia muridarum,Cm)后与人类生殖道感染Ct产生相同的症状,Cm感染动物模型被广泛用于研究Ct的发病机制和免疫途径,研究发现Cm也可以长期定殖小鼠胃肠道。因此,Ct是否可以长期定殖于胃肠道及其作用机制引起众多学者的关注。本文拟对Ct生殖道感染可能播散到机体其他器官的传播途径、Ct主要致病因子及其作用机制作一综述。

关键词：沙眼衣原体肠道定殖作用机制

沙眼衣原体T3SS效应蛋白CT622的表达与多克隆抗体制备以及对HeLa细胞增殖的影响

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中国病原生物学杂志 2022年第1期17卷 81-86页

作者：彭彬峰陈诗诗舒明艺陈恩雷文波刘双全南华大学衡阳医学院附属第一医院检验医学中心湖南衡阳421001 衡阳市中医医院肿瘤内科南华大学衡阳医学院病原生物学研究所湖南省特殊病原体防控重点实验室

目的原核表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT622蛋白,制备CT622多克隆抗体,初步探讨CT622蛋白对HeLa细胞增殖的影响,为进一步阐明CT622蛋白在沙眼衣原体致病中的作用提供实验依据。方法以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载... 详细信息

目的原核表达沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)CT622蛋白,制备CT622多克隆抗体,初步探讨CT622蛋白对HeLa细胞增殖的影响,为进一步阐明CT622蛋白在沙眼衣原体致病中的作用提供实验依据。方法以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经IPTG诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads纯化GST-CT622融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白;将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,经皮下免疫新西兰兔获取抗CT622抗体,采用抗原亲和纯化层析柱进行抗体纯化,BCA测定抗体浓度,SDS-PAGE鉴定多克隆抗体纯度,ELISA检测抗体效价;用不同浓度的CT622蛋白处理HeLa细胞24 h,CCK-8细胞活性检测试剂盒检测细胞存活率(%)。结果成功表达并纯化了CT622蛋白,该蛋白最佳表达条件为IPTG终浓度0.8 mol/L,30℃、180 r/min条件下诱导4 h。制备兔源性抗CT622多克隆抗体,纯化后抗CT622抗体浓度为0.75 mg/ml,纯度>70%,ELISA检测免疫兔血清抗体效价为1∶512000左右;经1~15μg/ml浓度梯度的CT622蛋白处理HeLa细胞后,其细胞存活率高于对照组。结论成功表达、纯化了沙眼衣原体CT622蛋白,制备了高效价兔源性抗CT622抗体。在一定浓度范围内,CT622蛋白能促进HeLa细胞的增殖。

关键词：沙眼衣原体 CT622 原核表达多克隆抗体细胞增殖

Progress in genotyping of Chlamydia trachomatis

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Chinese Medical Journal 2014年第22期127卷 3980-3986页

作者： Xia Yong Xiong Likuan Central Laboratory Shenzhen Baoan Maternal and Child Health Hospital Shenzhen Guangdong 518133 China

Objective To review the common genotyping techniques of Chlamydia trachomatis in terms of their principles,characteristics,applications and limitations.Data sources Data used in this review were mainly from English literatures of PubMed database.The search terms were "Chlamydia trachomatis" and "genotyping".Meanwhile,data from World Health Organization were also cited.Study selection Original articles and reviews relevant to present review's theme were selected.Results Different genotyping techniques were applied on different occasions according to their characteristics,especially in epidemiological studies worldwide,which pushed the study of Chlamydia trachomatis forward greatly.In addition,summaries of some epidemiological studies by genotyping were also included in this work for reference and comparison.Conclusions A clear understanding of common genotyping techniques could be helpful to genotype C.trachomatis more appropriately and effectively.Furthermore,more studies on the association of genotypes of Ch/amydia trachomatis with clinical manifestations should be performed.

关键词：基因分型技术沙眼衣原体世界卫生组织流行病学英文文献临床表现基因型数据库

沙眼衣原体CT622效应蛋白通过激活Erk/p38 MAPK信号通路抑制HeLa细胞凋亡

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沙眼衣原体CT622效应蛋白通过激活Erk/p38 MAPK信号通路抑制HeLa...

作者：彭彬峰南华大学

学位级别：硕士

目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种具有独特二相发育周期的原核细胞微生物,是全世界范围内导致性传播疾病最常见的病原体之一,其感染也是临床上导致不孕不育的主要原因。沙眼衣原体整个生命周期都需寄生于真核细胞内,通... 详细信息

目的:沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是一种具有独特二相发育周期的原核细胞微生物,是全世界范围内导致性传播疾病最常见的病原体之一,其感染也是临床上导致不孕不育的主要原因。沙眼衣原体整个生命周期都需寄生于真核细胞内,通过分泌效应蛋白与宿主细胞相互作用进而操控宿主细胞关键的信号通路,并在感染过程中已进化出有效的策略来抑制宿主细胞的凋亡以完成自身的生长发育。Ⅲ型分泌系统(T3SS)是Ct发挥毒力的关键,并通过分泌效应蛋白介导了与宿主的相互作用,而CT622作为一种T3SS新型的效应蛋白,在Ct感染入侵和生长发育过程有着极为重要的作用,然而,CT622蛋白对宿主细胞增殖、凋亡的影响以及相关信号通路尚不清楚。本研究以HeLa细胞为细胞模型,探讨了沙眼衣原体效应蛋白CT622对宿主细胞凋亡的调控作用,并研究CT622参与调控宿主细胞凋亡途径的关键信号通路,进一步阐明CT622在Ct致病过程中的作用。方法:1.以Ct D型基因组为模板构建原核表达重组载体pGEX-6p-1/CT622;重组载体经 IPTG 诱导表达,Glutathione Sepharose 4B beads 纯化 GST-CT622 融合蛋白,PreScission Protease酶切除GST标签后获取纯化的CT622蛋白。2.将纯化的CT622蛋白去内毒素处理后,分别用PBS以及浓度为 0、5、10、15、20 和 25 μg/mL 的 CT622 刺激 HeLa 细胞 24 h,CCK-8检测细胞存活率(%)。3.用不同浓度梯度的CT622处理HeLa细胞20h,加入肿瘤坏死因子TNF-α凋亡诱导剂继续处理4 h,Western blot检测cleaved caspase-3,Bax和Bcl-2表达水平。用流式细胞术及Hoechst 33258荧光染色检测各组细胞的凋亡情况。4.以最佳浓度的CT622分别处理HeLa细胞0、15、30、60和120 min,Western blot检测p38 MAPK和Erk1/2信号通路的磷酸化情况。5.分别用30μM的PD98059(Erk1/2通路)抑制剂和SB203580(p38 MAPK通路)抑制剂处理HeLa细胞0.5 h,加入CT622刺激20 h,接着加入TNF-α继续处理4 h,检测细胞Caspase-3、Bax以及Bcl-2的表达水平。随后流式细胞术以及Hoechst 33258荧光染色检测加入PD98059或SB203580抑制剂前后各组细胞的凋亡情况。结果:1.经诱导表达及纯化等处理,成功获得CT622蛋白。2.CCK-8结果表明,本研究中制备的CT622蛋白在一定浓度范围内对HeLa无明显毒性作用并对细胞增值起促进作用。3.Western blot结果表示,HeLa细胞经过CT622刺激,其Bcl-2表达水平上调,Cleaved caspase-3和Bax表达水平下调;Hoechst 33258染色结果发现,与对照组相比,HeLa细胞经过CT622刺激后较形态正常,凋亡小体数量少。流式细胞术的结果也发现,经TNF-α处理蛋白组细胞的凋亡率明显低于单纯TNF-α凋亡诱导组(P<0.05)。4.Western blot 检测到经 CT622 刺激后,Erk1/2 和 p38 MAPK 磷酸化水平明显上调。分别抑制Erk1/2和p38 MAPK通路后,使用CT622刺激细胞,流式细胞术及Hoechst 33258染色结果均显示,无论是否经TNF-α处理,CT622刺激细胞后凋亡小体数量增加,且凋亡现象均有所升高。抑制Erk1/2或p38 MAPK通路后,无论是否经TNF-α处理,CT622处理组细胞的Cleaved caspase-3的表达水平和Bax/Bcl-2比值均明显上调。结论:CT622通过激活Erk1/2和p38 MAPK信号通路上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调Bax、Cleaved caspase-3等促凋亡蛋白表达抑制HeLa细胞凋亡。

关键词：沙眼衣原体 CT622效应蛋白 MAPKs信号通路细胞凋亡

沙眼衣原体主要外膜蛋白多肽多克隆抗体的制备与鉴定

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实用医学杂志 2022年第11期38卷 1333-1338页

作者：徐青青陈文韬江银波蓝银苑潘钰莹曾丽红杨建江薛耀华郑和平安徽医科大学广东皮肤病临床学院合肥230032 广东省皮肤病医院广州510091 南方医科大学皮肤病医院广州510091

目的沙眼衣原体主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)在维持沙眼衣原体结构稳定性和衣原体感染宿主细胞过程中发挥重要作用,为深入研究MOMP蛋白的功能及作用机制,使用人工合成多肽制备MOMP多克隆抗体。方法分析沙眼衣原体... 详细信息

目的沙眼衣原体主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)在维持沙眼衣原体结构稳定性和衣原体感染宿主细胞过程中发挥重要作用,为深入研究MOMP蛋白的功能及作用机制,使用人工合成多肽制备MOMP多克隆抗体。方法分析沙眼衣原体MOMP的抗原表位,根据15个沙眼衣原体血清型MOMP保守肽段,设计并合成MOMP特异性肽段,与血蓝蛋白偶联后免疫新西兰兔。采用免疫亲和层析纯化免疫血清,应用SDS-PAGE和ELISA评估血清抗体纯度及效价,利用Western blot和免疫荧光染色鉴定MOMP抗体特异性。结果纯化后的血清IgG抗体纯度为89.6%,MOMP抗体效价达1∶12 800,Western blot结果显示抗体与8个血清型沙眼衣原体蛋白在40 kDa处特异性结合,免疫荧光染色证实该抗体可特异性结合沙眼衣原体。此外,MOMP抗体与进口商品化抗体明显共定位于宿主细胞内,且两种抗体荧光强度相当。结论本研究成功制备效价高、特异性好的沙眼衣原体MOMP的兔多克隆抗体,为后续深入研究MOMP的生物学功能提供了有力工具。

关键词：沙眼衣原体主要外膜蛋白多肽多克隆抗体

沙眼衣原体pORF5质粒蛋白经TLR2激活MAPKs信号通路诱导人单核细胞产生前炎症细胞因子

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中国科学：生命科学 2013年第5期43卷 312-318页

作者：周辉黄秋林李忠玉吴移谋谢小兵马康康曹文娟周洲陆春雪钟光明南华大学医学院病原生物学研究所衡阳421001 湖南中医药大学第一附属医院长沙410007 南华大学第一附属医院衡阳421001 Department of Microbiology and Immunology University of Texas Health Science Center

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起泌尿生殖道感染,导致不孕、异位妊娠等严重并发症.过度的炎症反应被认为是Ct感染造成机体生殖道免疫病理损伤的重要原因,但其具体机制尚不清楚.本研究旨在探讨Ct质粒蛋白pORF5的潜在致炎活性... 详细信息

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)可引起泌尿生殖道感染,导致不孕、异位妊娠等严重并发症.过度的炎症反应被认为是Ct感染造成机体生殖道免疫病理损伤的重要原因,但其具体机制尚不清楚.本研究旨在探讨Ct质粒蛋白pORF5的潜在致炎活性,以及与TLR2和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路的关系.结果表明,pORF5蛋白以剂量和时间依赖方式诱导THP-1细胞产生TNF-α,IL-1β,IL-8等前炎症细胞因子.进一步研究表明,pORF5蛋白能激活p38/MAPK和ERK/MAPK,但不能激活JNK/MAPK;p38/MAPK和ERK/MAPK特异性抑制剂及TLR2抗体能降低前炎症细胞因子产生水平.该研究初步证实,pORF5质粒蛋白经TLR2活化的p38/MAPK和ERK/MAPK通路诱导THP-1细胞产生前炎症细胞因子,pORF5质粒蛋白可能是Ct重要的致病因子,参与Ct炎症病理过程.

关键词：沙眼衣原体 pORF5质粒蛋白丝裂原活化蛋白激酶 TLR2 前炎症细胞因子

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沙眼衣原体分子生物学检测技术进展及应用

中华检验医学杂志 2019年第12期42卷 1067-1071页

作者：邱俊杰熊礼宽暨南大学附属第一医院临床医学检验中心广州510630 深圳市出生缺陷研究重点实验室暨南大学附属深圳市宝安区妇幼保健院中心实验室深圳518100

沙眼衣原体(CT)是临床上引起沙眼和性传播疾病的主要病原体。本文阐述了CT分子生物学检测技术的进展与应用,主要包括荧光定量PCR技术、核酸恒温扩增技术、PCR-杂交技术、测序技术,并比较不同方法的优缺点,同时介绍了CT的即时检验方法。

关键词：沙眼衣原体聚合酶链反应核酸扩增技术微阵列分析多位点测序分型

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沙眼衣原体ClpXP的功能及调控机制研究

沙眼衣原体ClpXP的功能及调控机制研究

作者：马颖中南大学

学位级别：硕士

目的:酪蛋白水解蛋白酶(Caseinolytic protease,Clp)在维持细菌体内蛋白质周转代谢及质量控制方面发挥重要作用。Clp蛋白酶由具有蛋白水解作用的Clp P(Caseinolytic protease proteolytic subunit,Clp P)和一个或多个AAA+家族(ATPases associated with diverse cellular activities)成员组成。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)基因组编码三种AAA+家族蛋白,包括ClpX、Clp C和Clp B。衣原体Clp P(Ct Clp P)不具有独立的肽酶或蛋白酶活性,也不能被ClpX激活;只有Clp P1和Clp P2结合成十四聚体,并与ClpX结合形成ClpXP复合物时才被赋予蛋白酶水解活性。Ct Clp这一独特的蛋白酶特性在其生活周期中发挥的生物学功能及机制尚不清楚。本研究拟筛选并鉴定与CtClpX相互作用的靶蛋白,初步探讨Ct ClpXP在Ct感染及致病中的作用,为防治Ct感染提供新的靶点。方法:(1)以pGEX-4T-1为载体,构建L2型沙眼衣原体ClpX原核重组表达质粒pGEX-4T-1/CtClpX,在大肠杆菌BL21(DE3)中表达CtClpX重组蛋白。(2)CtClpX重组蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,ELISA检测抗体效价,Western-Blot检测抗体特异性。(3)免疫共沉淀(Co-IP)及高效液相色谱-质谱联用技术(LC-MS/MS)构建差异蛋白表达数据库;应用在线Metascape、STRING分析软件对差异蛋白进行GO(基因本体)分子功能注释、KEGG信号通路分析及蛋白相互作用分析,筛选并预测Ct ClpXP调控的下游靶蛋白。(4)通过药物筛选,进一步探究Ct ClpXP及其蛋白底物参与的调控通路与机制。结果:(1)成功构建原核重组表达质粒pGEX-4T-1/CtClpX。(2)IPTG诱导重组质粒在大肠杆菌BL21中表达出融合蛋白,纯化产物经考马斯亮蓝染色显示产物分子量约53 k Da,与预期分子量一致。(3)成功制备兔源性CtClpX多克隆抗体,Western Blot验证抗体可与CtClpX特异性结合,ELISA检测抗体效价高达1:25600。(4)Co-IP与LC-MS/MS联用技术在衣原体发育中期(感染后18 h左右)鉴定了1067个与ClpX结合的衣原体蛋白。经生物信息学分析,CtClpX结合的蛋白主要参与了r RNA加工、翻译启动、细胞间黏附、病毒转录等多种生物学过程,参与poly(A)RNA结合及蛋白质结合的分子功能,这些CtClpX结合的蛋白主要位于细胞膜、胞质、核成分以及细胞外泌体等部位,且主要涉及RNA转运、剪接体、核糖体、碳代谢及胺酰t RNA生物合成等相关通路,并经蛋白质-蛋白质相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析筛选了七种(SdhA、Pdh B、GatC、Pkn1、Dut、Zwf、Aro C)与Ct ClpXP存在直接或间接作用的蛋白。(5)药物筛选获得了抑制Ct ClpXP表达的药物头孢美唑,经Giemsa染色和免疫荧光染色发现该药物抑制Ct的生长繁殖能力,如影响Ct包涵体的形态、子代EBs增殖分化及再感染能力;以Real-time PCR检测ClpXP互作蛋白基因的表达水平,结果表明该药物作用下SdhA及GatC表达量呈浓度依赖降低,且宿主细胞自噬水平随浓度增加而升高。结论:(1)初步筛选鉴定出1067个与CtClpX结合的衣原体蛋白质,他们大多属于膜蛋白和胞质内成分,与r RNA加工、翻译启动、细胞间黏附、病毒转录等多种生物学过程有关,参与poly(A)RNA及蛋白质结合的分子功能,并显著富集于RNA转运、剪接体、核糖体、碳代谢及胺酰t RNA生物合成等相关通路上,并筛选得到七种与CtClpX具有相互作用的沙眼衣原体蛋白。(2)Ct ClpXP表达被抑制后,影响Ct的生长和繁殖能力,并诱导宿主细胞发生自噬。Ct ClpXP可能参与SdhA、GatC介导的Ct能量代谢、t RNA转运通路。图22幅,表10个,参考文献86篇

关键词：沙眼衣原体 ClpXP 免疫共沉淀 LC-MS/MS 头孢美唑 SdhA GatC

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沙眼衣原体Ⅲ型分泌系统效应蛋白研究进展

中国人兽共患病学报 2021年第1期37卷 78-82,98页

作者：张荣荣高哲贾天军河北北方学院临床检验诊断学重点实验室张家口075000

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是专性细胞内致病菌,主要通过Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)直接将效应蛋白分泌到宿主细胞。T3SS效应蛋白在Ct发育以及与宿主细胞相互作用中发挥重要作用,如调节宿主细胞肌动蛋白... 详细信息

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,Ct)是专性细胞内致病菌,主要通过Ⅲ型分泌系统(type Ⅲ secretion system,T3SS)直接将效应蛋白分泌到宿主细胞。T3SS效应蛋白在Ct发育以及与宿主细胞相互作用中发挥重要作用,如调节宿主细胞肌动蛋白骨架、破坏免疫信号通路以及控制宿主细胞凋亡等。本文综述了沙眼衣原体T3SS效应蛋白最新研究进展。

关键词：沙眼衣原体 Ⅲ型分泌系统效应蛋白