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烟草Bax inhibitor-1基因植物沉默表达载体的构建及对农杆菌的转化

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东北农业大学学报 2010年第1期41卷 67-72页

作者：谢萌朱文华林宇恒杨明瑜马秋敏田慧琴曲桂芹中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分... 详细信息

试验首先对质粒pGSA1285进行改造,将pFGC5941质粒的查尔酮合酶的Intron片段取代pGSA1285的GUS片段,构建含有内含子并具有卡那抗性的pGSA2285植物沉默表达载体。同时设计引物、PCR扩增、在BI-1基因两端各加上两个酶切位点,将BI-1基因分别反向、正向插入改造后的质粒pGSA2285Intron片段两端的多克隆位点中,构建得到烟草BI-1基因沉默载体pGSA4285。此沉默质粒经PCR鉴定、限制性酶切分析以及回复动员试验证明已正确构建并成功转入农杆菌,为获得含有BI-1基因沉默烟草植株及其在植物程序性死亡中调控作用的研究奠定试验基础。

关键词： Bax inhibitor 沉默载体 ihpRNA PCD

青岛百合LtXTH5的克隆及VIGS表达载体构建

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北方园艺 2020年第15期 74-81页

作者：池秀凤姜新强李岩硕李伟王奎玲刘庆华青岛农业大学园林与林学院山东青岛266109

以青岛百合(Lilium tsingtauense)的花被片作为试材,采用了RT-PCR的方法从青岛百合中分离到LtXTH5基因,并进行生物信息学分析和病毒诱导沉默表达载体的构建,研究了花发育基因LtXTH5的基本理化性质和载体构建方法,以期为后期LtXTH5生物... 详细信息

以青岛百合(Lilium tsingtauense)的花被片作为试材,采用了RT-PCR的方法从青岛百合中分离到LtXTH5基因,并进行生物信息学分析和病毒诱导沉默表达载体的构建,研究了花发育基因LtXTH5的基本理化性质和载体构建方法,以期为后期LtXTH5生物学功能的验证奠定基础。结果表明:LtXTH5基因(登录号MN245449)的开放阅读框包含882 bp,编码293个氨基酸;生物信息学分析预测LtXTH5蛋白相对分子量为33.8 kDa,分子式为C(1536)H(2283)N(407)O(436)S(12),理论等电点(pI)为7.03,脂肪指数68.23,不稳定指数为31.68,LtXTH5是亲水性蛋白,具有信号肽;基序分析发现不同植物XTH中的保守基序数目不同,LtXTH5含有9个基序;序列比对结果表明LtXTH5氨基酸序列含有DEIDFEFLG催化活性位点和GH16XET结构域,是典型的XTH家族成员;系统进化树分析表明LtXTH5与拟南芥AtXTH5亲缘关系最近,属于I/II亚家族,并且具有转糖基酶或水解酶活性。利用LtXTH5的5′端537 bp片段和pTRV2载体质粒成功构建了沉默载体(TRV2-LtXTH5),并将TRV2-LtXTH5载体成功转至农杆菌GV3101中,下一步拟用已转入TRV2-LtXTH5载体的农杆菌菌液对烟草进行侵染,进一步探究LtXTH5基因的功能。

关键词：青岛百合 LtXTH5 克隆序列分析沉默载体

转录因子SlMYB-related 2对番茄耐冷性的影响

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华北农学报 2022年第1期37卷 35-41页

作者：吴红红段学粉郭仰东张喜春北京农学院植物科学技术学院北京市蔬菜遗传育种与生物技术实验室北京102206 中国农业大学园艺学院北京100094

番茄属于冷敏感模式植物,在生长过程中极易受冷害进而影响其产量。为进一步揭示番茄植株抗寒的分子机制以及对选育番茄抗寒品种提供理论依据,以蔬菜遗传育种与生物技术实验室种质资源编号25的番茄品种为材料、番茄转录因子SlMYB-relate... 详细信息

番茄属于冷敏感模式植物,在生长过程中极易受冷害进而影响其产量。为进一步揭示番茄植株抗寒的分子机制以及对选育番茄抗寒品种提供理论依据,以蔬菜遗传育种与生物技术实验室种质资源编号25的番茄品种为材料、番茄转录因子SlMYB-related 2为研究对象,基于CRISPR/Cas9基因敲除载体,通过农杆菌转化法转化获得番茄阳性植株;构建VIGS瞬时沉默表达载体,以野生型和未插入目的基因片段的病毒转化植株为对照,将3组植株进行4℃(16 h光照/8 h黑暗处理,60%湿度)低温处理后,测定抗冷相关生理指标的含量,比较其耐寒性。结果表明,构建了CRISPR/Cas9基因敲除载体,共获得了CRISPR沉默阳性植株2株;构建了VIGS沉默表达载体,经低温处理后发现,随着低温处理时间的延长,SlMYB-related 2基因转化组番茄植株的脯氨酸和可溶性糖的增长趋势比对照番茄组(野生型携带TRV空载,CK)和野生组(WT)慢,且含量低于CK组和野生组,但丙二醛含量高于CK组和野生组,证明VIGS瞬时表达番茄植株抗寒性显著低于CK组和野生组。通过对基因瞬时沉默表达后番茄植株的抗寒性分析,发现SlMYB-related 2基因在低温胁迫中起到了正调控作用。

关键词：番茄 MYB转录因子 VIGS CRISPR/Cas9 沉默载体遗传转化

叶用莴苣无缝克隆构建LsE3基因过表达载体和新RNAi载体及遗传转化体系优化

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中国农学通报 2021年第11期37卷 15-23页

作者：王婷甄孙燕川唐文琨范双喜郝敬虹北京农学院植物科学技术学院/农业应用新技术北京市重点实验室北京102206

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制。以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系。试验成... 详细信息

研究旨在应用新技术和新载体构建过表达和沉默载体,优化遗传转化体系,验证生菜LsE3基因功能,探究高温抽薹机制。以pCAMBIA1304和pFGC5941载体为材料,通过无缝克隆构建叶用莴苣转基因载体,并通过筛选培养基配方优化遗传转化体系。试验成功地以p CAMBIA1304为基础,插入源自pFGC5941的dsRNA表达框序列,获得了新RNAi空载pCAMBIA1304-FGC5941,构建了LsE3沉默载体,并成功以双元质粒载体pCAMBIA1304构建了LsE3过表达载体。试验对易抽薹叶用莴苣品种‘GB-31’进行潮霉素浓度、直接芽诱导培养基配方和生根培养基配方的筛选,确立了潮霉素适宜筛选浓度为5 mg/L,并确立了最优培养芽诱导和生根培养基配方。试验成功获得新RNAi空载并构建了转基因载体,优化了遗传转化体系,为解决载体构建繁琐复杂的问题提供新思路,并奠定了生菜转基因技术的基础。

关键词：叶用莴苣高温抽薹 LsE3泛素连接酶沉默载体载体构建过表达 RNAi 遗传转化

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病毒诱导的基因沉默在植物中的应用现状

北方园艺 2012年第4期 171-173页

作者：刘海萍中国农业大学食品科学与营养工程学院北京100083

传统的病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是一种小干扰RNA(Small interfering RNAs,siRNA)介导的RNA沉默技术(SIR VIGS),作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定。另外,VIGS技术开始用来研... 详细信息

传统的病毒诱导的基因沉默(Virus induced gene silencing,VIGS)是一种小干扰RNA(Small interfering RNAs,siRNA)介导的RNA沉默技术(SIR VIGS),作为一种有效的反向遗传学技术广泛的用于植物基因组功能的鉴定。另外,VIGS技术开始用来研究植物内源miRNA(microRNA)的功能,这为miRNA的功能研究提供了快速有效的方法。随着基因沉默技术的应用和改进,将会有越来越多的植物基因组功能得到快速有效的验证。

关键词：病毒诱导的基因沉默沉默载体小干扰RNA miRNA