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汉滩病毒糖蛋白Gn的T细胞表位预测及其跨种属验证

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解放军医学杂志 2023年第9期48卷 1000-1010页

作者：孙报增秦聪聪张俊琦王永凯张文标刘瑞波白天原张志辉张宇丝杨琨姜东伯空军军医大学基础医学院免疫学教研室陕西西安710032 空军军医大学基础医学院生物武器损伤防治药物重点实验室陕西西安710032 空军医科大学唐都医院风湿科陕西西安710032 空军军医大学基础医学院微生物学教研室陕西西安710032

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法通过UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列。采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep算法预测表位亲和力,VaxiJen v2.0分析免疫... 详细信息

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法通过UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列。采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep算法预测表位亲和力,VaxiJen v2.0分析免疫原性,Blastp工具计算保守性,HPEPDOCK和EpiDOCK模拟pMHC对接,TBtools进行双向聚类分析,酶联免疫斑点(ELISpot)实验评价表位细胞免疫反应性。结果通过UniProt数据库获得了HTNV 76-118株Gn蛋白序列(PRO_0000036816)。整合5种亲和力算法,在小鼠H-2亚型中获得了61个优势表位,在人主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ亚型中得到234个优势表位,MHC-Ⅱ亚型中得到212个优势表位;VaxiJen筛选分别获得H-2、MHC-Ⅰ、MHC-Ⅱ亚型强免疫原性优势表位23、110、42个;进一步采用Blastp筛选获得高亲和力、强免疫原性、种间种内保守的MHC-Ⅰ类限制性表位3个,MHC-Ⅱ类限制性表位81个。双向分层聚类分析揭示了小鼠H2-d、H2-b和部分人类白细胞分化抗原(HLA)在提呈HTNV Gn表位上的相似性。ELISpot验证了5个表位具有较强的诱导脾细胞分泌γ干扰素(IFN-γ)的能力。结论预测并验证了HTNV Gn上的细胞免疫反应性表位,证实在MHC提呈中病毒抗原存在跨基因、种属、物种的交叉免疫反应性,为预防肾综合征出血热(HFRS)提供了新思路。

关键词：汉滩病毒糖蛋白表位计算机预测免疫反应性

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汉滩病毒Gc的细胞免疫反应性评估和验证

陆军军医大学学报 2023年第19期45卷 2007-2017页

作者：谢明阳孙报增马思婕杨端罗程王越越曹宇宸康文龙张赟杨琨姜东伯空军军医大学基础医学院免疫学教研室西安710032 中国人民武装警察部队江西总队鹰潭支队江西鹰潭335000

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒包膜糖蛋白C末端(Hantaan virus glycoprotein C-terminal,HTNV Gc)上免疫反应性表位。方法在预测覆盖率超过全球98%人群主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因基础上,通过免疫... 详细信息

目的筛选、鉴定并验证汉滩病毒包膜糖蛋白C末端(Hantaan virus glycoprotein C-terminal,HTNV Gc)上免疫反应性表位。方法在预测覆盖率超过全球98%人群主要组织相容性复合物(major histocompatibility complex,MHC)基因基础上,通过免疫表位数据库(Immune Epitope Database,IEDB)、丹麦技术大学(Technical University of Denmark,DTU)等免疫信息学前沿算法系统分析HTNV Gc上9肽和15肽表位的亲和力,使用Vaxijen工具分析免疫原性,使用Blastp工具分析种间种内保守性;双向层次聚类比较MHC-Ⅰ类和Ⅱ类限制性表位的交叉免疫反应性;使用分子对接模拟出优势表位与MHC对接的可能结果;通过酶联免疫斑点(ELISpot)实验验证计算机分析结果。结果将多种生物信息学算法结果整合后,获得高亲和力、种间种内保守和强免疫原性的9肽和15肽表位,分别为8和80个,其中人鼠共同优势表位8个;聚类分析证明H-2基因型与HLA基因型存在部分相似;分子对接结果模拟出下优势表位与多个MHC基因型对接良好,且与亲和力分析结果一致;在非优势表位对比下,优势表位组小鼠脾细胞分泌IFN-γ的量更高。结论使用多种生物信息学算法成功筛选出HTNV Gc上优势表位,并通过ELISpot实验鉴定了上述表位的细胞免疫反应性。

关键词：汉滩病毒糖蛋白表位计算机预测免疫反应性

汉滩病毒糖蛋白Gn的T细胞表位预测及跨种属验证

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解放军医学杂志 2023年

作者：孙报增秦聪聪张俊琦王永凯张文标刘瑞波白天原张志辉张宇丝杨琨姜东伯空军医科大学唐都医院风湿科空军军医大学基础医学院免疫学教研室空军军医大学基础医学院微生物学教研室空军军医大学基础医学院生物武器损伤防治药物重点实验室

目的　筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法　UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列；采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep预测表位亲和力；VaxiJen分析免疫原性；Bla... 详细信息

目的　筛选、鉴定并验证汉滩病毒(HTNV)包膜糖蛋白-N末端(Gn)上的免疫反应性表位。方法　UniProt数据库获取HTNV 76-118株Gn蛋白序列；采用IEDB、SMMPMBEC、NetMHCpan 4.1、SYFPEITHI、Rankpep预测表位亲和力；VaxiJen分析免疫原性；Blastp计算保守性；HPEPDOCK和EpiDOCK模拟pMHC对接；TBtools进行双向聚类分析；酶联免疫斑点(ELISpot)实验评价表位细胞免疫反应性。结果　UniProt数据库获得HTNV 76-118株Gn蛋白序列(PRO＿0000036816)；整合5种亲和力算法在小鼠H-2亚型中获得了61个优势表位，在人主要组织相容性复合物(MHC)-Ⅰ亚型中得到234个优势表位，MHC-Ⅱ亚型中得到212个优势表位；VaxiJen筛选分别获得H-2、MHC-I、MHC-II亚型强免疫原性优势表位23、110、42个；进一步Blastp筛选获得高亲和力、强免疫原性、种间种内保守MHC-Ⅰ类限制性表位3条，MHC-Ⅱ类限制性表位81条。双向分层聚类分析揭示了在H2-d、H2-b小鼠和部分人类白细胞分化抗原(HLA)在提呈HTNV Gn表位的相似性。ELISpot验证了5条表位可较强诱导脾细胞分泌IFN-γ能力。结论　预测并验证了HTNV Gn上的细胞免疫反应性表位，证实在MHC提呈中病毒抗原存在跨基因、种属、物种的交叉免疫反应性，为预防肾综合征出血热(HFRS)提供了新思路。

关键词：汉滩病毒糖蛋白表位计算机预测免疫反应性

2019—2022年河南省肾综合征出血热宿主动物监测情况分析

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中华预防医学杂志 2024年第1期58卷 18-24页

作者：李东晓范威朱琳胡晓李懿马红霞王海峰叶莹苏佳黄学勇河南省疾病预防控制中心传染病预防控制所郑州450016

目的分析2019—2022年河南省肾综合征出血热(HFRS)宿主动物分布及携带汉坦病毒(HV)情况。方法在河南省HFRS监测点开展宿主动物监测,采用实时荧光定量PCR法检测鼠肺HV,分析河南省鼠类动物携带HV型别,对阳性样本进行测序,分析核苷酸序列... 详细信息

目的分析2019—2022年河南省肾综合征出血热(HFRS)宿主动物分布及携带汉坦病毒(HV)情况。方法在河南省HFRS监测点开展宿主动物监测,采用实时荧光定量PCR法检测鼠肺HV,分析河南省鼠类动物携带HV型别,对阳性样本进行测序,分析核苷酸序列的同源性及变异情况。结果2019—2022年共捕鼠1308只,16份鼠肺HV核酸阳性,鼠HV阳性率为1.22%(16/1308)。按种类,黑线姬鼠HV阳性率最高(68.75%,11/16)。按分布地,野外鼠HV阳性率最高(2.50%,12/480),居民区鼠HV阳性率为0.53%(4/759)。16份阳性样本分型结果显示,所携带的病毒均属于Ⅰ型汉滩病毒。阳性样本测序后获得8条S基因片段(OQ681444~OQ681451)和6条M基因片段(OQ681438~OQ681443);S和M基因片段与陕西84FLi株、四川SN7株相似性较高。S和M基因片段系统进化分析显示,均为汉滩病毒H5基因亚型。氨基酸序列分析显示,与汉滩病毒疫苗株84FLi相比,8条S片段编码氨基酸第74位由天冬酰胺替换为丝氨酸;XC2022047株在Gn区第14位由色氨酸替换为甘氨酸,XC2022022和XC2022024第359位由异亮氨酸替换为丙氨酸。结论2019—2022年河南省宿主动物携带HV属于Ⅰ型汉滩病毒,黑线姬鼠仍然是汉滩病毒的优势宿主。同疫苗株比较,S和M基因片段的免疫表位区均有氨基酸位点替换。

关键词：肾综合征出血热监测汉坦病毒黑线姬鼠汉滩病毒

汉滩病毒蛋白HLA-E*01限制性CTL表位鉴定及其在肾综合征出血热中的作用机制研究

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汉滩病毒蛋白HLA-E*01限制性CTL表位鉴定及其在肾综合征出血热中...

作者：李昕瑜延安大学

学位级别：硕士

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染引起的肾综合征出血热是一个严重的公共卫生问题,合理地防治由HTNV所致的病症是全球公共卫生关注的焦点。而人类白细胞抗原-E(human leucocyte antigen HLA-E)限制的特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T l... 详细信息

汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染引起的肾综合征出血热是一个严重的公共卫生问题,合理地防治由HTNV所致的病症是全球公共卫生关注的焦点。而人类白细胞抗原-E(human leucocyte antigen HLA-E)限制的特异性细胞毒性T细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)免疫应答对HTNV的抵抗与消除必不可少,而且还与病情的发生进展有关。因此,我们基于HLA-E*01限制的HTNV表位肽,合成了HLA-E/肽四聚体,并通过流式细胞术分析了HLA-E*01肾综合征出血热(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS)患者外周血单个核细胞(periphral blood mononuclear cell,PBMC)中,HLA-E*01限制的HTNV表位特异性CTL频率和功能,及其与病情、病程的关系。本课题组鉴定了HTNV来源的HLA-E*01限制性CTL表位,并揭示了HLA-E*01限制的HTNV特异性CTL应答特点,为临床预防、诊断和治疗肾综合征出血热提供了新的思路和方法,也为进一步研发CTL表位多肽疫苗提供了实验数据支撑。为此,我们进行了如下研究:目的:1.研究HLA-E*01限制的HTNV表位特异性CTL的频率其与病情的相关性。2.研究HLA-E*01限制的HTNV表位特异性CTL的功能其与病情的相关性。3.检测HFRS血浆中氨基末端pro脑钠肽(N-terminal pro-brain natriuretic peptide,NT-pro BNP)水平及其应用于临床评价。方法:1.利用流式细胞术检测HFRS患者PBMC中HLA-E*01表位特异性CTL频率,明确CTL频率与患者病情病期的关系。2.利用流式细胞术结合胞内细胞因子染色的方法检测患者HFRS患者PBMC中,HLA-E*01表位特异性CTL分泌肿瘤坏死因子-α(Tumour Necrosis Factor-a,TNF-α、干扰素-γ(Interferon-γ,IFN-γ)、颗粒酶B(Granzyme B,Gr B)和穿孔素(perforin)的水平,并分析其分泌水平与患者病情的关系。3.利用酶联斑点吸附实验进一步检测HFRS患者PBMC中,HLA-E*01表位特异性CTL分泌Granzyme B水平,并分析不同表位肽特异性CTL分泌Granzyme B水平与病情的关系。4.酶联免疫吸附实验检测HFRS患者血清中NT-pro BNP水平,分析其水平与患者病情病期的关系以及临床参数的相关性。结果:1.轻型/中型与重型/危重型HFRS患者PBMC中,HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL频率比较无显著差异;急性期HFRS患者PBMC中,HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL频率高于恢复期HFRS患者。2.重型/危重型HFRS患者PBMC中,HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL应答产生的IFN-γ和Granzyme B表达水平高于轻型/中型HFRS患者;而重型/危重型和轻型/中型HFRS患者PBMC中,HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL应答产生的TNF-α和perforin的表达水平无显著差异。3.检测的所有HFRS患者HLA-E*01限制性HTNV表位均能产生特异性CTL应答,其CTL应答可分泌Granzyme B;轻型/中型HFRS患者中,HLA-E*01限制性ILLKALYML、YLRQRQVAL、QLGQRIIVL和MMKSCLIAL(氨基酸序列)表位特异性CTL频率以及分泌Granzyme B水平高于重型/危重型HFRS患者;ILWTGMIDL、VILTKTLVI和FLLVLESIL 3种表位特异性CTL频率以及分泌的Granzyme B水平与HFRS患者病情无相关性。4.HFRS患者血浆中NT-pro BNP水平与患者病程密切相关,在HFRS患者急性期时水平升高,在少尿期达到峰值,且在患者急性期NT-pro BNP水平显著高于恢复期;此外,HFRS患者血浆中NT-pro BNP水平高于正常人血浆NT-pro BNP水平;患者血浆NT-pro BNP水平与尿素氮(blood urea nitrogen,BNU)和血肌酐(Blood creatinine,SCr)含量呈正相关,而与血小板(platelet,PLT)、白细胞计数(white blood cell count,WBC)和白蛋白(Albumin,ALB)水平呈负相关。结论:1.HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL频率与病情无相关,而与病期相关,在患者急性期时,HLA-E*01限制性HTNV表位特异性CTL频率相对较高。2.HLA-E*01限制性HTNV表位特异性诱导CTL表达IFN-γ和Granzyme B水平在重型/危重型患者表达水平增加,而HLA-E*01限制性

关键词：汉滩病毒肾综合征出血热 HLA-E CD8+T细胞表位糖蛋白核蛋白 T细胞应答

SFTS病毒、登革病毒、汉滩病毒快速荧光定量RT-PCR检测方法的建立及评价

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中华实验和临床病毒学杂志 2022年第2期36卷 230-235页

作者：胡停停朱禹李阿茜孙丽娜黄晓霞芜为李川王芹李建东李德新王世文柳燕梁米芳王晓芳中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所国家卫生健康委生物安全重点实验室北京102206 安徽医科大学合肥230032

目的建立针对发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)、登革病毒(dengue virus,DENV)、汉滩病毒(hantaan virus,HTNV)三种常见病毒性出血热病毒的现场应急快速检测方法。方法基于传统的TaqMan荧光探针技术,利用国产快速一步法RT-PCR试剂盒,结合magnetic induction cycler(Mic)qPCR仪,建立三种常见病毒性出血热病毒的快速荧光定量RT-PCR检测方法。利用三种病毒体外转录RNA及模拟样本、其他相关病毒临床样本及健康人血标本进行灵敏度、特异性、重复性验证。结果相较于传统的实时荧光定量RT-PCR方法,此方法所需时间大大缩短,可在35 min内完成检测。SFTSV、DENV、HTNV的最低检出限均小于100拷贝/PCR,与模拟对照样本及其他病毒临床样本无交叉反应,模拟阳性样本验证均可检出,且各组验证结果的Ct值变异系数均小于4%。结论本研究建立的快速荧光定量RT-PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性。对于现场应急检测和媒介生物标本筛查具有一定的应用前景。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒登革病毒汉滩病毒快速荧光定量RT-PCR

汉滩病毒G_2重组腺病毒的表达及其基因免疫的研究

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第4期21卷 415-417页

作者：吴兴安于澜胡刚张芳琳白文涛史梦远徐志凯第四军医大学基础部微生物学教研室陕西西安710032

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、... 详细信息

目的:在VeroE6细胞中表达汉滩病毒(HTNV)囊膜糖蛋白G2重组腺病毒(AdenoG2),并探讨其诱导免疫应答特性。方法:以HTNVAdenoG2病毒原种(滴度约1×1013pfu/L)感染VeroE6细胞,用IFA法检测其表达产物。以表达产物免疫BALB/c小鼠后,用ELISA、微量细胞培养中和试验及淋巴细胞增殖试验检测体液及细胞免疫应答。结果:用HTNVAdenoG2感染VeroE6细胞后,可检测到HTNV糖蛋白G2的表达。用HTNVAdenoG2免疫小鼠后,可诱导产生抗HTNV糖蛋白G2的特异性抗体,抗体效价为1∶40。微量细胞培养中和试验的结果表明,HTNVAdenoG2还可刺激小鼠产生低水平的中和抗体;但淋巴细胞的增殖反应不明显。结论:在VeroE6细胞中成功地表达了HTNV糖蛋白G2。以HTNVAdenoG2免疫小鼠后,主要刺激小鼠产生特异性的抗HTNV体液免疫应答,而特异性的细胞免疫应答不明显。本研究结果为HTNV基因工程疫苗的研制提供了实验依据。

关键词：汉滩病毒糖蛋白G2 重组腺病毒免疫

汉滩病毒核蛋白T细胞表位的鉴定及其特异性T细胞应答规律的初步探讨

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细胞与分子免疫学杂志 2005年第6期21卷 704-706页

作者：王美亮朱勇王九平刘京梅方亮金伯泉第四军医大学基础部免疫学教研室陕西西安710032 第四军医大学唐都医院全军感染病诊疗中心陕西西安710038

目的:鉴定引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒核蛋白(HTNV-NP)的T细胞表位,并探讨其特异性T细胞应答的规律。方法:合成覆盖HTNV-NP全长序列的全套部份重叠15肽,用ELISPOT方法筛选能刺激HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的15肽... 详细信息

目的:鉴定引起肾综合征出血热(HFRS)的汉滩病毒核蛋白(HTNV-NP)的T细胞表位,并探讨其特异性T细胞应答的规律。方法:合成覆盖HTNV-NP全长序列的全套部份重叠15肽,用ELISPOT方法筛选能刺激HFRS患者外周血单个核细胞(PBMC)产生IFN-γ的15肽,并测定其特异性T细胞的频率。结果:47例HFRS患者中,有18例可对HTNV-NP产生特异性T细胞应答,并发现在病程的早期就已开始产生T细胞应答。从11例患者PBMC中,鉴定出了17种HTNV-NP特异的T细胞表位,其中14种T细胞表位为首次报道,T细胞表位主要位于NP一级结构的中部。结论:HFRS病程早期即可产生特异性T细胞应答,T细胞表位主要位于NP序列的中部,T细胞应答可能在汉滩病毒感染过程中起重要的免疫保护作用。

关键词：肾综合征出血热汉滩病毒核蛋白 T细胞表位

利用CRISPR/Cas9技术建立STAT1敲除细胞系及其功能验证

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病毒学报 2024年第3期40卷 519-527页

作者：张俊梅王芳应旗康冯文杰古天乐吴兴安空军军医大学基础医学院微生物与病原生物学教研室西安710032 延安大学生命科学学院延安716000

信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制... 详细信息

信号转导和转录活化因子1(Signal transducer and activator of transcription 1,STAT1)是干扰素信号通路中的关键分子,在对抗病毒和其他病原体的免疫反应中发挥重要作用,构建STAT1敲除细胞系有助于研究其在病毒感染过程中的作用与机制。本研究利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)基因编辑技术构建STAT1基因敲除细胞系。首先构建STAT1基因特异性打靶载体,后通过慢病毒转导人非小细胞肺癌细胞系(Human non-small cell lung cancer cells,A549),嘌呤霉素筛选稳定转导的细胞后进行单克隆化,最后对获取的单克隆细胞在分子水平上进行敲除及敲除回补验证,成功构建一株STAT1基因敲除(STAT1 gene knockout,STAT1-KO)的A549细胞,且该细胞系可维持正常细胞活性与增殖能力。以汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)感染验证,发现在该细胞系中病毒复制水平明显升高。本研究成功构建了一株STAT1-KO A549细胞,可为抗病毒药物和干扰素信号通路研究提供有力工具。

关键词：信号转导和转录活化因子1 CRISPR/Cas9 基因敲除汉滩病毒