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永生化大鼠牙囊细胞系成骨特性的初步研究

永生化大鼠牙囊细胞系成骨特性的初步研究

作者：郑鸿重庆医科大学

学位级别：硕士

牙周病是指发生在牙周软硬组织上的慢性、非特异性、感染性疾病。根据程度不同，其临床表现及治疗方法各异。其主要表现为牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齿松动脱落。对严重的牙周病，最后常需通过修复手段，如植骨术或... 详细信息

牙周病是指发生在牙周软硬组织上的慢性、非特异性、感染性疾病。根据程度不同，其临床表现及治疗方法各异。其主要表现为牙龈炎症、出血、牙周袋形成、牙槽骨吸收甚至牙齿松动脱落。对严重的牙周病，最后常需通过修复手段，如植骨术或引导组织再生术（Guided tissue regeneration,GTR）重建已丧失的牙周组织，形成新的牙周组织和新附着。目前利用在牙周缺损处局部移植骨髓干细胞、牙周韧带细胞、牙囊细胞等促进牙槽骨再生的牙周组织工程研究较多。牙囊细胞（dental follicle cells,DFCS）来源于牙囊，是一组具有多种生物学功能和分化潜能的多能干细胞，是牙周组织工程的种子细胞之一。可分化为成骨细胞、成牙骨质细胞、成纤维细胞及未分化间充质细胞形成牙周组织，在牙周病治疗中起原始生成的作用。牙周病治疗最关键的是形成新的牙槽骨，通过DFCS在牙周缺损区的成骨分化作用，增加骨量形成牙周病的硬组织基础，在牙周修复中具有很大一部分的作用。牙囊细胞体外培养易丧失自我更新能力、发生老化，且纯化非常困难，难以实现大量扩增，制约了其在牙周组织工程中的研究应用。1989年Cloud等首次将体细胞永生化并保持了原细胞的特性且未产生癌变倾向。永生化指体外培养的细胞经过自发的或外界干扰而避免增殖衰老，具备无限增殖能力的过程。本实验研究大鼠牙囊细胞的永生化方法及其永生化后的成骨特性，为后期相关实验提供足够数量的牙囊细胞。目的：1．拟将外源性SV40T-Ag病毒转染至体外培养的大鼠牙囊细胞中，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。2．观察永生化大鼠牙囊细胞的生物学特性及其成骨分化的潜能。3．为后续的牙周组织工程研究提供充足的大鼠牙囊细胞。方法：1．组织块法及酶消化法相结合培养原代大鼠牙囊细胞，通过差数贴壁法传代分离纯化大鼠牙囊细胞，进行形态学观察（光镜）、细胞组织学来源鉴定、绘制细胞生长曲线，为下一步永生化提供实验细胞。2．采用第3或4代大鼠牙囊细胞，利用293细胞包装病毒构建含SV40T-Ag的逆转录病毒载体，制备重组逆转录病毒并转染大鼠牙囊细胞，建立永生化的大鼠牙囊细胞系。3．Real-time PCR检测SV40T-Ag病毒在实验组大鼠牙囊细胞基因中的整合情况。4. Westen Blot分析实验组大鼠牙囊细胞端粒酶长度5．实验组大鼠牙囊细胞成骨特性分析(ALP、OC、BMP2、runx2)。6．实验组大鼠牙囊细胞生长曲线和增殖特征观察。7．实验组大鼠牙囊细胞克隆形成能力检测。结果：1．成功培养出大鼠牙囊细胞，其形态及生长均与文献报道相近，组织学鉴定细胞来源于外胚层。2.成功构建含SV40T-Ag的逆转录病毒载体大鼠牙囊细胞，且大鼠牙囊细胞端粒酶活性增强。3．永生化后大鼠牙囊细胞ALP、OC、BMP2、runx2成骨指标与对照组无统计学差异。结论：1．利用293细胞包装病毒，构建SV40T-Ag逆转录病毒载体对大鼠牙囊细胞的转染是成功的。2．永生化对大鼠牙囊细胞成骨分化基本无影响。

关键词：永生化大鼠牙囊细胞成骨分化碱性磷酸酶骨钙素

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永生化人胎肝细胞系LC-1的建立

重庆医学 2009年第21期38卷 2672-2673,2676页

作者：李俊刚陈耀凯王宇明第三军医大学西南医院全军感染病研究所重庆400038

目的建立人源性永生化肝细胞。方法利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNC-TIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性... 详细信息

目的建立人源性永生化肝细胞。方法利用含有SV40T和EGFP基因的双顺反子逆转录病毒表达载体pLNC-TIGlox,转染包装细胞PT67;取病毒上清液感染原代培养的人胎肝细胞,用G418筛选成功转导的永生化细胞系;用细胞计数法测定永生化细胞增殖特性,免疫细胞化学染色检测肝细胞特征蛋白表达,放免法和自动生化仪检测清蛋白和尿素氮合成功能。结果获得的一个细胞系命名为LC-1,其细胞群体倍增时间约为17h,可表达清蛋白、CK18肝细胞特征和CK19等胆管特征蛋白,具有清蛋白与尿素氮合成功能。结论成功建立了具有良好的增殖能力、分化状态、肝细胞生物学特征的永生化肝细胞系。

关键词：肝细胞胚胎永生化

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永生化人毛乳头细胞系体内诱导毛囊的形成

中国皮肤性病学杂志 2011年第3期25卷 177-180页

作者：刘官智伍津津四川省自贡市第四人民医院皮肤科四川自贡643000 第三军医大学大坪医院野战外科研究所皮肤科重庆400042

目的研究永生化人毛乳头细胞(DPC)系DPC-hTERT在体内诱导毛囊形成的能力。方法将第30代DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下,观察毛囊形成情况。结果 DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后注射到裸鼠背部皮... 详细信息

目的研究永生化人毛乳头细胞(DPC)系DPC-hTERT在体内诱导毛囊形成的能力。方法将第30代DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后直接注射到裸鼠背部皮下,观察毛囊形成情况。结果 DPC-hTERT与刚分离的毛囊上皮细胞混合后注射到裸鼠背部皮下后,可见毛囊样结构形成,且此结构表达毛囊特有的角蛋白。结论 DPC-hTERT具有正常DPC的功能,具备在体内诱导毛囊样结构的能力。

关键词：毛乳头细胞永生化毛囊诱导

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永生化骨髓间充质干细胞的生物学特性

世界华人消化杂志 2009年第9期17卷 882-885页

作者：方驰华程斌范应方南方医科大学珠江医院肝胆一科广东省广州市510282

目的:探讨永生化骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物学特性.方法:通过质粒pCMVSV40T/PUR导入大鼠BMSCs,建立永生化BMSCs.在倒置显微镜下观察细胞形态;采用检测碱性磷酸酶的活性,了解永生化BMSCs是否可分... 详细信息

目的:探讨永生化骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的生物学特性.方法:通过质粒pCMVSV40T/PUR导入大鼠BMSCs,建立永生化BMSCs.在倒置显微镜下观察细胞形态;采用检测碱性磷酸酶的活性,了解永生化BMSCs是否可分化为成骨细胞;采用裸鼠皮下接种实验检测细胞的致瘤性;应用不同血清浓度进行细胞培养及冻存,描绘其生长曲线及复苏后的活性.结果:未导入质粒的BMSCs培养至15代后细胞不能继续传代,呈明显衰老迹象,而永生化BMSCs培养至5代后仍可保持较好的活性,但具有明显接触抑制;永生化BMSCs具有分化为成骨细胞的能力;裸鼠接种后无致瘤性;与其他血清浓度相比,20%血清培养组的细胞生长速度较快;50%及90%血清组其复苏后较20%血清组活性高(P永生化BMSCs具有活性较好等特性,且无成瘤性,可为BMSCs的研究及应用提供大量的细胞来源.

关键词：猴肾病毒40 骨髓间充质干细胞永生化

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子宫内膜腺上皮永生化细胞模型的建立

中国现代医学杂志 2011年第24期21卷 2956-2961页

作者：杨清苏卿孙蓓中国医科大学附属盛京医院妇产科辽宁沈阳110004 沈阳医学院附属奉天医院妇产科辽宁沈阳110024 辽宁省人民医院妇产科辽宁沈阳110016

目的建立永生化人子宫内膜HPV16型E6和E7基因诱导的腺细胞,以促进对其的细胞生物学、生长分化调节等方面的研究。方法将质粒pcDNA3.1(+)/HPV16E6E7转入腺上皮细胞中,G418筛选,WesternBlot检测目的基因的表达;用相差显微镜观察细胞变化;... 详细信息

目的建立永生化人子宫内膜HPV16型E6和E7基因诱导的腺细胞,以促进对其的细胞生物学、生长分化调节等方面的研究。方法将质粒pcDNA3.1(+)/HPV16E6E7转入腺上皮细胞中,G418筛选,WesternBlot检测目的基因的表达;用相差显微镜观察细胞变化;上机分析细胞周期。结果转化后腺细胞形态无明显改变,相差显微镜下观察细胞贴壁较紧,为多边形或圆形,密集区域呈镶嵌状排列,阳性细胞灶胞浆被均染成棕黄色,胞核呈蓝色;转化后细胞倍增时间约为52.8 h,对数生长期后细胞停止分裂增生,活性降低;转化后的细胞无凋亡峰出现,S期比例为33.23%,明显增加。与未转化细胞相比差异具有统计学意义。结论转染HPV16E6、E7基因至体外培养的子宫内膜腺上皮细胞寿命明延长,得到了可以在体外传代30次以上的转化细胞;具有正常细胞的表型和生长特性,有较强的增殖能力却不具有致瘤性。

关键词：人乳头瘤病毒上皮细胞永生化

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神经干细胞的自发永生化

中华实验外科杂志 2010年第9期27卷 1291-1293页

作者：陈凌关云谦王淑燕赵春松陈立华张愚首都医科大学宣武医院细胞治疗室北京100053 首都医科大学宣武医院神经外科北京100053 首都医科大学宣武医院教育部神经变性病重点实验室北京100053

目的观察培养达24个月的神经干细胞（NSC）是否会发生永生化和恶变.方法培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.... 详细信息

目的观察培养达24个月的神经干细胞（NSC）是否会发生永生化和恶变.方法培养流产胎儿皮层来源的NSC.对培养超过24个月的NSC,分析其核型,检测其自我更新、增殖、衰老以及移植后的致瘤性等.检测其Bmi-1-p16INK4a/p14ARF基因通路的改变.结果体外培养超过24个月的NSC自我更新旺盛,克隆形成率（14.89±4.75）%,显著高于正常培养8周NSC的（8.04±2.07）%;生长速度快,表现为传代1周后的新生神经球的直径为（85.98±30.24）μm,显著高于体外培养8周NSC的（15.97±9.97）μm.此外,培养超过24个月的NSC衰老细胞为（5.96±2.81）%,远低于正常培养8周NSC的（78.14±8.99）%;而且染色体数目异常,这些结果可以确定其发生了永生化.裸鼠移植未发现致瘤性,所以该细胞未发生恶变.此2株细胞中Bmi-1、p16INK4a、p14ARF基因均缺失.结论体外长期培养的人类皮层神经干细胞能够自发永生化,表现为不进入衰老状态并不断增殖.其增殖不依赖于Bmi-1基因,而其不衰老状态可能和p16INK4a、p14ARF基因缺失有关.

关键词：神经干细胞永生化衰老

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免疫分选软骨前体细胞并诱导永生化的研究

中华实验外科杂志 2007年第2期24卷 226-228页

作者：郭风劲陈安民黄仕龙华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科武汉430030

目的建立永生化大鼠软骨前体细胞株，为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用免疫磁珠技术分离纯化具有特异性表面标志成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）的软骨前体细胞，用基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Ta... 详细信息

目的建立永生化大鼠软骨前体细胞株，为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源。方法利用免疫磁珠技术分离纯化具有特异性表面标志成纤维生长因子受体-3（FGFR-3）的软骨前体细胞，用基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因（SV40Tag）的重组质粒pEGFP-IRES2-SV40Tag转染原代培养的新生大鼠软骨前体细胞，经G418筛选，抗性克隆扩大培养。应用FGFR-3、Ⅱ型胶原和X型胶原抗体进行细胞鉴定，检测其分化能力，观察细胞的形态及其生长状况，绘制生长曲线。用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、Southern blot和免疫细胞化学法鉴定SV40Tas在转染细胞中的表达。结果获得1个阳性细胞克隆，免疫细胞化学证实为FGFR-3阳性的具有较强增值能力和多分化潜能的软骨前体细胞。经Southern印迹杂交证实，SV40Tag已稳定转染入软骨前体细胞，表达mRNA及其蛋白。贴壁培养的永生化软骨前体细胞株（IPSC），群体倍增时间为23．62h，传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论SV40Tag导入可诱导软骨前体细胞永生化，为软骨前体细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源。

关键词：软骨前体细胞永生化猿肾病毒40

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人脐静脉内皮细胞永生化及生物学特性的研究

中华实验外科杂志 2019年第1期36卷 60-62页

作者：李盛波郑勇斌武汉大学人民医院重症医学科 430060 武汉大学人民医院胃肠外科 430060

目的建立永生化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系并探讨永生化对HUVECs增殖、凋亡及成瘤性影响。方法扩增并提取猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)和人端粒酶反转录酶催化亚基(hTERT)基因,反转录病毒载体介导感染HUVECs;筛选2周;聚合酶链反应(PCR)... 详细信息

目的建立永生化人脐静脉内皮细胞(HUVECs)系并探讨永生化对HUVECs增殖、凋亡及成瘤性影响。方法扩增并提取猿猴病毒40大T抗原(SV40LT)和人端粒酶反转录酶催化亚基(hTERT)基因,反转录病毒载体介导感染HUVECs;筛选2周;聚合酶链反应(PCR)扩增后行琼脂糖凝胶电泳成像鉴定目的基因是否转入HUVECs;细胞计数法比较细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡、裸鼠成瘤实验检测细胞恶性转化。结果筛选出抗嘌呤霉素阳性克隆,SV40LT、hTERT成功转入HUVECs;永生化组细胞生长曲线上移,细胞增殖第5、6、7天,SV40LT永生化组及hTERT永生化组与HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P永生化组和HUVECs组细胞数目差异有统计学意义(P永生化组HUVECs总凋亡率为(3.4±0.4)%,hTERT永生化组HUVECs总凋亡率为(2.8±0.4)%,SV40LT永生化组、hTERT永生化组凋亡率均低于HUVECs组(均P永生化细胞株不具成瘤性。结论SV40LT、hTERT基因能使HUVECs发生永生化,永生化HUVECs增殖能力增强,凋亡率下降,无恶性转化。

关键词：猿猴病毒40大T抗原人端粒酶反转录酶催化亚基反转录病毒载体人脐静脉内皮细胞永生化

永生化山羊黄体细胞系中NSE、SYP、S100B及5-HT的表达检测

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永生化山羊黄体细胞系中NSE、SYP、S100B及5-HT的表达检测

作者：王仲慧西北农林科技大学

学位级别：硕士

本项目前期研究表明,山羊黄体细胞中存在神经特异性烯醇化酶(NSE)、突触素(SYP)、5-羟色胺(5-HT)和S-100蛋白(S100)四种弥散性神经内分泌细胞标志物,然而永生化的山羊黄体细胞系(hTERT-CLCs)中是否也存在这四种物质,尚未见报道,本研究... 详细信息

本项目前期研究表明,山羊黄体细胞中存在神经特异性烯醇化酶(NSE)、突触素(SYP)、5-羟色胺(5-HT)和S-100蛋白(S100)四种弥散性神经内分泌细胞标志物,然而永生化的山羊黄体细胞系(hTERT-CLCs)中是否也存在这四种物质,尚未见报道,本研究应用细胞培养法、细胞免疫荧光化学染色法、实时荧光定量PCR法对永生化山羊黄体细胞系中上述四种标志物进行了检测,并将其结果与纯化后的有限黄体细胞的表达情况进行了对比分析,为用永生化山羊黄体细胞作为细胞模型研究这四种标志物的功能奠定基础。主要结果如下:1.本研究证明了在纯化奶山羊黄体细胞方面,Percoll密度梯度离心法在纯化效率和维持细胞增殖活性方面优于胰蛋白酶差速消化法,纯化后黄体细胞纯度达98.2±1.2%。作为纯化山羊黄体细胞的一个新方法,Percoll密度梯度离心法,操作简便且经济实用,将会被广泛的应用于纯化山羊黄体细胞。2.本研究首次通过PCR产物直接测序获得山羊黄体细胞中SYP基因CDS区部分片段序列(389bp),S100B基因CDS区全长序列(279bp),Genbank注册序列号分别为KC244281.1 和 KC244280.1。3.培养了 48 h的永生化山羊黄体细胞(hTERT-CLCs)(第50代)中存在NSE和5-HT的表达,其NSE的mRNA表达量低于有限山羊黄体细胞的表达量(PS100B>SYP。结论:hTERT-CLCs细胞中存在NSE和5-HT的表达,而SYP和S100B的表达未被检测到。与之相比,离体培养的有限山羊黄体细胞中存在NSE、SYP、S100B和5-HT的表达。本研究为后续在体外利用hTERT-CLCs细胞模型研究弥散性神经内分泌标志物NSE和5-HT在山羊黄体细胞中的作用奠定了基础。

关键词：永生化黄体细胞 NSE SYP S100B 5-HT