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永生化软骨细胞体外快速扩增的实验研究

第三军医大学学报 2003年第15期25卷 1342-1344页

作者：方泽强王常勇李慧增孙远杨军第四军医大学口腔医学院西安710032 军事医学科学院基础医学研究所北京100850 第三军医大学附属西南医院口腔科重庆400038

目的　探讨获取大量软骨组织工程种子细胞的方法和技术。方法　通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化软骨细胞。观测RCCS中微载体培养永生化软骨... 详细信息

目的　探讨获取大量软骨组织工程种子细胞的方法和技术。方法　通过真核表达载体 ,把人端粒酶逆转录酶基因 (hTERT)转入兔髁状突软骨细胞 ,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化软骨细胞。观测RCCS中微载体培养永生化软骨细胞的生长情况和检测细胞代谢率 ,进行Ⅱ型胶原免疫组化染色 ,并与常规培养方法进行比较。结果　永生化软骨细胞在微载体 RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短 (P <0 0 1)。在培养第 8天 ,细胞数量可达最初接种的 95倍 (P <0 0 1)。结论　联合应用微载体和RCCS培养技术 ,能够在体外快速。

关键词：永生化软骨组织工程旋转生物反应器微载体

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永生化表皮细胞体外快速扩增的实验研究

第三军医大学学报 2005年第7期27卷 604-606页

作者：饶燕淡明斌李德如方泽强重庆市第一人民医院皮肤科重庆400011 北京大学口腔医学院颞下颌关节病中心北京100081

目的　探讨获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术。方法　通过真核表达载体,把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入兔表皮细胞,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化表皮细胞。观测RCCS中微载体培养永生化表皮细胞的生长... 详细信息

目的　探讨获取大量皮肤组织工程种子细胞的方法和技术。方法　通过真核表达载体,把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入兔表皮细胞,筛选、挑选阳性克隆在微载体 RCCS内快速扩增永生化表皮细胞。观测RCCS中微载体培养永生化表皮细胞的生长情况和检测细胞代谢率,进行抗人角细胞广谱角蛋白(AE1/AE3 )免疫组化染色,并与常规培养方法进行比较。结果　永生化表皮细胞在微载体 RCCS中生长迅速、细胞代谢率高、倍增时间缩短(P 永生化表皮细胞。

关键词：永生化表皮组织工程旋转生物反应器微载体

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永生化猪肝细胞的建立及其鉴定

中华传染病杂志 2008年第7期26卷 406-409页

作者：潘小平杜维波郝邵瑞曹红翠陈瑜盛国平朱春侠盛吉芳李兰娟浙江大学医学院附属第一医院传染内科卫生部传染病重点实验室杭州310003

目的建立永生化的猪肝细胞系，为生物人工肝、肝细胞移植、体外药物代谢模型提供合适的细胞源。方法应用胶原酶等四步灌流法分离获得原代猪肝细胞，以SV40大T抗原（SV40LT）和含人端粒酶反转录酶（hTERT）的重组反转录病毒感染，对其进... 详细信息

目的建立永生化的猪肝细胞系，为生物人工肝、肝细胞移植、体外药物代谢模型提供合适的细胞源。方法应用胶原酶等四步灌流法分离获得原代猪肝细胞，以SV40大T抗原（SV40LT）和含人端粒酶反转录酶（hTERT）的重组反转录病毒感染，对其进行永生化；然后，对建立的猪肝细胞系进行生物学特性鉴定。结果原代猪肝细胞经转染含人端粒酶反转录酶和SV40大T抗原的重组反转录病毒后4～6周获得三个肝细胞样细胞克隆，其中，一个猪肝细胞克隆（HepLP）传代60代以上；永生化猪肝细胞在相差显微镜、扫描电镜和透射电镜下具有典型的肝细胞的形态；Western印迹法检测该细胞系表达人端粒酶反转录酶和SV40大T抗原。RT-PCR检测到永生化猪肝细胞表达白蛋白mRNA、ELISA双抗体夹心法检测到永生化猪肝细胞培养上清液中自蛋白的分泌，以5．0×10^6细胞数接种裸鼠，观察6个月无肿瘤形成。结论新建立的无致瘤性的永生化猪肝细胞系具有正常猪肝细胞的生物学基本功能。

关键词：肝,人工细胞系端粒,末端转移酶永生化抗原,多瘤病毒转化猪

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永生化人肝细胞系的建立及其生物学特性

江苏医药 2011年第22期37卷 2624-2627页

作者：杭化莲张磊施晓雷卞建民丁义涛南京医科大学附属南京第一医院普通外科 210006 南京大学医学院附属鼓楼医院肝胆外科

目的建立一种由慢病毒载体表达人端粒酶反转录酶亚单位,具有原代肝细胞的特性的永生化肝细胞系。方法采用离体两步胶原酶灌注法无菌条件下分离肝细胞,构建慢病毒载体并包装高滴度慢病毒,肝细胞被采用表达永生化基因的慢病毒转染。通过... 详细信息

目的建立一种由慢病毒载体表达人端粒酶反转录酶亚单位,具有原代肝细胞的特性的永生化肝细胞系。方法采用离体两步胶原酶灌注法无菌条件下分离肝细胞,构建慢病毒载体并包装高滴度慢病毒,肝细胞被采用表达永生化基因的慢病毒转染。通过筛选功能基因阳性表达克隆建立永生化肝细胞系,倒置相差显微镜观察形态学变化,免疫组化检测细胞角蛋白18(CK18)表达,RT-PCR及Westernblot检测功能基因及蛋白表达。结果采用功能基因阳性表达筛选建立了永生化肝细胞系,其可连续扩增传代,具有原代肝细胞的特性并未呈现致瘤性,揭示出肝脏实质细胞的形态学特征并且表达肝细胞主要的功能基因标志。结论通过功能基因阳性表达筛选成功建立具有原代肝细胞特性的永生化肝细胞系。

关键词：人原代肝细胞永生化

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建立永生化骨髓间充质干细胞株

中国组织工程研究与临床康复 2007年第33期11卷 6552-6556页

作者：徐燕慕晓玲石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室新疆维吾尔自治区石河子市832002

目的:将外源性人端粒酶反转录酶基因转入人骨髓间充质干细胞,以建立永生化细胞株。方法:实验于2006-01/2007-01在石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室完成。①实验材料:骨髓标本采自因意外事故引产死亡的8个月正常... 详细信息

目的:将外源性人端粒酶反转录酶基因转入人骨髓间充质干细胞,以建立永生化细胞株。方法:实验于2006-01/2007-01在石河子大学新疆地方与民族高发病省部共建教育部重点实验室完成。①实验材料:骨髓标本采自因意外事故引产死亡的8个月正常胎儿,家属均签署知情同意书。大肠杆菌DH5α分子克隆的受体菌由本室保存。质粒pBabepuro-hTERT由美国Weinberg博士惠赠。PA317细胞和Hela细胞由郭志儒博士惠赠。NIH3T3细胞由黄瑾博士惠赠。②实验方法:无菌条件下将骨块置于α-MEM培养液中,分离及扩增培养人骨髓间充质干细胞。提取并纯化质粒pBabepuro-hTERT,转染包装骨髓间充质干细胞,经嘌呤霉素筛选后获得抗性克隆,选取病毒滴度最高的细胞克隆感染生长状态良好的第3代骨髓间充质干细胞。③实验评估:采用端粒酶重复序列扩增法-酶链免疫吸附法检测人骨髓间充质干细胞转染前后端粒酶活性的变化,样本的△A值高于0.2视为端粒酶阳性。结果:①骨髓间充质干细胞的形态观察:第3代人骨髓间充质干细胞形态不规则,体积较大的细胞逐渐死亡,以梭形为主。②基因转染包装细胞和克隆筛选结果:嘌呤霉素筛选7d后,转染的细胞出现抗性克隆。待细胞克隆长至肉眼可见时将细胞克隆消化后扩增培养,挑选出4个抗性克隆,分别命名为克隆1,2,3,4。③病毒滴度的测定:1～4号细胞克隆的病毒滴度分别为3×106,7×105,4×105,9×106cfu/L。④端粒酶活性变化的检测:未转染的第3代骨髓间充质干细胞△A值为0.121±0.043,端粒酶活性为阴性。第3代人端粒酶反转录酶-骨髓间充质干细胞的△A值为1.741±0.103,端粒酶活性为阳性。结论:导入外源性人端粒酶反转录酶基因后可激活骨髓间充质干细胞的端粒酶活性。

关键词：骨髓间充质干细胞端粒酶催钯亚基永生化

SV40TAg基因和Cre/loxP系统诱导正常人黑素细胞可逆性永生化的初探

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临床皮肤科杂志 2006年第10期35卷 627-630页

作者：王鹰邓军郝飞杨希川钟白玉第三军医大学西南医院皮肤科重庆400038

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分... 详细信息

目的:研究Cre/loxP系统和SV40TAg基因在体外对人正常黑素细胞的可逆性永生化诱导作用。方法:将Cre-ERT2反转录病毒导入包装细胞PA317,获得的病毒上清感染SV40TAg基因诱导转化的永生化黑素细胞,三苯氧胺(tamoxifen)诱导Cre重组酶表达,分别在第6天和第10天用PCR、反转录(RT)-PCR和免疫组化方法检测SV40TAg基因在感染病毒上清的永生化黑素细胞内的表达,并采用左旋多巴(L-Dopa)染色、透射电镜、软琼脂克隆试验等检测细胞的生物学性状和功能。结果:Cre重组酶反转录病毒上清感染永生化黑素细胞经嘌呤霉素筛选和三苯氧胺诱导Cre重组酶表达,第6天时可检测到感染细胞中有SV40TAg基因的表达,第10天后则在细胞中检测不到SV40TAg基因表达;L-Dopa染色、透射电镜等鉴定结果表明,感染细胞具有与原代黑素细胞相同的生物学性状和功能。结论:联合应用Cre/loxP系统和SV40TAg基因可以成功地诱导具有良好生物学安全性的人源性可逆性永生化黑素细胞。

关键词： Cre/loxP系统 SV40T抗原黑素细胞永生化可逆性

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永生化小鼠成纤维细胞的构建

永生化小鼠成纤维细胞的构建

作者：孙贤丽东华大学

学位级别：硕士

背景:有研究结果表明,正常的细胞组织在体外培养时可以正常生长和分裂。但经过一段时间后,细胞就会失去生长和分裂的能力,最后走向衰老死亡,这样的现象便限制了对细胞的研究。但是永生化的细胞能够为细胞、肿瘤、组织工程等领域的研究... 详细信息

背景:有研究结果表明,正常的细胞组织在体外培养时可以正常生长和分裂。但经过一段时间后,细胞就会失去生长和分裂的能力,最后走向衰老死亡,这样的现象便限制了对细胞的研究。但是永生化的细胞能够为细胞、肿瘤、组织工程等领域的研究奠定实验基础。因此,怎样才能使体外正常状态下目的细胞成为永生化的细胞成为研究者们研究的重点。研究发现,端粒酶的活性主要受TERT基因调控,当TERT活性增加时,将促进端粒酶利用自身作为模板合成端粒DNA,来弥补染色体复制造成的端粒长度的损失。使细胞获得无限增殖能力,从而实现细胞永生化的目的。因此也可以说明TERT的活性是使细胞永生化的关键。本实验我们发现,通过脂质转染法能将外源hTERT基因转染进目的细胞内来提高hTERT的表达量,也能通过CRISPR/dCas9与TERT的转录激活因子结合的方法来提高内源细胞TERT的表达。目的:通过病毒感染的方法将带有hTERT的慢病毒感染原代细胞,或者使用脂质体转染法将hTERT慢病毒载体转染进原代细胞,使原代细胞中外源hTERT表达量上升,来促进端粒酶的活性,进而维持染色体端粒的长度,使正常状态下快速死亡的原代细胞生长周期变长甚至永生化。或者利用CRISPR/dCas9激活系统技术激活原代细胞的内源性TERT基因的表达,通过验证了原代细胞内源TERT的表达量的上升这一结果,为后续永生化细胞使用提供新的思路和方法。方法:通过构建hTERT慢病毒载体,然后将hTERT包装成慢病毒去感染原代细胞或者使用脂质体法将外源hTERT转染进原代细胞,来提高原代小鼠成纤维细胞内hTERT的表达。另一种方法是通过CRISPR/dCas9与转录激活因子结合的系统的方法验证是否能够提高原代细胞内源性TERT的表达量,若验证成功后,可将此载体包装成病毒感染原代细胞使细胞成为永生化。结果:本实验构建含有hTERT编码基因(CDS)的慢病毒载体转染293T细胞,最终用Real-Time PCR检测实验组293T细胞中hTERT含量显著上升。我们将hTERT包装成慢病毒,流式细胞术测到病毒滴度高达4.8*10～8TU/ML,hTERT慢病毒感染293T细胞有很高的感染率,但是感染原代细胞却并未成功,这方面有待研究。本实验也将外源基因hTERT通过脂质体转染法转染进原代小鼠成纤维细胞中,Real-Time PCR方法检测到原代细胞内hTERT表达量显著上升。寻找新的方法激活内源TERT基因,为之后获得稳定激活TRET的永生化细胞奠定基础,我们使用了CRSPR/dCas9(无核酸内切酶活性的Cas9)与转录激活剂结合的系统促进细胞内源基因的表达的方法。因此,本实验采用CRSPR/dCas9与转录激活剂结合的系统,将TERT的重要的转录调控因子SP1基因与dCas9的C端结合,同时设计相应的SgRNA,通过脂质体转染方法分别将该两个基因编辑载体转染进293T细胞和原代细胞,来提高原代细胞内源TERT基因的表达,Real-Time PCR检测到阳性293T细胞和阳性原代小鼠成纤维细胞中内源TERT基因都有5倍多的提高。验证此种方法有效性后也可将该载体包装成病毒,通过病毒转染细胞得到稳定的永生化细胞,此方法由于时间原因并没有进行后续慢病毒的包装,但是为永生化细胞的实验提供了新的思路综上所述,我们优化了慢病毒包装条件,并成功构建了hTERT过表达载体,成功构建的CRISPR/dCas9载体与转录激活因子SP1融合的dCas9-SP1载体。由于包装的hTERT慢病毒滴度或者纯度不够,无法感染原代细胞,但是对293T的感染性很好。通过脂质体转染pLenti-hTERT进入原代细胞中Real-Time PCR检测hTERT表达量显著提高。CRISPR-dCas9-SP1载体和42230-SgRNA-mouse-EGFP共转染到原代小鼠成纤维细胞中通过Real-Time PCR检测到内源TERT表达量显著的提高,为以后研究细胞永生化提供了新的思路。

关键词：慢病毒包装 CRISPR/dCas9系统 TERT 永生化转录激活因子

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永生化小鼠大脑星形胶质细胞系建立

永生化小鼠大脑星形胶质细胞系建立

作者：涂然陕西师范大学

学位级别：硕士

星形胶质细胞(astrocyte AS)是一类大胶质细胞,其数量在中枢神经系统(centrol nervous system CNS)内占绝对优势,在神经元的发育、正常生理及病理过程中都有重要作用,其功能异常会导致神经元变性疾病或者神经退行性疾病发生。目前星形... 详细信息

星形胶质细胞(astrocyte AS)是一类大胶质细胞,其数量在中枢神经系统(centrol nervous system CNS)内占绝对优势,在神经元的发育、正常生理及病理过程中都有重要作用,其功能异常会导致神经元变性疾病或者神经退行性疾病发生。目前星形胶质细胞的体外研究主要通过分离脑组织获取原代星形胶质细胞,整个分离过程繁琐耗时,且分离得到的细胞或因动物组织批次间差异而细胞特性不同,导致后续研究过程中数据波动性大且重复性差。而星形胶质细胞作为原代细胞在体外培养时只能传10代左右,其有限的增殖能力限制了很多研究的开展,尤其是长期效应性研究。因此构建一株永生化星形胶质细胞系非常具有实用价值。本实验通过慢病毒将人端粒酶逆转录酶亚基(human telomerase reverse transcriptase, hTERT)基因介导进入星形胶质细胞,激活端粒酶活性,延长端粒长度以期获得性状良好的永生化小鼠大脑星形胶质细胞系。获得主要结果如下：胰酶消化、低速离心、传代纯化获取原代细胞,培养细胞呈梭形或者多边形,形态均匀,增殖旺盛,贴壁性和折光性好,胞体伸展有突起,星形胶质细胞特异性蛋白GFAP免疫荧光染色呈阳性。成功构建过表达质粒pCDH-CMV-hTERT-EF1-copGFP, PCR扩增、双酶切验证以及测序结果均鉴定正确。采用工具细胞293T包装病毒,浓缩病毒上清液得病毒浓缩液,滴度检测达到5.12×108 TU/mL～15.37×108 TU/mL。用慢病毒介导将hTERT基因整合到第4代小鼠大脑星形胶质细胞基因组,流式分选GFP阳性细胞,挑选细胞克隆并扩大培养,获得状态良好、增殖旺盛的细胞株,目前传至70代。取第55代做hTERT免疫荧光染色,结果呈阳性,而原代星形胶质细胞呈阴性,表明hTERT在hTERT-KMAS中稳定表达,说明外源基因已成功转染到小鼠大脑星形胶质细胞中并稳定表达。对hTERT-KMAS进行生长曲线测定和细胞周期检测,结果显示相比较于原代星形胶质细胞,其具有更快的生长速率和更强的增殖活性;核型分析实验结果显示hTERT-KMAS呈现正常小鼠染色体核型(2n=40);端粒长度检测结果表明其端粒长度稳定,而且长度与小鼠肝癌H22细胞没有明显差异,说明其端粒酶表达强度趋于稳定;软琼脂实验显示该细胞系在软琼脂中不能形成细胞克隆,表明该细胞依然保留贴壁生长和细胞通讯依赖。综上所述,本实验分离培养并传代纯化小鼠大脑星形胶质细胞,将人端粒酶逆转录酶基因hTERT成功导入并整合到星形胶质细胞基因组中,稳定表达并诱导细胞端粒酶激活,延长端粒长度并维持稳定,使细胞实现永生化,最终成功构建永生化小鼠大脑星形胶质细胞系,为后续研究奠定了基础。

关键词：小鼠大脑星形胶质细胞永生化 hTERT

猿肾病毒40大T抗原基因永生化大鼠星形胶质细胞株的构建

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中华麻醉学杂志 2004年第11期24卷 838-841页

作者：安珂田玉科杨辉高峰王鹏华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉学研究室武汉市430030

目的构建永生化大鼠星形胶质细胞,为转基因细胞移植镇痛提供细胞载体。方法采用差速粘附法体外分离和培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞。利用脂质体将含有猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)基因的质粒pCMVSV40T／PUR转染培养的大鼠星形胶质细胞... 详细信息

目的构建永生化大鼠星形胶质细胞,为转基因细胞移植镇痛提供细胞载体。方法采用差速粘附法体外分离和培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞。利用脂质体将含有猿肾病毒40大T抗原(SV40Tag)基因的质粒pCMVSV40T／PUR转染培养的大鼠星形胶质细胞。经嘌呤霉素1.5μg/ml筛选后,挑选阳性细胞克隆扩大培养并连续传代。PCR、RT-PCR及免疫组化检测阳性细胞克隆中SV40Tag基因的整合情况及其表达,并对传代细胞的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)进行检测。结果成功获得体外培养的大鼠星形胶质细胞,GFAP阳性表达;筛选获得阳性细胞克隆,连续传代培养近50代;PCR、RT-PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分析显示558bp处有一特异性扩增条带,与阳性对照条带相同,而未转染pCMVSV40T／PUR的细胞无扩增条带,回收片段经测序、比对与SV40Tag的基因序列一致(100％);同时转染的阳性细胞克隆SV40Tag和GFAP免疫染色阳性。结论成功地构建了SV40Tag基因永生化的大鼠星形胶质细胞株。

关键词：星形胶质细胞大鼠永生化阳性细胞 GFAP 肾病转染 SV40 克隆大T抗原