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油菜素内酯（BR）超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

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油菜素内酯（BR）超敏感嵌合受体的构建和水稻转基因表达

作者：李大勇浙江大学

学位级别：硕士

在植物和动物中，受体激酶(receptor-like kinases，RLKs)介导了各种各样的细胞信号传导途径。在动物细胞中，酪氨酸受体激酶和丝氨酸／苏氨酸受体激酶的作用机理在许多报告中已被详细阐明：配体通过识别并结合细胞外受体的相应的功能... 详细信息

在植物和动物中，受体激酶(receptor-like kinases，RLKs)介导了各种各样的细胞信号传导途径。在动物细胞中，酪氨酸受体激酶和丝氨酸／苏氨酸受体激酶的作用机理在许多报告中已被详细阐明：配体通过识别并结合细胞外受体的相应的功能区，使受体发生双聚作用，引起受体的磷酸化，从而激发其下游的一系列信号的传导。然而，对于植物来说，有关RLKs的相应研究只在最近几年才有一些突破性的工作。虽然在植物的基因组里可以推测到许多植物受体激酶基因的阅读框，但这些受体是怎样进行信号传导还不是很清楚。在这些植物受体激酶中，最大的一类是富亮氨酸重复(leucine-rice repeats，LRRs)的受体激酶(LRR-RLKS)。在拟南芥中至少含有200多个编码这一类激酶的基因。这类LRR-RLKS参与了各种各样的生物途径，包括分生组织的生长调控，抗病性，激素信号传递，组织发育等。虽然在遗传学上已得到了一些证据，但从生物化学角度来证明配体的存在，尚存在许多困难。有一个比较清楚的体系是拟南芥CLAVATA1-CLAVATA3的互作，基于分子遗传和生物化学的证据，CLAVATA3(推测为含96个氨基酸的细胞外蛋白)被认为是LRR-RLK(CLAVATA1)的配体。此外，遗传学研究表明类固醇激素油菜素内酯(Brassinosteroids，BR)配体的受体(BRI1)也是一个LRR-RLK。所以，LRR-RLK可能是以蛋白质或者小分子作为配体的。为了知道BRI1是否在BR的识别过程中起到了直接的作用，并籍此构建一个人工抗病受体基因的激发和信号控制系统。He等把BRI1的LRR-JM结构域(domain)与Xa21的丝氨酸／苏氨酸激酶重组构建了一个嵌合受体的信号传导系统NRG1。当用油菜素内酯处理水稻细胞株时，这个嵌合受体可以引发与XA21相同的植物防卫反应，包括活性氧迸发，防卫基因的激发，细胞死亡等。这个系统有力证明了BRI1在BR的识别过程中的直接作用。而且这个系统将可以使我们构建新的抗病基因，并发现新的植物受体激酶的配体。为了构建一个更敏感的BR激发的信号传导系统，利用油菜素内酯(brassinosteroids,BR)超敏感受体激酶基因Sudl与经体外点突变的水稻抗病受体激酶2003年浙江大学硕士学位论文基因 XaZI构建了一个带 SUD LRR＊M结构域与 XAZI激酶域伙inase）的合成受体（chimera）基因SNRG］，同时构建了 SUDI LRR突变体对照受体基因MGmL和XAZIkinase突变体对照受体基因 SNRGmK。应用基因枪…article bombardment）转化技术成功将MGI，SNRGmL和 SNRGmK导入粳稻模式品种台北 309的胚性愈伤组织中，并由此获得了再生植株和细胞株。经 PCR、Northern blot分子检测和表型观察证实外源基因已经转入并整合到水稻基因组。防卫基因表达的结果表明 SNRG可能己在体内微量的BR作用下，激发了水稻的防卫反应。为进一步的 XAZI激酶的抗性激发研究奠定了基五出。

关键词：受体激酶油菜素内酯超敏感受体水稻XA21激酶嵌合受体水稻转基因

水稻OsTOM3基因克隆及OsTOM3沉默转基因植株的构建

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水稻OsTOM3基因克隆及OsTOM3沉默转基因植株的构建

作者：彭靖茹广西大学

学位级别：硕士

根据本实验室已克隆的与拟南芥TMV寄主因子AtTOM3有高度同源性的水稻OsTOM3基因的全长cDNA序列设计3对特异性引物，用PCR的方法获得水稻OsTOM3全长基因。该基因长5329bp，包含有11个外显子和10个内含子。将构建以OsTOM3为靶标的RNA表达... 详细信息

根据本实验室已克隆的与拟南芥TMV寄主因子AtTOM3有高度同源性的水稻OsTOM3基因的全长cDNA序列设计3对特异性引物，用PCR的方法获得水稻OsTOM3全长基因。该基因长5329bp，包含有11个外显子和10个内含子。将构建以OsTOM3为靶标的RNA表达载体(RNA干扰表达载体、RNA反义表达载体及RNA正义表达载体)导入农杆菌EHA105中，并用其侵染水稻台北309的愈伤组织。共获得了38株带标记潮霉素抗性的转基因植株。转基因植株中能扩增潮霉素抗性基因和出NOS基因。测序表明所扩增的潮霉素基因序列与载体的潮霉素抗性基因的序列是一致的。

关键词：水稻转基因 OsRTOM3 寄主因子基因沉默

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天花粉蛋白基因在水稻中转化及抗虫研究

云南大学学报（自然科学版） 1999年第S3期21卷 87-88页

作者：何锶洁徐琼芳曾守云唐祚舜叶松青储成才邵鹏柱田文忠中国科学院遗传研究所北京100101 中国农科院作物育种栽培研究所北京100081 香港中文大学生物化学系

抗菌蛋白、硫堇蛋白等辣椒PR基因转化水稻及其抗稻瘟病初步分析

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抗菌蛋白、硫堇蛋白等辣椒PR基因转化水稻及其抗稻瘟病初步分析

作者：陈华观福建农林大学

学位级别：硕士

水稻作为我国最主要的粮食作物之一,是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。长期以来,稻瘟病、纹枯病、白叶枯病等真菌性或者细菌性病害严重限制了水稻的产量和品质。通过基因工程克隆抗病基因并与常规育种技术相结合培育抗病... 详细信息

水稻作为我国最主要的粮食作物之一,是我国粮食安全和农业可持续发展的重要战略资源。长期以来,稻瘟病、纹枯病、白叶枯病等真菌性或者细菌性病害严重限制了水稻的产量和品质。通过基因工程克隆抗病基因并与常规育种技术相结合培育抗病新品种是现代作物遗传改良的有效途径。本研究拟从辣椒中分离出的广谱抗病基因（抗菌蛋白、硫素蛋白、亲环蛋白、铁氧还蛋白、非特异性脂转移蛋白）与强诱导型启动子LURP1（Late Upregulated in Response to Hyaloperonospora parasitica）结合起来转化水稻日本晴,获得转基因植株,并进行稻瘟病的初步抗性分析,从中筛选具有较强抗稻瘟病的转基因新品种,为实现水稻抗病与高产的有机统一打下一定的基础。主要结果如下:1、利用Gateway克隆技术构建了CaAPs（抗菌蛋白）、CaThs（硫堇蛋白）、CaCyPs（亲环蛋白）,CaFds（铁氧还蛋白）、CansLTPs（非特异性脂转移蛋白）的植物表达载体,并进行测序验证,结果表明上述5个辣椒PRs基因已成功构建到pMDC-32植物表达载体中,且目标基因序列与原序列完全一致;2、以日本晴成熟种子为材料,通过农杆菌介导的水稻遗传转化方法,将上述5个辣椒PRs基因转化粳稻品种日本晴中,并初步统计其转化率以及阳性率。结果表明,成熟日本晴种子的愈伤诱导率大约在80%—90%之间,转化率大约在9%-15%,其中CaAPs筛选开始时的愈伤数约为263个,分化苗数为31株,转化率约11.79%;CaThs筛选开始时的愈伤数约为235个,分化苗数为25株,转化率约为10.64%;CaCyPs筛选开始时的愈伤数约为187个,分化苗数为17株,转化率约为9.09%;CaFds筛选开始时的愈伤数约为206个,分化苗数为23株,转化率约为11.17%;CansLTPs筛选开始时的愈伤数约为157个,分化苗数为17株,转化率约为10.83%。提取水稻基因组DNA,进行PCR验证,计算转基因水稻的阳性率,其中,获得CaAPs阳性植株30株,阳性率约为96.77%;获得CaThs阳性植株株25株,阳性率约为100%,获得CaCyPs阳性植株17株,阳性率约为100%,获得CaFds阳性植株23株,阳性率约为100%;获得CansLTPs阳性植株15株,阳性率约为88.24%。由于栽培管理以及病菌侵染等因素,部分转基因苗死亡。最后,将28株CaAPs阳性植株,23株CaThs阳性植株,15株CaCyPs阳性植株,20株CaFds阳性植株,15株CansLTPs阳性植株移栽大田,收获T代种子;3、对上述T代转基因植株进行稻瘟菌guy1的接种处理,通过RT-PCR分析上述CaAPs,CaThs,CansLTPs基因在水稻中的表达情况,并进行转基因植株的表型分析及抗性鉴定。RT-PCR结果分析发现,外源抗CaAPs,CaThs,CansLTPs基因在稻瘟菌未接种和接种的条件下,都有不同程度的表达,但在接种后表达量都有所提高。与接种稻瘟菌的野生型日本晴植株相比,外源CaAPs,CaThs,CansLTPs基因这三个转基因水稻的发病程度明显较轻,表明对稻瘟病的抗性有不同程度的提高。这些结果表明,辣椒外源防卫反应基因转化水稻日本晴在一定程度上提高了水稻对稻瘟菌的抗病性,此外。又进一步验证了前人的研究结果:不同高等植物里含有一套相似的防卫反应基因。4、拟南芥LURP启动子在水稻中的表达分析发现,在双子叶模式植物拟南荠抗病中起重要调节作用的LURP启动子同样可以在水稻中诱导抗性基因的表达,这说明单子叶和双子叶植物中顺式作用元件在激活植物防御反应方面存在着一定的保守性。

关键词： PR基因 LURP1 水稻转基因 RT-PCR 表型分析

青藏高原野生大麦HsCIPKs基因克隆及其在水稻中的功能验证

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青藏高原野生大麦HsCIPKs基因克隆及其在水稻中的功能验证

作者：沈金秋浙江师范大学

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在植物生长发育和环境适应过程中,Ca2+作为重要的胞内第二信使,对胞内外不同信号或刺激会形成时空特异性的Ca2+信号,触发植物对各种生物或非生物胁迫的响应。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)是最近几年中备受关注的Ca2+感受器,它能识别并解... 详细信息

在植物生长发育和环境适应过程中,Ca2+作为重要的胞内第二信使,对胞内外不同信号或刺激会形成时空特异性的Ca2+信号,触发植物对各种生物或非生物胁迫的响应。类钙调磷酸酶B亚基蛋白(CBLs)是最近几年中备受关注的Ca2+感受器,它能识别并解码Ca2+信号,在植物逆境响应、营养物质吸收中起着重要调控作用。然而,CBLs自身并没有具备激酶活性,必须通过与其互作蛋白激酶CIPKs互作构成CBL-CIPK信号系统才能发挥其生物学功能。已知CBL-CIPK信号系统是植物逆境响应中的主要信号途径,参与调控多种逆境胁迫响应。因而,成为近几年植物逆境胁迫生理与分子生物学研究领域中的重要热点之一。青藏高原一年生野生大麦(Hordeum spontaneum ***)是国宝级禾本科野生资源。由于其长期生长在各种极端恶劣环境下,经过漫长的自然进化,形成了与之相适应的独特的抗(耐)性基因网络,含有丰富的等位基因变异位点。因此,分离和克隆野生大麦HsCIPKs基因对作物耐逆境遗传改良具有重要应用价值,但至今仍没有被开发利用。本研究采用反向遗传学研究策略,利用分子克隆、转基因等现代分子生物学技术和生理生化等分析手段从青藏高原一年生野生大麦中分离和克隆HsCIPKs基因,并在水稻日本晴(Oryza sativa *** ***)中进行抗逆性功能验证,期望获得高耐逆境转基因水稻株系,初步阐明HsCIPKs的作用机理,为高耐逆境水稻品种的培育提供中间材料。主要研究结果如下:1.利用分子克隆技术,从野生大麦的总cDNA中,成功克隆到4个HsCIPKs(17,24,29和31)基因的全长编码序列,并构建4个相应过表达载体。另外,本实验室前期研究工作中,已成功克隆8个HsCIPKs基因及其相应过表达载体。2.利用农杆菌介导法和水稻日本晴成熟胚转基因体系,将上述12个过表达载体分别导入水稻日本晴愈伤组织中,获得转基因再生植株。经RT-PCR分析表明,各表达载体均获得至少2个以上的T1代高表达转基因株系。经两代繁殖后,通过抗性(G418)筛选,获得T3代水稻转基因纯合株系。3.利用水稻初生根相对伸长率来分析HsCIPKs基因对各种逆境胁迫处理的耐/抗性。分析结果表明,与非转基因对照株系相比,HsCIPK2、HsCIPK5、HsCIPK17、HsCIPK28、HsCIPK29和HsCIPK30显著性地提高了转基因株系对高盐胁迫的耐/抗性;HsCIPK和HsCIPK17明显促进转基因株系对ABA的抗性;HsCIPK9、HsCIPK1 1、HsCIPK14、HsCIPK17、HsCIPK23、HsCIPK24 和 HsCIPK29基因显著增强了转基因植株对CdC12的耐/抗性;HsCIPK2、HsCIPK5、HsCIPK9、HsCIPK17和HsCIPK30转基因株系对K2Cr2O7胁迫表现出明显的耐/抗性;HsCIPK2、HsCIPK14和HsCIPK17基因显著降低了转基因植株对HgC12的敏感性;同样,HsCIPK5、HsCIPK24、HsCIPK29和HsCIPK31显著增强了转基因植株对CuSO4的耐/抗性;此外,过表达.HsCIPK17、HsCIPK23、HsCIPK29和HsCIPK31显著提高了转基因植株对干旱胁迫的耐/抗能力。这些结果证实,过表.达HsCIPKs能够显著提高转基因植株的耐/抗逆性,表明青藏高原野生大麦HsCIPKs基因参与调控多种非生物胁迫的响应。

关键词：青藏高原野生大麦 HsCIPKs 克隆水稻转基因逆境胁迫

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遗传育种

麦类文摘 1994年第5期 33-38页

分子遗传W942901 小麦 Cab-1增强子的三种组织特异成分分析[刊,英]/Gotor,C.…//Plant Journal.-1993,3(4).-509～518[WBTA,1993,10(4),3038]W942902 一个小麦组蛋白 H3启动子使 gusA

关键词：普通小麦品种冬小麦品种抗寒性水稻转基因 wheat 春小麦品种 CIMMYT 麦谷蛋白染色体附加麦类文摘

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小议转基因食品

才智 2010年第18期 295-295页

作者：张基林重庆市綦江中学

继有关部门批准了转基因棉花、番茄、甜椒等作物种植后,2009年11月27日,我国农业部批准了两种转基因水稻、一种转基因玉米的安全证书,这让我国成为世界上第一个批准主粮可进行转基因种植的国家。之后,一篇题为《转基因大米你敢吃吗?》... 详细信息

继有关部门批准了转基因棉花、番茄、甜椒等作物种植后,2009年11月27日,我国农业部批准了两种转基因水稻、一种转基因玉米的安全证书,这让我国成为世界上第一个批准主粮可进行转基因种植的国家。之后,一篇题为《转基因大米你敢吃吗?》的网文引发了"转基因粮食风波",开始在不小的网络论坛上蔓延,网友说:虫子吃了BT毒蛋白可以被毒死。

关键词：转基因食品转基因玉米转基因棉花转基因水稻转基因工程网络论坛毒蛋白水稻转基因玉米花粉