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油酸通过磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和p38丝裂原活化蛋白激酶途径调节水通道蛋白3和9的表达

中华肝脏病杂志 2013年第10期21卷 753-758页

作者：顾陆昀邱烈旺陈小凤吕琳梅浙川重庆医科大学附属第二医院消化内科 400010 重庆医科大学附属永川医院消化内科

目的研究油酸在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中诱导水通道蛋白3 （AQP3）和AQP9表达改变的相关信号转导机制.方法采用油酸干预人肝癌HepG2细胞构建非酒精性脂肪变性肝细胞模型,油红O染色及吸光度值测定分析其脂肪变性程度,通过实时定... 详细信息

目的研究油酸在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中诱导水通道蛋白3 （AQP3）和AQP9表达改变的相关信号转导机制.方法采用油酸干预人肝癌HepG2细胞构建非酒精性脂肪变性肝细胞模型,油红O染色及吸光度值测定分析其脂肪变性程度,通过实时定量聚合酶链反应与Western blot检测AQP3和AQP9表达改变情况；以常规培养的细胞为对照组,联合油酸及不同信号通路抑制剂诱导HepG2细胞,实时定量聚合酶链反应和Western blot方法检测AQP3和AQP9在非酒精性脂肪变性肝细胞模型中表达改变的相关信号分子机制.多组间数据比较采用单因素方差分析,两组间数据比较采用独立样本t检验. 结果随着油酸刺激浓度的升高（0、250、500μmol/L）,肝细胞内脂肪变性程度增加,AQP3 mRNA表达逐渐下降,而AQP9 mRNA水平逐渐升高,油酸500μmol/L刺激下二者变化均最为明显,分别为0.47±0.18和1.57±0.21,与0 μmol/L组比较,差异均有统计学意义（t值分别为4.5450和3.0306,P值均＜0.05）；蛋白质水平检测结果与之一致.油酸联合磷脂酰肌醇-3激酶抑制剂LY294002处理后,AQP9 mRNA水平升高到4.55±0.62,与对照组的1.00±0.10、油酸单独干预组的2.43±0.53和LY294002单独干预组的1.90±0.16相比,差异均有统计学意义（t值分别为9.7909、4.5018和7.1683,P＜0.01或P＜ 0.05）.p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）抑制剂SB203580干预可使被油酸抑制的AQP3 mRNA水平恢复到与对照组相近水平（1.27±0.11）,AQP9 mRNA则从油酸明显上调的水平下降到0.38±0.09,与干预前相比,差异均有统计学意义（t值分别为5.7455和6.5727,P值均＜0.01）.细胞外信号调节激酶抑制剂PD98059和c-Jun N端激酶抑制SP600125干预对AQP3和AQP9的蛋白和基因水平均无明显作用.油酸诱导后,磷酸化丝/苏氨酸蛋白激酶蛋白相对表达水平从0.21±0.02下降到0.13±0.03,磷酸化p38蛋白相对表达水平从0.58±0.06升高到1.02±0.10,差异均有统计学意义（t值分别为3.8431和12.5289,P＜0.01或P＜0.05）.结论油酸通过激活p38 MAPK信号通路下调AQP3的表达,而通过抑制磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶途径并激活p38MAPK途径刺激AQP9表达升高.

关键词：水甘油通道蛋白质类 1-磷脂酰肌醇-3激酶 p38丝裂原活化蛋白激酶类脂肪肝非酒精性

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水甘油通道蛋白9短发夹RNA的构建与筛选及其对非酒精性脂肪性肝病细胞模型的作用

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中华肝脏病杂志 2013年第3期21卷 222-227页

作者：王川亢渝俊姜政王丕龙重庆市第三人民医院消化内科 400014 重庆医科大学附属第一医院消化内科

目的构建人水甘油通道蛋白9（AQP9）短发夹RNA（shRNA），筛选出沉默效果明显的重组质粒，检测AQP9的shRNA对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型的作用。方法设计合成针对人AQP9的小干扰RNA，退火形成双链shRNA后插入pGensil-1质粒中... 详细信息

目的构建人水甘油通道蛋白9（AQP9）短发夹RNA（shRNA），筛选出沉默效果明显的重组质粒，检测AQP9的shRNA对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）细胞模型的作用。方法设计合成针对人AQP9的小干扰RNA，退火形成双链shRNA后插入pGensil-1质粒中，并将其转染L02肝细胞，逆转录一聚合酶链反应（RT-PCR）及Westem blot筛选出沉默效果明显的重组质粒。经油酸诱导L02细胞脂肪变性建立NAFLD细胞模型，通过油红O染色，测定甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量，检测重组质粒对NAFLD细胞模型的作用。数据比较采用方差分析。结果经RT-PCR及Westem blot筛选，pshRNA—AQP9a转染组mRNA及蛋白质相对表达率为25．10％士1．19％及25．41％±1．96％，与未处理L02细胞组的39．33％±1．69％及35．08％±1．89％相比，均明显降低∽值均〈0．01）；将重组质粒pshRNA-AQP9a转染NAFLD细胞模型能够降低其AQP9的mRNA及蛋白质表达量；油红O染色结果显示，油酸／pshRNA-AQP9a转染组细胞内脂质含量明显减少。油酸／pshRNA-AQP9a转染组细胞内甘油三酯、游离脂肪酸及甘油含量分别为（2．738±0．231）mmol／L、（1．182±0．168）mmol／L和（0．730±0．084）mmol／L，油酸组分别为（3．218土0．220）mmol／L、（1．538±0．193）mmol／L及（1．024±0．148）mmol／L，油酸／pshRNA-AQP9a转染组均明显降低（尸值均〈0．05）。结论降低AQP9表达量能够减轻NAFLD细胞模型的脂肪变l生程度，为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。

关键词：水甘油通道蛋白质类 RNA干扰基因沉默短发夹RNA 脂肪肝非酒精性

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SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9重组沙门菌的构建及表达

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重庆医学 2012年第33期41卷 3465-3467,3470,F0002页

作者：王川亢渝俊姜政王丕龙重庆医科大学附属第一医院消化内科 400016

目的将人水甘油通道蛋白9(AQP9)真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9及干扰质粒pshRNA-AQP9通过电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207,并验证其表达情况,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的作用奠定基础。方法从人肝脏组织中通过RT-PCR获得AQP9基... 详细信息

目的将人水甘油通道蛋白9(AQP9)真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9及干扰质粒pshRNA-AQP9通过电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207,并验证其表达情况,为阐明AQP9在非酒精性脂肪肝病(NAFLD)中的作用奠定基础。方法从人肝脏组织中通过RT-PCR获得AQP9基因,克隆到载体pEGFP-N1上,构建真核表达质粒pEGFP-N1-AQP9,设计合成针对人AQP9的siRNA,退火形成双链shRNA,并插入pGenesil-1质粒中,构建干扰质粒pshRNA-AQP9,电穿孔转化减毒沙门菌株SL7207,通过PCR、Western blot验证其表达情况,并检测其稳定性。结果成功构建pEGFP-N1-AQP9及pshRNA-AQP9重组质粒,将其转化SL7207后,能在重组沙门菌中表达。结论成功构建SL7207/pEGFP-N1-AQP9及SL7207/pshRNA-AQP9重组沙门菌,为进一步研究AQP9对NAFLD的基因治疗奠定基础。

关键词：水甘油通道蛋白质类非酒精性脂肪肝病重组质粒基因治疗

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