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水孔蛋白协助玉米副卫细胞中H_2O_2的跨膜转运

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2017年第5期45卷 34-40页

作者：王巧艳李思张莉姚雅琴西北农林科技大学生命科学学院陕西杨凌712100 中国科学院水利部水土保持研究所陕西杨凌712100

【目的】探索玉米气孔副卫细胞中H_2O_2的来源,以阐明禾本科植物气孔运动过程中保卫细胞和副卫细胞协同调节的机理。【方法】采用细胞化学方法对H_2O_2进行亚细胞荧光定位,以Tubulin和GAPDH为内参基因,利用qPCR技术,对玉米水孔蛋白基因Z... 详细信息

【目的】探索玉米气孔副卫细胞中H_2O_2的来源,以阐明禾本科植物气孔运动过程中保卫细胞和副卫细胞协同调节的机理。【方法】采用细胞化学方法对H_2O_2进行亚细胞荧光定位,以Tubulin和GAPDH为内参基因,利用qPCR技术,对玉米水孔蛋白基因ZmPIP2;4、ZmPIP2;5和ZmPIP2;6表达量进行分析,从而确定水孔蛋白协助玉米副卫细胞中H_2O_2的跨膜转运。【结果】光暗处理组,加水孔蛋白抑制剂AgNO_3与不加AgNO_3副卫细胞中的H_2O_2积累相反;外源H_2O_2引起副卫细胞中H_2O_2积累,先加入水孔蛋白抑制剂AgNO_3再加外源H_2O_2处理后副卫细胞中H_2O_2不积累;短细胞发生后,副卫细胞中的H_2O_2开始积累,同时ZmPIP2;5基因的相对表达量上调;随着水分胁迫程度增加,ZmPIP2;4、ZmPIP2;5、ZmPIP2;6基因的相对表达量随短细胞发生上调。【结论】水孔蛋白具有转运H_2O_2的功能,玉米叶片下表皮副卫细胞中的H_2O_2是外源的,其积累和清除可能与水孔蛋白ZmPIP2;5的转运有关。

关键词：副卫细胞水孔蛋白 H2O2 跨膜转运

水孔蛋白在细胞延长、盐胁迫和光合作用中的作用(英文)

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生物工程学报 2009年第3期25卷 321-327页

作者：杨淑慎崔丽荣西北农林科技大学生命科学学院杨凌712100

水孔蛋白属于一个高度保守的、能够进行跨生物膜水分运输的通道蛋白MIP家族。水孔蛋白作为膜水通道,在控制细胞和组织的水含量中扮演重要角色。本研究的重点是属于PIP亚家族的GhPIP1;2和属于TIP亚家族的γTIP1在植物细胞延长中的作用。... 详细信息

水孔蛋白属于一个高度保守的、能够进行跨生物膜水分运输的通道蛋白MIP家族。水孔蛋白作为膜水通道,在控制细胞和组织的水含量中扮演重要角色。本研究的重点是属于PIP亚家族的GhPIP1;2和属于TIP亚家族的γTIP1在植物细胞延长中的作用。使用特异基因探针的Northern杂交和实时荧光PCR技术证明GhPIP1;2和GhγTIP1主要在棉花纤维延长过程中显著表达,且最高表达量在开花后5d。在细胞延长过程中,GhPIP1;2和GhγTIP1表达显著,表明它们在促使水流迅速进入液泡这一过程中扮演重要角色。而且也研究了盐胁迫植物中钙离子对水孔蛋白的影响。分别或一起用NaCl或CaCl2处理原生质体或细胞质膜。结果发现在盐胁迫条件下,水渗透率值在原生质体和质膜颗粒中都下降了,同时PIP1水孔蛋白的含量也下降了,表明NaCl对水孔蛋白的功能和含量有抑制作用。同时也观察了Ca2+的两种不同的作用。感知胁迫的胞质中游离钙离子浓度的增加可能导致水孔蛋白的关闭。而过剩的钙离子将导致水孔蛋白的上游调控。同时实验已经证明大麦的一类水孔蛋白-HvPIP2;1有更高的水和CO2转移率。本研究的目标是确定负责转运水和CO2的关键水孔蛋白的类型,并且提高植物对水的利用率、抵抗胁迫的能力,促进CO2的摄取及吸收、提高植物的产量。

关键词：水孔蛋白细胞延长盐胁迫光合作用

大麦浆片水孔蛋白基因的克隆及其在开闭颖上的功能分析

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大麦浆片水孔蛋白基因的克隆及其在开闭颖上的功能分析

作者：李琪浙江大学

学位级别：硕士

禾本科植物的开颖是其进行有性繁殖的重要过程,而颖花开闭的调节是高效开展杂交育种和制种的关键限制因素之一,对农业生产具有重要的利用价值。禾本科植物的颖花开放由一对位于颖花基部的浆片吸水膨大启动,而细胞内水分的跨膜转运则通... 详细信息

禾本科植物的开颖是其进行有性繁殖的重要过程,而颖花开闭的调节是高效开展杂交育种和制种的关键限制因素之一,对农业生产具有重要的利用价值。禾本科植物的颖花开放由一对位于颖花基部的浆片吸水膨大启动,而细胞内水分的跨膜转运则通过膜上的水孔蛋白(AQPs)来实现。大麦(Hordeum vulgare L.)是世界上第四大谷类作物,但其绝大多数品种具有闭颖授粉特性,严重制约了大麦杂种优势的利用。因此,挖掘调控大麦开颖的关键基因对于促进大麦杂交育种意义重大。本研究以开颖大麦品种“沪1154”为材料,结合颖花开闭过程中的6个关键时期(S1-S6)浆片样品的转录组测序和基因家族分析结果,筛选获得响应颖花开闭的AQPs基因;随后利用多物种进化分析和绝对定量分析揭示了候选AQPs基因在进化历程和被子植物开花功能上的保守性;最后通过在水稻中异源表达验证进一步证明了候选AQPs基因在浆片膨大过程中的功能,为深入解析禾本科作物开闭颖的分子调控机制奠定了基础。主要研究结果分述如下:1.大麦开闭颖过程中浆片转录组分析本试验根据大麦开闭颖过程中6个关键时期,即大麦小花花药绿体期(S1)、花药黄体期(S2)、开颖起始花丝伸长至颖壳顶部(S3)、开颖角度最大花药外露(S4)、关颖一半花粉散尽(S5)和完全关颖(S6),采集处于同一时期的浆片进行转录组分析。以S1时期作为对照,S2-S6时期共有3,636个上调的差异表达基因(DEGs)和1,711个下调的DEGs。上调的DEGs数量随着颖花开放过程呈增加趋势,从20个增加到599个。GO分析显示上调的DEGs显著富集在“碳水化合物代谢”、“转运”和“信号转导”等过程,涉及淀粉水解、细胞壁多糖代谢相关基因以及钙调素(CaM)和钙依赖性蛋白激酶(CDPK)等钙结合蛋白。“转运”相关的DEGs在S2-S6时期所有DEGs中占3.5%～17%,主要包括钾离子转运蛋白、糖转运蛋白和AQPs等。其中,AQPs基因在参与“转运”的DEGs中占6%-8%,表明这些AQPs基因在大麦开闭颖过程中浆片的膨大与收缩运动上可能具有重要作用。2.大麦HvAQP基因家族成员鉴定与时空表达谱分析本试验采用生物信息学方法对大麦全基因组内的AQP基因家族成员进行鉴定,并分析其染色体分布、系统发育、基因结构、蛋白序列相似度、启动子顺式调控元件、组织表达模式及其对颖花开放过程的响应。试验共鉴定到38个HvAQPs基因,随机分布在7条染色体上。系统发育分析表明,这些HvAQPs基因组成了 4个进化枝,对应PIPs、TIPs、NIPs和SIPs 4个亚家族。针对植物进化分枝上重要的42种陆生植物和藻类进行蛋白序列相似度分析发现,PIP亚家族成员序列在除藻类以外的大多数物种中高度保守,其次是TIP和NIP。基因结构分析显示,除两个SIPs成员含有NPL或NPT基序外,其他AQPs成员均含有NPA基序,且多数成员由3-5个外显子组成。启动子顺式作用元件分析结果表明,大多数AQPs成员含有发育相关、应激反应和激素反应的调控元件,如脱落酸响应、MYB与干旱诱导相关的结合位点和CGTCA-motif等结合元件。此外,利用转录组分析发现,在抽穗开花期,HvAQP家族有11个成员在大麦根、茎、叶、穗轴、颖片、花药、雌蕊和浆片等8个组织中均有表达,但它们的表达水平有所不同。HvTIP4;1、HvTIP4;2、HvPIP2;2、HvPIP2;8、HvLsi1 和 HvLsi6 在营养器官中表达量显著高于生殖器官;HvTIP1;2主要在颖片、叶片和浆片表达;而HvSIP2;1和HvTIP5;1在花药中表达量较高,由此可推测在大麦对复杂多变生存环境的适应过程中,HvAQPs的功能发生了明显分化。另外,在大麦颖花开闭颖过程中鉴定获得10个差异表达的HvAQPs基因,其中HvTIP1;1、HvTIP1;2、HvTIP2;3和HvPIP2;1不仅在浆片中大量表达而且响应整个开闭颖过程,因此被选取作为后续研究的候选HvAQPs基因。3.TIP1;1、TIP1;2、TIP2;3和PIP2;1多物种进化分析及其在被子植物开花过程中的功能验证基于OneKP数据库1,231个植物物种的系统发育分析显示,TIP1;1、TIP1;2、TIP2;3和PIP2;1蛋白在植物进化历程中,尤其是在被子植物中高度保守。因此,本试验分别选取3个单子叶(大麦、水稻、玉米)和双子叶(棉花、烟草、番茄)植物,对以上4个候选AQPs的同源基因在开花前(S1)和开花时(S4)的浆片或花瓣中的表达水平进行绝对定量分析,结果显示这4个AQPs基因在供试的6个物种中均显著响应开花过程,表明它们在被子植物的开花过程中具有较为保守的功能。亚细胞定位结果显示,HvTIP 1;1、HvTIP 1;2和HvTIP2;3位于液泡膜上,而HvPIP2;1则位于细胞膜上。利用pV1301-V5过表达载体对水稻品种Nipponbare进

关键词：大麦(Hordeum vulgare L.) 开闭颖浆片水孔蛋白转录组测序全基因组鉴定进化异源过表达

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植物水孔蛋白PIP2表达量快速无标记检测

大连理工大学学报 2020年第1期60卷 15-21页

作者：徐铭赵子健夏秀英大连理工大学生物工程学院

相较于传统的抗体检测,适配体更易于大量快速合成,且可和多种检测技术相结合,在蛋白检测方面具有巨大的潜力.水孔蛋白作为生物体内水分跨膜运输的主要途径,了解其表达量的变化在植物水代谢研究中有着重要意义.利用传统的混合列分法构建... 详细信息

相较于传统的抗体检测,适配体更易于大量快速合成,且可和多种检测技术相结合,在蛋白检测方面具有巨大的潜力.水孔蛋白作为生物体内水分跨膜运输的主要途径,了解其表达量的变化在植物水代谢研究中有着重要意义.利用传统的混合列分法构建了8个C端恒定半胱氨酸残基的类肽适配体文库,结合表面等离激元共振成像技术,筛选得到能特异性结合高等植物水孔蛋白PIP2的类肽适配体PPA7,其亲和力 K D高达2.52×10 -9 mol/L.利用PPA7检测了石竹玻璃化和正常植株的水孔蛋白表达量,结果表明,石竹玻璃化植株的水孔蛋白表达量显著高于正常植株.研究提供了一种新的植物蛋白定量检测策略,也为进一步明确水孔蛋白在组培苗玻璃化发生中的作用奠定了基础.

关键词：水孔蛋白 PIP2 类肽适配体表面等离激元共振成像快速无标记检测

HA标签的水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因植物双元表达载体构建及转基因水稻的获得

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华北农学报 2019年第5期34卷 59-64页

作者：王晓静孙林静孙玥张融雪李军玲闫双勇苏京平天津市农作物研究所天津市农作物遗传育种重点实验室

为研究水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因在非生物胁迫中的生物学功能,根据OsPIP2;7基因序列设计特异性引物,以水稻品种中花11的三叶龄叶片RNA反转录的cDNA第一链为模板,克隆OsPIP2;7。采用嵌套PCR的方法,将3×HA标签的碱基序列连接在去除终止子... 详细信息

为研究水稻水孔蛋白OsPIP2;7基因在非生物胁迫中的生物学功能,根据OsPIP2;7基因序列设计特异性引物,以水稻品种中花11的三叶龄叶片RNA反转录的cDNA第一链为模板,克隆OsPIP2;7。采用嵌套PCR的方法,将3×HA标签的碱基序列连接在去除终止子OsPIP2;7基因序列的3′端,然后将此核酸片段插入到植物双元表达载体pHB中,构建pHB-OsPIP2;7-3×HA载体。以中花11成熟胚愈伤组织为材料,采用农杆菌介导的方法进行遗传转化,经过在含有潮霉素的培养基上筛选和分化,获得阳性转化子。提取转基因植株的DNA,进行潮霉素阳性植株的筛选。将阳性植株进行RNA表达检测,获得OsPIP2;7基因表达量上升的转基因阳性植株。为了检测转基因植株中OsPIP2;7蛋白的表达情况,提取OsPIP2;7基因表达上升的转基因植株膜蛋白后,用HA抗体进行杂交的Western-blot检测结果显示,OsPIP2;7-HA蛋白在转基因阳性植株体内过量表达。获得的过表达OsPIP2;7转基因新材料,将为研究OsPIP2;7基因的生物学新功能提供试验基础。

关键词：水稻水孔蛋白 HA标签蛋白表达

生物信息学手段鉴定和分析蒺藜苜蓿基因组中水孔蛋白基因家族

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分子植物育种 2018年第14期16卷 4592-4599页

作者：李菲何小红李欲柯乙引贵州师范大学生命科学学院贵州省植物生理与发育调控重点实验室贵阳550025

植物水孔蛋白不仅调控水分运输,同时还可以在植物细胞间传递气体如CO2,和营养物质如硼(B)、硅(Si和活性氧(ROS)),是多功能的蛋白质。植物水孔蛋白的功能对于植物生长和非生物胁迫的反应也起到重要的作用。对蒺藜苜蓿基因组序列进行检索... 详细信息

植物水孔蛋白不仅调控水分运输,同时还可以在植物细胞间传递气体如CO2,和营养物质如硼(B)、硅(Si和活性氧(ROS)),是多功能的蛋白质。植物水孔蛋白的功能对于植物生长和非生物胁迫的反应也起到重要的作用。对蒺藜苜蓿基因组序列进行检索和筛选,共鉴定出46个水孔蛋白基因。蒺藜苜蓿水孔蛋白基因大小较为集中均一(绝大多数由200~400个氨基酸编码)。等电点的分布则较为分散,从最小pH 4.80(Medtr5g-012810.1)到最大pH 9.83(Medtr4g049340.1),均有分布,并无明显的集群特征。蒺藜苜蓿水孔蛋白基因的结构较为一致(2~4个内含子)。结合染色体定位和系统进化分析,蒺藜苜蓿二号染色体上同一位点的两对基因,分别是Medtr2g017570.1和Medtr2g017610.1,Medtr2g017590.1和Medtr2g017620.1,基因序列几乎完全一致。应该是由于基因扩增产生的。而Medtr2g017590.1和Medtr2g017620.1两个基因的表达模式,虽然有差别,但是聚集在一个表达模式聚类分枝上。这两个基因功能上的相互关系,很值得进一步的研究。

关键词：蒺藜苜蓿水孔蛋白系统进化抗逆

大豆NIP类水孔蛋白基因的鉴定及表达特性分析

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浙江农业学报 2018年第7期30卷 1101-1109页

作者：吴伟冯志娟徐盛春刘娜张古文胡齐赞龚亚明浙江省种子管理总站浙江杭州310020 浙江省农业科学院蔬菜研究所浙江杭州310021

NIPs(nodulin 26-like intrinsic proteins)是类根瘤菌26膜内在蛋白,属于水孔蛋白的一个亚类,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。利用大豆基因组数据库,在全基因组水平共鉴定得到13个GmNIPs。染色体定位分析显示,这些GmNIPs基因分... 详细信息

NIPs(nodulin 26-like intrinsic proteins)是类根瘤菌26膜内在蛋白,属于水孔蛋白的一个亚类,在植物逆境胁迫应答过程中发挥重要作用。利用大豆基因组数据库,在全基因组水平共鉴定得到13个GmNIPs。染色体定位分析显示,这些GmNIPs基因分布在大豆11条染色体上。理化性质分析显示,GmNIPs蛋白氨基酸数目为261~296,蛋白分子量为27~32 ku,蛋白等电点为6~10。蛋白多序列比对分析发现,所有GmNIPs均含有水通道蛋白的典型结构,6个保守的跨膜螺旋(TM1-TM6)和2个保守的氨基酸元件NPA盒(Asp-ProAla box)。进化树分析发现,大豆GmNIPs与拟南芥和水稻NIPs分类完全一致。基因结构分析显示,所有GmNIPs基因均由5个外显子和4个内含子组成。启动子分析表明,多数GmNIPs基因的上游启动子区含有逆境和激素应答元件。组织表达分析发现,5个GmNIPs的基因表达量相对较高。进一步,利用荧光定量PCR对Gm NIP1;5的干旱胁迫表达特性进行了分析。

关键词：大豆 NIP 水孔蛋白全基因组鉴定组织表达干旱应答

22种植物水孔蛋白理化性质及其结构特征的生物信息学分析

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植物生理学报 2015年第1期51卷 97-104页

作者：冉昆魏树伟王宏伟张勇王少敏山东省果树研究所山东泰安271000

水孔蛋白（aquaporins,AQPs）是高效转运水分子的膜内在蛋白,具有丰富的多样性,在调控植物的水分关系中有重要作用。本研究采用Blast、Prot Param、Signal P和Swiss-Model等生物信息学软件,对梨、苹果、黄瓜和番茄等22种植物AQP的理化... 详细信息

水孔蛋白（aquaporins,AQPs）是高效转运水分子的膜内在蛋白,具有丰富的多样性,在调控植物的水分关系中有重要作用。本研究采用Blast、Prot Param、Signal P和Swiss-Model等生物信息学软件,对梨、苹果、黄瓜和番茄等22种植物AQP的理化性质、蛋白结构、系统发生树和功能域等进行了分析。结果表明,AQP蛋白氨基酸长度在284-295 aa之间,理论等电点在7.67-9.30之间,主要定位于质膜上,除红叶藜外均为稳定性蛋白。二级结构由α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延伸链等结构元件组成,空间结构高度相似,属于主要内在蛋白（MIP）家族。

关键词：水孔蛋白理化性质系统进化结构特征

玉米水孔蛋白基因ZmPIP4c作为C_(4)特征性基因的确定

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分子植物育种 2021年第9期19卷 2819-2825页

作者：李享梁玉玲刘征马峙英河北农业大学农学院华北作物改良与调控国家重点实验室保定071001 河北大学生命科学学院保定071002

水孔蛋白作为跨膜运输的一种通道蛋白,不仅可以对植物体内的水分进行运输,同时也对CO2、H2O2等小分子进行运输,影响光合作用等生理代谢过程。尽管光合作用对植物的生长发育至关重要,C_(3)植物与C_(4)植物的光合作用机制却不尽相同,原因... 详细信息

水孔蛋白作为跨膜运输的一种通道蛋白,不仅可以对植物体内的水分进行运输,同时也对CO2、H2O2等小分子进行运输,影响光合作用等生理代谢过程。尽管光合作用对植物的生长发育至关重要,C_(3)植物与C_(4)植物的光合作用机制却不尽相同,原因之一是C_(3)植物与C_(4)植物在叶片解剖结构上的差异,C_(4)植物拥有更膨大、更发达的维管束鞘细胞,有利于水分的储存。因此,我们对C_(4)模式植物玉米的水孔蛋白进行了一系列生物信息学分析,其中一个命名为ZmPIP4c的基因,该基因呈现叶片维管束鞘细胞特异性高表达,有利于水分通过该蛋白进入鞘细胞储存,并平衡叶肉细胞的水分供应。而且该基因从叶基部到叶尖的表达趋势不但与用来筛选C_(4)光合作用有关转录本的标志基因——NAD-苹果酸酶基因(NAD-ME)表达趋势一致,并与C_(4)循环其他关键基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)以及碳酸酐酶(CA)表达趋势一致,均为从叶基部到叶尖表达逐渐上调,表明ZmPIP4c基因参与C_(4)叶片的细胞特异性特征的构成,为C_(4)特征的组成部分。此外,ZmPIP4c基因与C_(4)光合作用关键基因PEPC、CA、NAD-ME在时间节律中的表达趋势一致,表明在光照情况下,该基因为束鞘细胞中所进行的C_(4)光合作用提供了充足的水环境,并避免束鞘细胞在黑暗条件下积累过多的水分,而造成水分和能量的浪费。另外,在盐胁迫下束鞘细胞特异性表达基因ZmPIP4c和叶肉细胞特异性表达的PEPC以及CA均呈现下调趋势。由于叶片束鞘细胞和叶肉细胞间存在水力传导信号,该水孔蛋白基因表达下调,可能改变了叶肉细胞内的水溶液环境,进而对PEPC和CA的表达产生影响。总之,对玉米水孔蛋白ZmPIP4c基因的研究,为我们深入研究C_(4)植物中尚未确定的C_(4)新特征提供了候选基因,并有助于我们深入了解细胞特异性水孔蛋白基因介入C_(4)循环过程的分子机制。

关键词：玉米 C_(4)光合作用水孔蛋白生物信息基因表达