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果蝇FKBP39调节Nprl2/3表达和TORC1活性的机制研究

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果蝇FKBP39调节Nprl2/3表达和TORC1活性的机制研究

作者：郭剑扬州大学

学位级别：硕士

在真核生物中,雷帕霉素复合物1(Target of rapamycin complex 1,TORC1)是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的保守蛋白复合体,可以通过感知机体内的营养和能量状态来控制细胞的生长。在营养充足的条件下,TORC1活性增加,通过磷酸化并激活S6... 详细信息

在真核生物中,雷帕霉素复合物1(Target of rapamycin complex 1,TORC1)是一种具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的保守蛋白复合体,可以通过感知机体内的营养和能量状态来控制细胞的生长。在营养充足的条件下,TORC1活性增加,通过磷酸化并激活S6激酶(S6Ks)和eIF-4E结合蛋白(4E-BPs)等,从而促进蛋白质的合成;在营养缺乏的条件下,TORC1活性降低,解除对自噬的抑制,促进细胞内的蛋白质降解为小分子物质并被利用。营养成分如氨基酸主要通过调节异二聚体Rags GTP酶RagA/B和RagC/D的结合来控制TORC1的活性。氨基酸充足时,Rags GTP酶形成RagA/B结合GTP,RagC/D结合GDP的状态,激活TORC1;氨基酸缺乏时,形成RagA/B结合GDP,RagC/D结合GTP的状态,抑制TORC1活性。GATOR1复合体由Nprl2,Nprl3和Imll/DEPDC5三种蛋白构成,具有Rags GAP酶激活蛋白(GAP)活性,可以水解与RagA/B结合的GTP为GDP,从而抑制TORC1活性。为了研究营养状态是否调节GATOR1组分蛋白的表达,我们在果蝇的S2细胞中,通过Westernblot的方式检测GATOR1的组分蛋白Npr13在不同营养状态下的表达差异,发现氨基酸缺乏可以诱导内源Npr13蛋白表达增加,但在转录水平并不影响nprl3 mRNA的表达,提示氨基酸缺乏通过转录后调节机制控制Nprl3的表达。为了探索氨基酸缺乏是否影响Nprl3的蛋白稳定性,我们在细胞中转染带V5标签的Npr13外源蛋白,并用蛋白合成抑制剂Cycloheximide(CHX)处理细胞,发现氨基酸缺乏使外源Nprl3蛋白降解速度减缓,表明氨基酸缺乏通过增加 Nprl3的蛋白稳定性,进而提高其表达。为了探寻氨基酸调节Nprl3蛋白表达的机制,我们通过液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS),发现FK506 binding protein 39 kDa(FKBP39)可能与Nprl3蛋白结合。我们通过免疫共沉淀(Co-IP)的方法,验证了 Nprl3与FKBP39在细胞中的结合。更重要的是,我们发现通过RNA干扰的方法降低FKBP39表达可以引起细胞内Nprl3表达的升高。提示FKBP39可能与Nprl3结合,促进Nprl3蛋白的降解。通过CHX处理S2细胞,发现在fkbp39 RNAi的条件下,Nprl3蛋白的稳定性增加。以上结果说明:在氨基酸充足的条件下,FKBP39与Nprl3结合,通过促进Npr13的降解,从而抑制Nprl3的表达;氨基酸缺乏可以解除FKBP39对Nprl3蛋白降解的促进作用,Nprl3蛋白的稳定性增加,表达升高。为了验证营养状态是否通过FKBP39调控GATOR1组分蛋白Npr12的表达,我们在S2细胞中进行了验证,发现与Nprl3蛋白类似,在氨基酸饥饿时Nprl2蛋白表达的增加也依赖于FKBP39蛋白。为了探索FKBP39的生理功能,我们通过CRISPR-Cas9的方法构建了 fkbp39突变体果蝇。通过对fkbp39突变体和RNA干扰果蝇的卵巢进行Western blot检测,在机体水平确认了在FKBP39抑制Nprl3的表达。对fkbp39突变体果蝇卵巢体外培养进行氨基酸饥饿,发现与对照果蝇中氨基酸诱导Nprl3表达量增加不同,fkbp39突变体果蝇中的Nprl3表达水平不能随氨基酸饥饿而升高。通过对fkbp39突变体中p-4EBP和p-S6K的活性的检测,发现TORC1的下游效应蛋白4EBP和S6K的磷酸化水平降低,表明fkbp39突变体中的TORC1活性降低。以上结果表明在机体水平FKBP39可以通过调节GATOR1的表达介导氨基酸对TORC1的活性调控。通过果蝇细胞和成体的实验,我们阐明了体内的氨基酸水平通过FKBP39调节GATOR1组分蛋白Nprl3的稳定性,进而调控TORC1活性的机制。该研究为深入解析营养状态对TORC1的活性调节机制奠定基础。

关键词： TORC1 GATOR1 Nprl3 FKBP39 氨基酸饥饿

阪崎克罗诺肠杆菌胞外多糖合成的调控机制研究

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阪崎克罗诺肠杆菌胞外多糖合成的调控机制研究

作者：陈思江南大学

学位级别：硕士

Cronobacter sakazakii是种条件致病菌,能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症。本研究以*** BAA-894为背景菌株,通过对其表型及胞外分泌物的观察发现阪崎克罗诺肠杆菌与常见的大肠杆菌存在很大的差别,然后通过定性及定量研究... 详细信息

Cronobacter sakazakii是种条件致病菌,能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症。本研究以*** BAA-894为背景菌株,通过对其表型及胞外分泌物的观察发现阪崎克罗诺肠杆菌与常见的大肠杆菌存在很大的差别,然后通过定性及定量研究探索内部调控和脂多糖结构变化对*** BAA-894产生胞外多糖的影响,以转录组数据分析表型实验现象及其它基因的表达差异变化,并对不同生长环境及脂多糖结构下的阪崎肠杆菌进行了抗药性分析。具体研究成果如下:(1)M9是基本培养基,LB则富含大量且多样的氨基酸物质。***在M9培养基上生长时菌落的周围会分泌高度透明和充满粘性的物质,通过丹宁媒染法和高效液相色谱的鉴定,证明***中这种胞外分泌物为可拉酸(Colanic acid)。但***在LB培养基中不会分泌黏性物质。在*** BAA-894中构建可拉酸合成酶wcaDE缺失突变株后,可拉酸分泌消失;构建RCS磷酸传递系统的五个基因rcsA,rcsB,rcsC,rcsD和rcsF缺失突变株后发现可拉酸的合成由此系统进行调控。(2)以LB培养基为对照的M9培养基中,***有关于可拉酸生物合成的基因簇大幅度上调,对应可拉酸的定量和染色数据;鞭毛形成和趋化性相关基因呈现下调;氨基酸的生物合成受到了更广泛的调控,亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸合成加强。说明***在营养缺乏的生长环境中会增加胞外多糖分泌,减少鞭毛等附属结构的合成,降低细胞的运动性以节省能量用于生长,选择性地生产氨基酸来满足自身生长所需的氮源。(3)在M9培养基中添加混合氨基酸进行可拉酸定量与丹宁媒染,可拉酸产量降低,说明氨基酸的缺乏导致***大量分泌可拉酸。采用药敏试纸对*** BAA-894在不同培养基上的抗药性进行实验,在M9培养基表现出更强的敏感性,但是氨基酸的含量对细菌抗药性的影响不大。(4)在*** BAA-894中ESAS18930为编码O-抗原连接酶的基因,此基因缺失后BAA-894脂多糖糖链变短,胞外多糖分泌下降,细菌的自凝集性、疏水性、外膜渗透性及外膜形成方面都发生巨大变化。耐药性方面,△ESAS18930对氯霉素、新霉素和新生霉素的敏感性小于野生型BAA-894;△ESAS18930在M9培养基中对红霉素和克拉霉素敏感性小,对其它抗生素的敏感性比LB大。缺失ESAS18930后***在M9培养基中的基因转录水平相较于野生型发生改变,有关于可拉酸生物合成的基因簇下调,与定量和染色结果一致;鞭毛形成和趋化性有关的基因基本呈现上调状态;抗药性有关的调控基因也存在差异表达。说明O-抗原缺失会导致胞外多糖分泌下降,鞭毛形成增多且运动性加强,抗药性变化大。

关键词：阪崎肠杆菌胞外多糖可拉酸 O-抗原氨基酸饥饿

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拟南芥GCN20的功能研究

拟南芥GCN20的功能研究

作者：杜洋河南农业大学

学位级别：硕士

植物生长是一个涉及众多外界环境因素和生物体内众多基因表达的复杂过程。在复杂多变的自然环境中,植物的生长经常会受到多种环境因素胁迫,如干旱、高/低温、紫外线以及盐等非生物胁迫;真菌、细菌、病虫害及植物竞争性生长等生物胁迫。... 详细信息

植物生长是一个涉及众多外界环境因素和生物体内众多基因表达的复杂过程。在复杂多变的自然环境中,植物的生长经常会受到多种环境因素胁迫,如干旱、高/低温、紫外线以及盐等非生物胁迫;真菌、细菌、病虫害及植物竞争性生长等生物胁迫。在真核生物中,应对氨基酸饥饿,生物体内主要有GCN（general control non-derepressible）系统相关蛋白参与的调控机制来响应胁迫。例如,在酵母细胞中,当氨基酸缺乏时,空载t RNA大量积聚,随后,进入核糖体A位与GCN2相结合,在核糖体上的GCN1-GCN20复合体激活e IF2α的激酶GCN2;GCN2磷酸化翻译起始因子e IF2α,调控蛋白质的合成。在拟南芥中,也存在与酵母蛋白质同源关系较近的GCN系统,来参与蛋白质翻译的调节过程。其中,拟南芥中的At GCN20与酵母细胞中GCN20具有较高的同源性,先前对酵母中GCN20的研究成果能够对拟南芥中At GCN20的研究提供参考。我们在拟南芥gcn20突变体中分别过表达拟南芥At GCN20和酵母GCN20,并获得了转基因植株。通过后续实验论证,在低温处理条件下gcn20突变体幼苗叶心发黄;除此之外,我们观察到生长4周左右的gcn20突变体幼苗的叶片发黄。同时,我们通过不同条件脱落酸（Abscisic Acid,ABA）、高盐、渗透和氨基酸饥饿等处理gcn20突变体种子时发现,相比较野生型拟南芥,突变体种子的萌发率显著降低;当在gcn20背景下过表达At GCN20后,回复突变体种子的萌发率恢复至野生型水平。综上所述,At GCN20可能通过参与蛋白质翻译起始途径来应答各种胁迫,最终促进种子的萌发。

关键词：植物逆境氨基酸饥饿 GCN20 蛋白质翻译

磷酸酶PP2AC在大肠癌中正向调节mTORC1的功能及机制研究

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磷酸酶PP2AC在大肠癌中正向调节mTORC1的功能及机制研究

作者：蔡未央上海交通大学

学位级别：硕士

研究目的探讨PP2AC蛋白在大肠癌中的表达及其恶性生物学作用。探讨氨基酸饥饿条件下PP2AC对mTORC1信号通路的作用及调节机制。研究方法1.应用大肠癌组织芯片（Hcol-Ade150CS-01）技术,收集75例大肠癌组织及与其配对的癌旁正常组织,进行... 详细信息

研究目的探讨PP2AC蛋白在大肠癌中的表达及其恶性生物学作用。探讨氨基酸饥饿条件下PP2AC对mTORC1信号通路的作用及调节机制。研究方法1.应用大肠癌组织芯片（Hcol-Ade150CS-01）技术,收集75例大肠癌组织及与其配对的癌旁正常组织,进行免疫组织化学染色,评估大肠癌组织和癌旁正常组织的PP2AC蛋白表达水平（H-Score评分）,统计学分析PP2AC蛋白表达水平与临床病理参数的关系。通过GEO与TCGA数据库,下载大肠癌芯片PP2AC mRNA数据,并进行统计学分析。2.通过裸鼠皮下移植瘤实验,探讨knockdown（KD）PP2AC对大肠癌移植瘤生长的影响。3.应用western blot等技术研究氨基酸饥饿条件下,过表达以及KD PP2AC对mTORC1信号通路的调节。应用单细胞克隆形成实验和软琼脂集落形成实验,探讨氨基酸饥饿条件下,PP2AC对大肠癌细胞生长和克隆形成能力的影响。4.应用免疫共沉淀和western blot技术探究氨基酸饥饿条件下,PP2AC对c-Myc的调节。应用cycloheximide chase assay探讨氨基酸饥饿下PP2AC对c-Myc蛋白稳定性的影响。构建并转染c-Myc野生型和c-Myc（T58A）突变体质粒,观察氨基酸饥饿条件下PP2AC对c-Myc磷酸化状态的调节。研究结果1.大肠癌组织PP2AC蛋白表达水平明显高于癌旁正常粘膜组织表达水平,并具有统计学差异（P＜0.01）。Meta分析GEO与TCGA数据中所有符合要求的大肠癌mRNA芯片结果,发现大肠癌组织中的PP2AC mRNA表达水平明显高于正常肠粘膜上皮,且具有统计学意义（P＜0.05）。PP2AC mRNA水平与DNA copy number具有显著的相关性（r=0.57,P＜0.01）。PP2AC表达水平与大肠癌较高T分期（P=0.008）、较差的TNM分期（P=0.015）相关。2.与转染空载质粒细胞相比,KD PP2AC明显抑制大肠癌裸鼠皮下移植瘤生长,并具有统计学差异。3.在氨基酸饥饿条件下,过表达PP2AC明显增强mTORC1通路活性,介导大肠癌细胞抵抗氨基酸饥饿,促进大肠癌细胞的增殖能力和软琼脂克隆形成能力;在氨基酸饥饿条件下,KD PP2AC进一步抑制mTORC1通路活性,抑制大肠癌细胞的增殖能力和软琼脂克隆形成能力。在氨基酸饥饿-回复实验中,过表达PP2AC使大肠癌细胞对氨基酸饥饿后再灌注更加敏感。4.在氨基酸饥饿条件下,PP2AC通过稳定c-Myc,进一步活化mTORC1信号通路,促进大肠癌细胞的增殖生长。KD c-Myc基因,可完全阻断PP2AC过表达所促进的mTORC1活化。过表达PP2AC明显提高c-Myc蛋白半衰期,上调c-Myc蛋白量。PP2AC促进c-Myc（T58）去磷酸化,增加c-Myc（S62）的磷酸化,进而提高c-Myc蛋白稳定性。研究结论PP2AC mRNA和蛋白在大肠癌组织中高表达,与促进大肠癌的生长增殖相关。在氨基酸饥饿条件下,高表达PP2AC通过稳定c-Myc正向调节mTORC1活性,致使大肠癌细胞抵抗氨基酸饥饿,促进大肠癌细胞在氨基酸饥饿的不利环境中生长增殖

关键词： PP2AC mTORC1信号通路大肠癌氨基酸饥饿 c-Myc

氨基酸营养剥夺调节细胞低密度脂蛋白摄取功能作用的研究

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氨基酸营养剥夺调节细胞低密度脂蛋白摄取功能作用的研究

作者：仵霄山东大学

学位级别：硕士

研究背景心脑血管疾病是目前世界范围内严重影响人类健康、大量消耗社会医疗资源的主要疾病之一,在中国,每年因心脑血管疾病死亡的人数大约有300万人。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病发病的主要原因之一,其中血浆低密... 详细信息

研究背景心脑血管疾病是目前世界范围内严重影响人类健康、大量消耗社会医疗资源的主要疾病之一,在中国,每年因心脑血管疾病死亡的人数大约有300万人。动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是心脑血管疾病发病的主要原因之一,其中血浆低密度脂蛋白胆固醇(Low Density Lipoprotein Chesterol,LDL-C)浓度与AS发生的风险呈正相关。低密度脂蛋白受体(LDL receptor,LDLR)与体内LDL的代谢密切相关。其中LDLR介导的经典的内吞途径是体内清除LDL的主要方式。目前在临床上广泛应用的他汀类药物能够通过调节LDLR的表达,降低血液中LDL-C的水平,从而有效预防心脑血管疾病的发生,但在家族性高胆固醇血症(familial hypercholesterolemia,FH)患者中,这些药物无法达到降低LDL-C和心血管疾病发生风险的目的,并且约有30%的患者对他汀类药物不耐受。因此,探索和发现新的治疗靶点和药物依然具有重要的现实意义。氨基酸代谢稳态对调节细胞的生物学功能起着至关重要的作用。有研究表明,氨基酸饥饿(Amino Acid Starvation,AAS)能通过作用于mTORC1信号通路来诱导细胞自噬,但AAS是否对细胞摄取LDL的功能有调节作用目前尚无文献报道。本课题中我们将研究AAS对细胞LDL内吞作用的影响及其可能的机制。研究目的1.研究AAS对LDL摄取功能的影响2.研究AAS对LDLR的表达和空间分布的影响3.研究AAS调节LDL摄取作用的可能机制研究方法1.在小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)和人肝癌细胞(HepG2)中,研究AAS对细胞摄取LDL的影响,随后在氨基酸缺乏的培养基中补全缺失的氨基酸成分对实验结果进行反向验证。用网格蛋白的抑制剂(Pitstop2和Dynasore)处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞摄取Dil-LDL的变化。观察低糖、低血清对LDL摄取的影响。选取8周龄经过基因型鉴定的WT小鼠和LDLR-/-小鼠分别提取肝脏原代细胞,体外培养,荧光显微镜检测AAS对Dil-LDL摄取的影响。2.用放线菌素D(Actinomycin D)和放线菌酮(Cycloheximide)处理细胞,抑制mRNA和蛋白的合成,激光共聚焦显微镜检测细胞对Dil-LDL的摄取。分别用流式细胞术、western blot的方法检测AAS刺激对细胞内LDLR、LC3B和p62表达的影响。用自噬的诱导剂雷帕霉素(Rapamycin)处理细胞,免疫荧光法检测LC3和Dil-LDL摄取的变化。用ATG5的siRNA抑制自噬反应,检测AAS对Dil-LDL摄取的影响。3.合成pEGFP-LDLR的质粒,转染细胞,采用荧光漂白后恢复(fluorescencerecovery after photobleaching,FRAP)方法观察AAS对LDLR分子的运动速率的影响。4.采用PI3K的抑制剂wortmannin、AKT激酶抑制剂AKT1/2、VPS34的抑制剂VPS34-IN1、SAR405处理细胞,激光共聚焦显微镜检测细胞摄取Dil-LDL的变化。将AAS对细胞摄取Dil-LDL的影响与他汀(Pravastatin)的作用相比较。研究结果1.在NIH-3T3和HepG2细胞中,给予不同时间的氨基酸饥饿,激光共聚焦显微镜结果显示,细胞时间依赖性的增加了 Dil-LDL的摄取,补全氨基酸后这种现象被逆转,而低糖和低血清对LDL的摄取无影响。网格蛋白抑制剂组抑制了 AAS增加LDL摄取的作用,在LDLR-/-的小鼠中,AAS对LDL摄取的作用无显著影响。*** D和Cycloheximide处理对细胞摄取LDL的作用无显著影响。Western Blot和PCR结果显示,AAS刺激对LDLR表达量无明显影响。流式细胞和免疫荧光法显示AAS后膜表面LDLR的表达增加。实时定量PCR和Western Blot结果显示,短暂的AAS没有影响p62和LC3B的表达。自噬的诱导剂Rapamycin处理对LDL的摄取无显著影响。同时,转染ATG5 siRNA抑制自噬反应,共聚焦显微镜结果显示ATG5 siRNA对Dil-LDL的摄取作用没有显著影响。***实验结果显示,AAS缩短了被漂白区域荧光恢复所需时间,提示AAS增加了LDLR的运动速度,进而增加了对LDL的转运。4.激光共聚焦显微镜结果显示,AKT1/2 inhibitor对AAS的作用无影响,SAR405、VPS34-IN1和wortmannin显著降低了 AAS对细胞摄取Dil-LDL的影响。短时间(4h)内,AAS和Pravastatin均增加了 Dil-LDL的摄取,AAS促Dil-LDL摄取的作用与他汀相似。

关键词：低密度脂蛋白低密度脂蛋白受体氨基酸饥饿动脉粥样硬化

带有bZIP DNA-结合区域的GCN4蛋白质和它的模型系统

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药物与人 2014年第7期27卷 76-76页

作者：汪晓平北京依诺泰药物化学技术有限公司

GCN4是转录调节蛋白质二聚体,它可以在氨基酸饥饿的条件下控制酵母中histidine的生物合成。GCN4DNA结合区域是碱性区域/leucine拉链（bZIP）结构。GCN4的leucine拉链结构二聚成coiled-coil结构。GCN4的碱性区域结构光滑地插入AP-1DNA片... 详细信息

GCN4是转录调节蛋白质二聚体,它可以在氨基酸饥饿的条件下控制酵母中histidine的生物合成。GCN4DNA结合区域是碱性区域/leucine拉链（bZIP）结构。GCN4的leucine拉链结构二聚成coiled-coil结构。GCN4的碱性区域结构光滑地插入AP-1DNA片段的两边并与DNA主沟的对面结合。脚印跟踪（foot-printing）和one/two hybrid system protocols被用来研究GCN4和AP-1结合的定量构效关系。Max2-Jun是来自GCN4的变体之一。Max2-Jun的检测和表达的初步结果（Agro gel和HPLC）以及Max2-Jun和Ebox/XRE1的初步结合实验（foot-printing）表明Max2-Jun可能伴随一些不需要的组分。这些不需要的组分可能不能从需要的DNA片段/蛋白质中除去并且可能影响（正的/负的）需要的结合作用。进一步的GCN4蛋白质模型系统的设计正在进行中。

关键词： DNA GCN4 模型系统氨基酸饥饿定量构效关系结合作用 histidine printing 主沟 leucine