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均匀设计法筛选淡竹叶内碳苷黄酮优化配比的实验研究

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中国科技论文 2017年第24期12卷 2803-2807页

作者：井汶黄志恒吴启南南京中医药大学药学院南京210000 江苏省中药资源产业化过程协同创新中心南京210023 中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心南京210023

为优化淡竹叶内主要碳苷黄酮的配比,利用均匀设计法,选择U12×(107)表设计实验方案,以淡竹叶内主要的7种碳苷黄酮为考察因素,采用氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导心肌细胞的损伤模型,以噻唑蓝(MTT)... 详细信息

为优化淡竹叶内主要碳苷黄酮的配比,利用均匀设计法,选择U12×(107)表设计实验方案,以淡竹叶内主要的7种碳苷黄酮为考察因素,采用氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)诱导心肌细胞的损伤模型,以噻唑蓝(MTT)法检测的细胞活力作为考察指标,优化碳苷黄酮配比并进行验证。结果表明:优化后的淡竹叶碳苷黄酮质量浓度配比为:异荭草苷∶日当药黄素∶阿福豆苷∶木犀草苷=0.822∶0.114∶0.268∶1.001,其细胞存活率显著上升(P<0.01)。基于均匀设计法优化的淡竹叶内碳苷黄酮配比可靠,具有很强的保护心肌细胞的作用。

关键词：中药资源生产和品质评价均匀设计淡竹叶碳苷黄酮心肌保护氧糖剥夺/复氧

葱白提取物对OGD/R诱导的RCMECs损伤的作用及机制

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中国老年学杂志 2024年第5期44卷 1197-1201页

作者：吴勇宏付聪刘翰田立群段刚峰卜文玉柯于鹤武汉市中西医结合医院湖北武汉430000

目的探讨葱白提取物(FOB)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞(RCMECs)损伤的作用及可能的机制。方法 CCK8检测FOB对正常RCMECs细胞的毒性作用;通过OGD/R方法构建RCMECs细胞损伤模型并利用CCK8检测细胞活力进行模型鉴... 详细信息

目的探讨葱白提取物(FOB)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的大鼠心肌微血管内皮细胞(RCMECs)损伤的作用及可能的机制。方法 CCK8检测FOB对正常RCMECs细胞的毒性作用;通过OGD/R方法构建RCMECs细胞损伤模型并利用CCK8检测细胞活力进行模型鉴定;CCK8检测不同浓度FOB对OGD/R细胞增殖能力的影响,选择FOB的最适作用浓度;将RCMECs细胞分为对照组,模型组,低、中、高剂量组;生化检测各组细胞乳酸脱氢酶(LDH)活性;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测各组细胞中细胞外信号调节激酶(MEK)、细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2 mRNA表达水平;Western印迹检测细胞增殖相关蛋白大鼠细胞周期素(Cyclin)D2、多重肿瘤抑制基因(P16)和MEK/ERK通路相关蛋白表达水平。结果与对照组比较,模型组细胞LDH活性和P16蛋白表达水平显著升高,MEK、ERK1/2 mRNA表达水平显著降低,CyclinD2、p-MEK和p-ERK1/2蛋白表达水平显著降低(均P0.05)外,各剂量组细胞LDH活性和P16蛋白表达水平显著降低,MEK、ERK/2 mRNA表达水平显著升高、CyclinD2、p-MEK和p-ERK1/2蛋白表达水平显著升高且均呈剂量依赖性(均P<0.05)。结论 FOB可以调控RCMECs的活性,其作用机制可能与激活MEK/ERK通路有关。

关键词：葱白提取物氧糖剥夺/复氧细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路

Apelin-13通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制脑缺血再灌注损伤小鼠细胞焦亡

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神经解剖学杂志 2024年第2期40卷 231-240页

作者：马雅萍马昌盛韩博白敏孟姝辰段梦圆贺茂涛山东第二医科大学基础医学院潍坊261021 山东第二医科大学附属医院潍坊261021

目的:探究Apelin-13调节肽对脑缺血再灌注(I/R)损伤模型小鼠神经细胞焦亡的影响。方法:利用大脑中动脉栓塞再灌注法(MCAO/R)制备小鼠I/R损伤模型,氧糖剥夺/复氧(OGD/R)法制备HT22细胞损伤模型,同时给予Apelin-13处理。神经功能缺损评分... 详细信息

目的:探究Apelin-13调节肽对脑缺血再灌注(I/R)损伤模型小鼠神经细胞焦亡的影响。方法:利用大脑中动脉栓塞再灌注法(MCAO/R)制备小鼠I/R损伤模型,氧糖剥夺/复氧(OGD/R)法制备HT22细胞损伤模型,同时给予Apelin-13处理。神经功能缺损评分评估小鼠神经功能;苏木精-伊红染色法(HE)和尼氏染色观察小鼠脑梗死区组织形态变化;2,3,5氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积;Western Blot检测梗死区脑组织或者HT22细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、消皮素D(GSDMD)、胱天蛋白酶1(caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、白细胞介素1β(IL-1β)和白细胞介素18(IL-18)等分子的表达;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测小鼠血清及培养上清中IL-1β和IL-18的水平;用CCK-8试剂盒和乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒分别检测HT22细胞活性和细胞损伤;caspase-1活性检测试剂盒检测HT22细胞中caspase-1的活性;免疫荧光染色观察HT22细胞中caspase-1和GSDMD表达。结果:Apelin-13可显著改善I/R小鼠神经功能和脑梗死体积,减轻梗死区病理损伤。同时降低血清中IL-1β和IL-18的水平。此外,Apelin-13可降低小鼠脑梗死区NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β、IL-18等分子的表达。体外实验表明Apelin-13可显著增加OGD/R处理的HT22细胞活力,降低caspase-1活性,并减少LDH含量,同时降低OGD/R处理的HT22细胞中NLRP3、GSDMD、caspase-1、IL-1β、IL-18等分子的表达。结论:Apelin-13可通过NLRP3/caspase-1/GSDMD通路抑制脑缺血再灌注损伤小鼠细胞焦亡,进而发挥神经保护作用。

关键词： Apelin-13 氧糖剥夺/复氧缺血再灌注损伤 NLRP3 细胞焦亡小鼠

TLR4/NF-κB信号通路在深低温停循环脑损伤发病机制中的体外实验研究

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实用医学杂志 2017年第20期33卷 3344-3347页

作者：唐志贤钟宗仁刘子由郭丹熊亮杜志明田承南赖政洪谢春发钟茂林赣南医学院第一附属医院江西省赣州市41000 赣南医学院江西省赣州市341000

目的研究TLR4/NF-κB信号通路在深低温停循环(DHCA)脑损伤发病机制中的作用。方法建立DHCA体外BV2细胞氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R),随机分为正常组(C组)及OGD/R组(O组)。分别使用CCK-8和Western blot检测细胞活性以及TLR4、MyD88、NF-κB... 详细信息

目的研究TLR4/NF-κB信号通路在深低温停循环(DHCA)脑损伤发病机制中的作用。方法建立DHCA体外BV2细胞氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R),随机分为正常组(C组)及OGD/R组(O组)。分别使用CCK-8和Western blot检测细胞活性以及TLR4、MyD88、NF-κB的蛋白水平,RT-PCR检测TLR4 mRNA表达水平,ELISA检测细胞培养上清TNF-α、IL-6表达量。结果 O组细胞活性比C组明显降低(P<0.05),O组TLR4、My D88及p-p65蛋白表达水平均较C组明显升高(P<0.05),O组TLR4 mRNA表达水平比C组显著增高(P<0.01),O组TNF-α及IL-6的表达量比C组增加,差异有统计学意义(P<0.01)。结论TLR4/NF-κB信号通路参与了OGD/R处理后BV2细胞的激活,并可能通过此途径参与DHCA脑损伤。

关键词： TLR4 NF-κB 氧糖剥夺/复氧 BV2细胞深低温停循环脑损伤

Salvinorin A对缺血性脑损伤的保护作用及其机制研究

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Salvinorin A对缺血性脑损伤的保护作用及其机制研究

作者：吴广喜上海交通大学

学位级别：硕士

目的:研究Salvinorin A对缺血性脑损伤的保护作用,并研究其可能的机制。方法:细胞实验部分,使用原代神经元建立氧糖剥夺/复氧模型。然后观察不同剂量的Salvinorin A对其是否具有保护作用。如果有保护作用,选择最佳剂量进行后续的研究。... 详细信息

目的:研究Salvinorin A对缺血性脑损伤的保护作用,并研究其可能的机制。方法:细胞实验部分,使用原代神经元建立氧糖剥夺/复氧模型。然后观察不同剂量的Salvinorin A对其是否具有保护作用。如果有保护作用,选择最佳剂量进行后续的研究。然后应用MAPK通路的三种不同的抑制剂,分别是ERK通路抑制剂U0126,P 3 8通路的抑制剂S B2 0 0 2 3 5和J N K通路的抑制剂S P 6 0 0 1 2 5,观察Salvinorin A保护作用的变化,最终证明其作用机制。在动物实验部分,使用新生鼠缺氧缺血性脑损伤模型,观察S al v i n o ri n A对其是否具有保护作用。结果:在细胞实验中,培养的原代神经元在氧糖剥夺/复氧损伤下,乳酸脱氢酶的漏出率明显增加。Salvinorin A可以减轻该损伤,其中1μM浓度的Salvinorin A是具有明显保护作用的最低剂量。三种抑制剂中只有ERK通路的抑制剂U0126能够明显逆转S al v i n o ri n A的保护作用。在动物实验中,新生鼠在缺氧缺血后,步态不稳,而在使用了Salvinorin A预处理后,神经功能得到改善。结论:Salvinorin A能够减轻缺氧缺血性脑损伤,其机制可能与ERK通路相关。

关键词： Salvinorin A 氧糖剥夺/复氧缺氧缺血性脑损伤神经保护

聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒载NF-κB圈套ODNs抗脑微血管内皮细胞缺血后炎性损伤及其机制的研究

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聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒载NF-κB圈套ODNs抗脑微血管内皮细胞缺...

作者：秦伟重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验与临床研究,使人们对脑缺血性损害及其药物干预等的认识不断深化,针对该病不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大... 详细信息

背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验与临床研究,使人们对脑缺血性损害及其药物干预等的认识不断深化,针对该病不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性强的治疗靶点和策略势所必然。目前,对脑缺血/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、兴奋性氨基酸、细胞内钙超载、线粒体的损伤、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,再灌注时的炎症反应促进了继发性脑损害,是脑缺血/再灌注损伤的主要原因之一。同时发现,脑微血管内皮细胞(brain microvascular endothelial cells, BMEC)受损是脑血管病特别是脑缺血发病的早期病变和基本诱因,与脑血管病发生发展密切相关,因此保护BMEC 的功能和结构显得尤其重要。活化的 BMEC 在转录因子,特别是核转录因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)系统的调节下,产生一系列细胞因子、酶类等介质,介导或直接参与白细胞和 BMEC 的相互作用以及血管、组织的损伤。多数学者认为 NF-κB 是炎症反应的中心环节。靶向 NF-κB 的抗炎治疗成为国内外众多学者研究的热点。人工合成的 NF- κ B 圈套寡脱氧核苷酸 (NF- κ B decoy oligodeoxynucleiotides 或NF-κB decoy ODNs)是含有NF-κB 结合位点的双螺旋寡核苷酸。当NF-κB从NF-κB-IκB复合物中解离出来以后,NF-κB decoy ODNs即可与游离的NF-κB结合,从而封闭了NF-κB,阻断其向核内移位及启动靶基因的转录。圈套策略以其特异性及高效性有着其它策略无可比拟的优势,成为一种新型的基因治疗方案。重庆医科大学硕士研究生学位论文 4同时也发现 NF-κB decoy ODNs 在体内滞留时间短、易被细胞内外核酸酶降解以及靶向进入细胞核内量少等问题。其后果是成本昂贵且细胞毒性作用大。而且众所周知,血脑屏障(blood brain barrier, BBB)的存在也限制了神经药物或用于基因治疗的核苷酸片段进入颅内,使其不能发挥有效的治疗作用。因此,在中枢神经系统疾病时,寻找一种新方法使药物能顺利通过 BBB 达到病变部分,发挥其治疗作用,已经成为医学研究中急需解决的难题。纳米粒作为靶向制剂的载体是近年来研究的热点。载药纳米粒经过适当的修饰,可有效解决 decoy ODNs 易被核酸酶降解的问题,进而可通过 BBB,把药物定向输送到中枢神经系统而发挥治疗作用。目的:(1) 探讨大鼠脑微血管内皮细胞(brain microvascularendothelial cells, BMEC)的培养方法并对之进行形态学观察;(2) 制备大小均匀、带正电荷、包封率高、血管内皮细胞摄入率高的聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(polybutylcyanoacrylate nanoparticles,PBCA NP);(3) 建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygenglucose deprivation, OGD)/复氧(reoxygenation)模型;(4) 通过该模型,研究 BMEC 在氧糖剥夺/复氧后 NF-κB p65 蛋白的表达、活化的动态规律;(5) 研究靶向 NF-κB 的哑铃形寡脱氧核苷酸(decoy ODNs)- PBCANP 复合物转染血管内皮细胞在该模型条件下对细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取 Wistar 大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胶原酶消化、离心等技术获取脑微血管内皮细胞并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用 MTT 方法测定生长曲线;采用透射电镜、光散射、粒径仪、流式细胞仪、荧光显微镜等研究和评价 PBCA NP 的重庆医科大学硕士研究生学位论文 5理化特征、粒径、载基因能力以及该纳米粒载特异性基因的脑靶向性;采用细胞培养、MT

关键词：聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒子核因子-κB 氧糖剥夺/复氧脑微血管内皮细胞圈套策略细胞间粘附分子-1 诱生型一氧化氮合酶

冠心宁注射液对缺血性卒中诱导的血脑屏障损伤的保护作用机制及生物打印血脑屏障微球的构建

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冠心宁注射液对缺血性卒中诱导的血脑屏障损伤的保护作用机制及生...

作者：杜宏英天津中医药大学

学位级别：硕士

目的:缺血性卒中是目前导致死亡的主要原因之一,血脑屏障（BBB）损伤是缺血性卒中的病理特征之一。目前临床上针对缺血性卒中主要的治疗方法有重组组织型纤溶酶原激活物静脉溶栓,但BBB损伤导致的随后发生的出血性转化,且预后较差等限制... 详细信息

目的:缺血性卒中是目前导致死亡的主要原因之一,血脑屏障（BBB）损伤是缺血性卒中的病理特征之一。目前临床上针对缺血性卒中主要的治疗方法有重组组织型纤溶酶原激活物静脉溶栓,但BBB损伤导致的随后发生的出血性转化,且预后较差等限制了其应用。因此BBB保护策略在缺血性卒中治疗过程中越来越受到人们关注。体内研究BBB较为困难,构建能更好模拟人体BBB特征的体外模型对脑部疾病治疗靶点及药物开发具有重要意义。喷墨生物打印具有打印细胞活力高、高通量等优势,适合于构建类器官模型。本研究基于人脑微血管内皮细胞、人星形胶质细胞、人脑血管周细胞形成了BBB微球,并利用喷墨生物打印机高通量,标准化的构建了血脑屏障微球。基于BBB微球模型,探究并优化了氧糖剥夺/复氧（OGD/R）损伤模型的构建。冠心宁注射液（GXNI）是由丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）和川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）提取物制成的中药注射液,有研究表明GXNI能降低脑缺血再灌注损伤小鼠的BBB透过性。但GXNI是否能改善缺血性卒中进程中的BBB损伤及其机制目前仍不清楚。本研究基于OGD/R诱导3D BBB微球的损伤模型探究了GXNI对缺血性卒中诱导的BBB损伤的保护作用及其机制。方法:1.基于Operetta CLS高内涵成像分析系统对BBB微球进行成像并分析,探究OGD/R后微球的细胞活力,透过性等变化,以明确何种OGD/R条件能模拟缺血性卒中诱导的血脑屏障损伤。并通过细胞活死染色探究了GXNI对OGD/R诱导的血脑屏障微球细胞损伤的影响;通过微球3D重构分析了OGD/R诱导的血脑屏障微球的形态学及透过性的改变;通过石蜡切片,免疫荧光染色等对Laminin,CollagenⅣ等细胞外基质进行检测;此外,还对ROS,P-糖蛋白（P-Glycoprotein,P-gp）及其功能,紧密连接蛋白等进行了检测。2.基于本课题组前期抗小鼠脑缺血/再灌注损伤的相关转录组数据,以获取差异表达基因（DEGs）,将log2 Fold Change≥1和P≤0.05的DEGs进行Ingenuity Pathway Analysis（IPA）核心分析,以得到GXNI对卒中预后作用的关键机制和关键靶标。使用相关蛋白的抑制并通过实时逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫荧光进行实验验证。3.基于喷墨生物打印机,将人脑微血管内皮细胞（HBMEC）、人脑血管周细胞（HBVP）、人星形胶质细胞（HA）三种细胞通过生物打印至在由琼脂糖凝胶形成的低吸附孔板中,以期高通量、标准化的形成血脑屏障微球。结果:1.分别对OGD 2 h/R 12 h,OGD 4 h/R 12 h,OGD 6 h/R 12 h造模后BBB微球细胞活力进行检测,结果发现,OGD 2 h/R 12 h造模后,BBB微球细胞活力没有明显改变;OGD 4 h/R 12 h,OGD 6 h/R 12 h造模后,BBB微球细胞活力均有明显降低。对BBB透过性进行检测,结果发现,OGD 4 h/R 12 h造模后,BBB透过性没有明显改变,而OGD6 h/R 12 h造模后,BBB透过性明显增加。基于上述造模条件优化,本研究选择OGD 6h/R 12 h进行后续研究。OGD 6 h/R 12 h导致BBB微球细胞活力明显减低,透过性增加,ROS蓄积,基膜（Laminin、CollagenⅣ）损伤,紧密连接蛋白破坏（ZO-1、Claudin 5、Occludin）,P-糖蛋白表达及其功能降低等;予GXNI后,BBB微球细胞活力明显增加,透过性降低,ROS蓄积减少,Laminin及CollagenⅣ表达增高,紧密连接蛋白表达增加,P-gp表达增加。2.在对Model和GXNI组小鼠脑组织的转录组测序中,得到了182个差异表达基因。通过对差异表达基因分析后发现,GXNI可能通过TLR-4/NF-κB/MMP-9神经炎症通路保护血脑屏障,通过RT-PCR及免疫荧光对相关靶点蛋白进行验证。RT-PCR结果表明,GXNI可以显著降低TLR-4,MMP-9的m RNA表达水平。免疫荧光结果表明OGD/R诱导血脑屏障微球TLR-4、MMP-9蛋白表达增加,GXNI可以显著降低相应蛋白的表达;NF-κB核转位结果表明,GXNI能够显著抑制NF-κB的激活。使用MMP-9蛋白抑制剂SB-3CT,并对紧密连接蛋白（Occludin,ZO-1）及细胞外基质蛋白（Laminin）进行检测,结果表明MMP-9可能是GXNI发挥血脑屏障保护作用的关键靶点。3.对基于不同原理的喷墨生物打印机细胞活力进行对比,并基于电磁微阀喷墨生物打印HBMEC、HBVP、HA至由琼脂糖凝胶形成的低吸附孔板中,并通过细胞活死染色,以及对血脑屏障特征蛋白

关键词：血脑屏障细胞微球缺血性卒中冠心宁注射液氧糖剥夺/复氧生物打印

犀角地黄汤对缺血性卒中体外炎症反应信号通路的干预研究

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犀角地黄汤对缺血性卒中体外炎症反应信号通路的干预研究

作者：章旭南京中医药大学

学位级别：硕士

研究目的从体外实验的角度,研究犀角地黄汤对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,以及与炎症反应相关的TLR4/MyD88信号通路在犀角地黄汤神经保护效应中的作用。通过本课题的研究,以期深化中医瘀热理论在缺血性卒中治疗中的指导意义,并为缺... 详细信息

研究目的从体外实验的角度,研究犀角地黄汤对脑缺血再灌注损伤的神经保护作用,以及与炎症反应相关的TLR4/MyD88信号通路在犀角地黄汤神经保护效应中的作用。通过本课题的研究,以期深化中医瘀热理论在缺血性卒中治疗中的指导意义,并为缺血性卒中的治疗提供新的策略。研究方法首先,本课题采用高效液相色谱法(HPLC)同时测定犀角地黄汤中主要成分芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苷的含量,建立犀角地黄汤的质量控制分析方法。其次,本研究以PC12细胞为研究载体,在体外通过氧糖剥夺和复氧方法模拟脑缺血再灌注损伤。实验中将PC12细胞分为空白对照组(control)、模型对照组(OGD/R)、犀角地黄汤组(XJDH)和芍药苷组(Paeoniflorin)。空白对照组细胞正常培养,不经过OGD/R处理;模型对照组细胞经OGD/R处理,但不加任何药物干预;犀角地黄汤组是加入犀角地黄汤干预,在CGD/R条件下培养细胞;芍药苷组是加入犀角地黄汤的活性成分芍药苷,在OGD/R条件下培养细胞。药物与细胞孵育一定时间后,通过MTT实验及LDH释放实验,考察犀角地黄汤或芍药苷对细胞活力的影响;ELISA法测定各组细胞炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放水平,并检测细胞内caspase-3的浓度,考察犀角地黄汤或芍药苷神经保护作用与炎症、凋亡的关系。通过Western Blot实验,研究犀角地黄汤或芍药苷对TLR4、MyD88、NF-κB、TRAF6、p-ERK、p-JNK、Akt和cleaved caspase-3等蛋白表达水平的影响,初步探讨犀角地黄汤神经保护作用的可能机制。研究结果HPLC实验结果显示,犀角地黄汤中芍药苷、芍药内酯苷、氧化芍药苻三种物质的含量分别为0.232±0.031%、0.276±0.018%、0.019±0.002%。所建的分析方法操作简便快速准确,可为犀角地黄汤的质量控制提供依据。氧葡萄糖剥夺复氧后,与正常培养PC12细胞相比,OGD后PC12细胞活性下降43.75±2.4%。提前给予0.4,0.2,0.1 mg/mL犀角地黄汤处理,细胞活力分别为91.9 ± 2.6%,97.3 ± 3.5%,66.9 ± 1.8%,与模型对照组比较均具有显著性差异。LDH检测实验结果表明,犀角地黄汤可以减少细胞内LDH的释放,改善OGD/R导致的PC12细胞损伤。ELISA实验数据表明,OGD/R能够促进炎症介质1L-1β、1L-6和TNF-α的产生,而犀角地黄汤和芍药苷均可显著抑制相关炎症介质的释放。进一步机制研究表明,犀角地黄汤和芍药苷上调PC12细胞中TLR4,MyD88,TRAF6和NF-κB表达,降低细胞caspase-3含量,上调cleaved caspase-3水平,对MAPK和Akt相关通路蛋白p-ERK1/2、p-JNK没有显著性影响。研究结论(1)犀角地黄汤能够减轻OGD/R对PC12细胞的损伤,起到神经保护作用;(2)犀角地黄汤通过调控TLR4/MyD88通路,降低炎症因子释放,起到神经保护作用;(3)中医瘀热理论在缺血性卒中的研究中具有重要价值,而犀角地黄汤有望为缺血性卒中提供新的治疗方法。

关键词：缺血性卒中犀角地黄汤氧糖剥夺/复氧 PC12细胞炎症 TLR信号通路

M2表型小胶质细胞外泌体对缺血性脑卒中影响的机制研究

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M2表型小胶质细胞外泌体对缺血性脑卒中影响的机制研究

作者：陈玮兰州大学

学位级别：硕士

目的:通过氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)干预原代小胶质细胞模拟体内缺血小胶质细胞,明确小胶质细胞在OGD/R不同时间段的表型变化;通过OGD/R干预HT22细胞模拟体内缺血神经元,探讨M2表型小胶质细胞外... 详细信息

目的:通过氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)干预原代小胶质细胞模拟体内缺血小胶质细胞,明确小胶质细胞在OGD/R不同时间段的表型变化;通过OGD/R干预HT22细胞模拟体内缺血神经元,探讨M2表型小胶质细胞外泌体对OGD/R HT22细胞的影响,利用生物信息学分析M2表型小胶质细胞外泌体内容物可能减轻缺血性脑卒中的分子机制,为缺血性脑卒中的研究提供基础数据参考。方法:1.将成功分离的原代小胶质细胞培养基更换为无糖培养基,置于95%N+5%CO缺氧小室中培养1h,继而将培养基更换为含10%血清的DMEM/F-12培养基,常氧条件继续培养12、24、36h,Western Blot检测CD206表达水平,评估OGD/R后小胶质细胞表型变化。2.将20ng/m L白细胞介素4(interleukin 4,IL-4)加入BV2细胞及原代小胶质细胞中分别干预40、12h,Western Blot检测CD206表达水平,诱导M2表型小胶质细胞。收集M2表型BV2细胞条件培养基并提取外泌体。将HT22细胞培养基换为无糖培养基,并置于95%N+5%CO缺氧小室中培养6h,加入不同浓度(2.5、5、10和20μg/m L)M2表型BV2细胞外泌体,常氧条件共培养24h,选取保护作用最佳的外泌体浓度,CCK-8检测细胞活力变化;Western Blot检测凋亡相关蛋白(Bax、Bcl-2)表达水平。3.利用GEO数据库检索获取M2表型小胶质细胞miRNA数据集,通过GEO2R在线工具筛选其差异表达miRNA(differentially expressed miRNA,DEMs);利用GEO数据库及文献检索获取M2表型及静息态小胶质细胞外泌体中miRNA;将M2表型小胶质细胞DEMs与小胶质细胞外泌体的miRNA取交集,通过miRDB数据库及Targetscan数据库预测交集miRNA靶基因;同时,利用GEO数据库检索获取大脑中动脉闭塞再灌注(middle cerebral artery occlusion/re-perfusion,MCAO/R)m RNA数据集,并利用GEO2R在线工具筛选其差异表达基因(differentially expressed gene,DEGs),将交集miRNA靶基因与MCAO/R数据集中上调的DEGs取交集,对交集基因进行GO功能注释及KEGG通路富集分析,构建PPI网络,根据degree值筛选前10位枢纽基因(Hub genes),并验证Hub基因在GSE97537数据集中表达情况。结果:1.小胶质细胞中CD206在OGD/R 12h后表达上调(P氧的反应等生物过程中以及粘着斑、PI3K-Akt信号通路、ECM-受体相互作用、肌动蛋白细胞骨架调节等信号通路中;并构建PPI网络,按照degree值筛选出前10个Hub基因,分别为:Fn1、Cd44、Tlr4、Igf1、Cxcl12、Lyn、Col1a1、Spp1、Col1a2、Lox,其中Cd44、Spp1及Lox在验证数据集GSE97537的MCAO/R组中表达上调。结论:OGD/R早期小胶质细胞呈M2表型,之后M2表型效应逐渐弱化。M2表型小胶质细胞外泌体可提高OGD/R HT22细胞活力,改变凋亡蛋

关键词：缺血性脑卒中小胶质细胞氧糖剥夺/复氧外泌体生物信息学