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let-7d抑制剂对海马神经元离体氧糖剥夺/复氧细胞损伤的凋亡抑制作用

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山西医科大学学报 2019年第12期50卷 1688-1693页

作者：李中岩李文媛王莹李雪花阜新市中心医院神经外科阜新123000 牡丹江医学院神经组织工程研究所阜新市中心医院神经内科

目的探讨let-7d microRNAs(miRNAs)抑制剂对海马神经元离体氧糖剥夺/复氧(OGD/R)细胞损伤中的凋亡抑制作用及机制。方法培养小鼠海马神经元HT22细胞系,利用三气缺氧细胞培养箱及培养基缺糖方式建立OGD/R细胞损伤模型,实时荧光定量PCR检... 详细信息

目的探讨let-7d microRNAs(miRNAs)抑制剂对海马神经元离体氧糖剥夺/复氧(OGD/R)细胞损伤中的凋亡抑制作用及机制。方法培养小鼠海马神经元HT22细胞系,利用三气缺氧细胞培养箱及培养基缺糖方式建立OGD/R细胞损伤模型,实时荧光定量PCR检测海马神经元OGD/R细胞损伤后6,12,24 h let-7d mRNA表达。将细胞分为正常组、OGD/R+miRNA-NC组、OGD/R+let-7d mimics组和OGD/R+let-7d inhibitor组,实时荧光定量PCR检测各组细胞let-7d和NGF mRNA表达,CCK-8法检测各组细胞活性,Hoechst33342/PI双染法检测各组细胞凋亡率。结果与正常组比较,海马神经元OGD/R细胞损伤后6,12,24 h let-7d表达显著降低(P<0.001)。与正常组比较,OGD/R+miRNA-NC组NGF mRNA表达和细胞凋亡率显著增高(P<0.001),let-7d mRNA表达和细胞活性显著降低(P<0.001)。与OGD/R+miRNA-NC组比较,OGD/R+let-7d inhibitor组let-7d mRNA表达和细胞凋亡率显著降低,NGF mRNA表达和细胞活性显著增高。而OGD/R+let-7d mimics组作用与之相反(P<0.001)。结论let-7d inhibitor能够抑制OGD/R诱导的海马神经元细胞凋亡,其机制可能与上调内源性保护因子NGF表达有关。

关键词： let-7d抑制剂氧糖剥夺/复氧海马神经元细胞凋亡

利多卡因对氧糖剥夺/复氧诱导神经细胞损伤的影响及机制

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山东医药 2023年第31期63卷 38-42,71页

作者：杨文俊许楠董家瑞黄天丰李润林扬州大学医学院附属江都人民医院麻醉科江苏扬州225200 江苏省苏北人民医院麻醉科

目的探讨利多卡因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导神经细胞损伤的影响及其作用机制。方法常规培养大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞),将培养好的细胞随机分为对照组、模型组、低浓度组、中浓度组、高浓度组、miR-NC+模型组、miR-125b-5p+模型组... 详细信息

目的探讨利多卡因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导神经细胞损伤的影响及其作用机制。方法常规培养大鼠肾上腺嗜铬细胞(PC12细胞),将培养好的细胞随机分为对照组、模型组、低浓度组、中浓度组、高浓度组、miR-NC+模型组、miR-125b-5p+模型组、anti-miR-NC+高浓度组、anti-miR-125b-5p+高浓度组。对照组常规培养;模型组用OGD/R诱导建立细胞损伤模型;低浓度组、中浓度组、高浓度组分别加入2.5、5、10μmol/L利多卡因培养24 h后进行OGD/R处理;miR-NC+模型组、miR-125b-5p+模型组分别转染miR-NC、miR-125b-5p mimics后,进行OGD/R处理;anti-miR-NC+高浓度组、anti-miR-125b-5p+高浓度组分别转染anti-miR-NC、anti-miR-125b-5p加入浓度为10μmol/L利多卡因培养24 h,然后进行OGD/R处理。用MTT法检测细胞活力[吸光度值(A值)],流式细胞术检测细胞凋亡率,实时荧光定量PCR法检测miR-125b-5p表达,Western blotting法检测凋亡相关蛋白[剪切的半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved-caspase-3)、Bcl2关联X蛋白(Bax蛋白)]、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路相关蛋白(p-PI3K、p-Akt蛋白)表达,用微板法、WST-1法及钼酸铵法检测氧化应激相关指标[丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)]。结果与对照组比较,模型组细胞活力低(P氧化应激反应,其作用机制可能与激活PI3K/Akt信号通路有关。

关键词：神经细胞损伤利多卡因氧糖剥夺/复氧肾上腺嗜铬细胞微小RNA-125b-5p PI3K/Akt信号通路

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脑心通通过抑制TRPM7抗神经元氧糖剥夺/复氧损伤

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中南药学 2021年第8期19卷 1543-1548页

作者：马妍吴丹张伟梁嘉钰李斌天津中医药大学第二附属医院天津300150 天津中医药大学天津301617

目的观察脑心通对神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤作用及其对TRPM7表达的影响。方法以原代培养的胎鼠大脑皮层神经元(CNC)作为实验对象,用倒置相差显微镜下观察CNC的形态,采用免疫荧光法对微管相关蛋白2(MAP2)染色,进行CNC纯度鉴定;建立... 详细信息

目的观察脑心通对神经元氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤作用及其对TRPM7表达的影响。方法以原代培养的胎鼠大脑皮层神经元(CNC)作为实验对象,用倒置相差显微镜下观察CNC的形态,采用免疫荧光法对微管相关蛋白2(MAP2)染色,进行CNC纯度鉴定;建立OGD/R损伤模型,采用脑脊液药理学的给药方法,分别采用CCK-8、LDH检测试剂盒检测神经元细胞活力及LDH释放量,并用RT-PCR法检测TRPM7 mRNA的表达水平。结果成功培养原代神经元,纯度符合实验要求;脑心通含药脑脊液对正常培养的CNC无明显损伤作用,10%脑心通含药脑脊液可提高正常培养CNC的细胞活力。成功建立神经元OGD/R模型,各剂量脑心通含药脑脊液均可明显提高神经元OGD/R损伤后的细胞活力(P<0.01),5%~20%脑心通含药脑脊液可明显降低神经元OGD/R损伤后LDH的释放量(P<0.05,P<0.01)。OGD/R组神经元内TRPM7 mRNA的表达水平较对照组明显升高(P<0.01);脑心通含药脑脊液各组均可明显降低神经元OGD/R损伤后TRPM7的mRNA的表达水平(P<0.05,P<0.01)。结论脑心通可通过抑制非谷氨酸受体依赖途径中的TRPM7 mRNA表达从而减轻神经元OGD/R损伤。

关键词：脑心通神经元氧糖剥夺/复氧 TRPM7

神经调节素1β对氧糖剥夺/复氧诱导PC12细胞损伤的保护作用及其机制

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精准医学杂志 2023年第6期38卷 485-489,493页

作者：孙珊珊于曦翟秋月于竹芹山东大学齐鲁医院(青岛)神经内科山东青岛266035 青岛大学医学部中西医结合中心青岛大学医学院松山医院内科

目的探讨神经调节素1β(NRG1β)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法建立PC12细胞OGD/R模型,随机分为对照组(常规培养)、模型组(OGD/R处理)以及干预组(给予OGD/R处理+NRG1β干预),采用细胞计数试剂盒(CCK... 详细信息

目的探讨神经调节素1β(NRG1β)对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的PC12细胞损伤的保护作用及其机制。方法建立PC12细胞OGD/R模型,随机分为对照组(常规培养)、模型组(OGD/R处理)以及干预组(给予OGD/R处理+NRG1β干预),采用细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组细胞的活力,采用荧光强度分析技术检测各组细胞活性氧(ROS)水平,采用荧光分光光度法检测各组细胞丙二醛(MDA)水平及还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽(GSH/GSSG)吸光度比值,采用透射电镜观察各组细胞线粒体损伤情况,采用Western blot方法检测各组细胞中谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达情况。结果与对照组比较,模型组的细胞活力显著下降(t=25.76,P<0.01),ROS水平显著升高(t=12.43,P<0.01),GSH/GSSG吸光度比值显著降低(t=9.17,P<0.01),MDA水平显著升高(t=29.46,P<0.01);与模型组比较,干预组的细胞活力显著升高(t=8.03,P<0.01),ROS水平显著降低(t=10.34,P<0.01),GSH/GSSG吸光度比值显著升高(t=15.71,P<0.01),MDA水平显著降低(t=2.96,P<0.05)。透射电镜结果显示,与对照组相比,模型组线粒体损伤增加,NRG1β干预后减缓了线粒体损伤。Western blot方法显示,模型组GPX4表达水平较对照组显著降低(t=23.06,P<0.01),而干预组较模型组显著升高(t=6.07,P<0.05)。结论NRG1β可通过影响铁死亡关键蛋白GPX4的表达,缓解OGD/R诱导的PC12细胞损伤。

关键词：神经调节蛋白1 PC12细胞铁死亡谷胱甘肽过氧化酶氧糖剥夺/复氧

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过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧诱导的脑微血管内皮细胞活性及VEGF表达的影响

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右江民族医学院学报 2024年第1期46卷 1-6,12页

作者：黄建敏陈海燕云艳芳杨桂新蒋勇明李晓岚韦宝莹周莹杰彭立志莫芬李雪斌右江民族医学院附属医院神经内科广西百色533000

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OG... 详细信息

目的探讨过表达BIRC5基因对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的小鼠脑微血管内皮细胞损伤的保护作用,并分析其可能的机制。方法将小鼠源性脑微血管内皮细胞,根据不同干预方式分为正常对照组(细胞正常培养)、细胞损伤组(细胞正常培养24 h,随后OGD3h/R3h损伤细胞)、BIRC5干预组(细胞预先转染腺病毒-BIRC5质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)和阴性对照组(细胞预先转染腺病毒空质粒并培养24 h,随后OGD3h/R3h处理)。采用激光共聚焦显微镜观察各组细胞形态学变化;用MTT法和流式细胞仪分别检测各组细胞存活率和凋亡率;用RT-PCR和免疫印迹法分别检测各组细胞BIRC5和VEGF mRNA及蛋白表达。结果正常对照组的细胞骨架微丝彼此连接,分布规则,丝网状有序排列;细胞损伤组和阴性对照组的细胞微丝断裂,收缩变短或移向周边,微丝网状排列紊乱,可见细胞外形皱缩,间隙加大,少部分微丝缺失出现空隙;BIRC5干预组的细胞微丝连接,形态成长梭形,排列较规则,可见细胞间隙缩小,显示过表达BIRC5基因能够减轻损伤细胞的骨架微丝紊乱。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组及阴性对照组细胞存活率降低,而细胞凋亡率增高,差异均有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组的细胞存活率增高,而细胞凋亡率降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,细胞损伤组、BIRC5干预组和阴性对照组的BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达降低,差异有统计学意义(P<0.05);与细胞损伤组相比,BIRC5干预组细胞BIRC5和VEGF的mRNA及蛋白表达增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论过表达BIRC5基因对OGD/R诱导的脑微血管内皮细胞损伤具有保护作用,机制可能与上调VEGF表达有关,提示BIRC5调控VEGF表达促进血管新生可能是脑侧支循环建立和形成的重要机制之一。

关键词：过表达BIRC5基因脑微血管内皮细胞存活凋亡氧糖剥夺/复氧血管内皮生长因子

LncRNA FGD5-AS1调节miR-195-5p/TXNIP轴对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞增殖和凋亡的影响

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卒中与神经疾病 2024年第5期31卷 421-426,431页

作者：杨松涛李向男李林张云鹤陈通付爱军河北省唐山华北理工大学附属医院神经外科 063000

目的探究长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lncRNA)中含有5个PH结构域的反义RNAl(PH domain containing 5 antisense RNA 1,FGD5-AS1)调节微小RNA-195-5p(microRNA-195-5,miR-195-5p)/硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interactingprotein,TXNIP)轴对氧糖剥夺/复氧(Oxygen-glucose deprivation and reperfusion injury,OGD/R)小胶质细胞增殖和凋亡的影响。方法以正常小胶质细胞B-V2作为对照组,并建立OGD/R模型,分为OGD/R组(未转染质粒)、转染FGD5-AS1阴性对照(si-NC)组、转染si-FGD5-AS1(si-FGD5-AS1)组、共转染si-FGD5-AS1和miR-195-5p抑制剂阴性对照(si-FGD5-AS1+inhibitor-NC)组和共转染si-FGD5-AS1和miR-195-5p inhibitor(si-FGD5-AS1+miR-195-5p inhibitor)组;采用细胞增殖-毒性检测(Cell counting kit-8,CCK-8)法检测各组细胞的增殖情况;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;采用实时荧光定量PCR(Quantitative real time-PCR,qRT-PCR)法检测各组细胞中FGD5-AS1、miR-195-5p和TXNIP mRNA水平;采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测各组细胞中TXNIP蛋白表达水平;双荧光素酶活性验证miR-195-5p和FGD5-AS1、TXNIP之间的靶向关系。结果相较于对照组,OGD/R组细胞存活率、克隆形成数量及miR-195-5p表达水平均降低(P氧糖剥夺/复氧小胶质细胞的增殖及凋亡情况。

关键词：长链非编码RNA中含有5个PH结构域的反义RNAl 微小RNA-195-5p/硫氧还蛋白相互作用蛋白轴氧糖剥夺/复氧增殖凋亡

基于HIF-VEGF-Notch通路探讨丁苯酞对氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞的保护作用

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解剖学研究 2024年第5期46卷 469-475页

作者：李娟刘鑫张宁康永敬宋娟刘文红陈永新黄骅市人民医院神经内一科河北沧州061100

目的基于HIF-VEGF-Notch通路探讨丁苯酞对氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞的保护作用。方法制备氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞模型,将细胞分为空白组、氧糖剥夺/复氧组、丁苯酞组和丁苯酞+sh-HIF-1α组。CCK-8及EdU染色检测H9c2细... 详细信息

目的基于HIF-VEGF-Notch通路探讨丁苯酞对氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞的保护作用。方法制备氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞模型,将细胞分为空白组、氧糖剥夺/复氧组、丁苯酞组和丁苯酞+sh-HIF-1α组。CCK-8及EdU染色检测H9c2细胞活力;流式细胞仪和AO/EB染色检测细胞凋亡;Matrigel体外成管试验检测血管生成能力;ELISA检测细胞中炎症因子含量;蛋白质印迹法检测细胞中HIF-1α、VEGF、Notch1蛋白表达。结果和空白组相比,氧糖剥夺/复氧组细胞存活率(51.32±4.68)%、EdU阳性细胞率(12.08±0.75)%、小管形成数目(121.08±10.59)个明显降低,细胞凋亡率(14.92±1.06)%、细胞中IL-1β(30.46±2.51)pg/mL、IL-6(35.96±2.74)pg/mL、TNF-α(24.08±1.95)pg/mL水平、HIF-1α(0.61±0.08)、VEGF(0.72±0.08)、Notch1(0.43±0.05)蛋白表达明显升高(P氧糖剥夺/复氧组相比,丁苯酞组细胞存活率(85.94±7.09)%、EdU阳性细胞率(20.27±2.01)%、小管形成数目(204.15±16.71)个及细胞中HIF-1α(1.15±0.12)、VEGF(0.96±0.10)、Notch1(0.87±0.10)蛋白表达均明显增加,细胞凋亡率(7.40±0.65)%、细胞中IL-1β(10.32±0.87)pg/mL、IL-6(12.81±1.03)pg/mL、TNF-α(10.31±0.89)pg/mL水平明显降低(P氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞血管生成,从而对损伤的细胞发挥保护作用,其作用机制可能和促进HIF-1α/VEGF/Notch1信号通路激活有关。

关键词：丁苯酞氧糖剥夺/复氧人脑微血管内皮细胞血管生成 HIF-1α/VEGF/Notch1信号通路

CircTLK1通过miR-424-5p/FBXO3轴对氧糖剥夺/复氧诱导的神经细胞损伤的影响

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卒中与神经疾病 2022年第6期29卷 519-524,544页

作者：张文敏逯琴孙艳花裴雯雯山西省临汾市人民医院神经内科 041000

目的探讨环状RNA TLK1(CircRNA TLK1,CircTLK1)对氧糖剥夺/复氧(Oxygen glucose deprivation/Reoxygenation, OGD/R)诱导的神经元HT22损伤的影响以及对微小RNA(microRNA,miR)-424-5p/F-box蛋白3(F-box protein 3,FBXO3)的调控作用。方法将HT22细胞分为对照组、OGD/R组、sh-NC组、沉默环状RNA TLK1(Silencing circular RNA tlk1,sh-circTLK1)组、sh-circTLK1+抑制剂NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh NC组、sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组,除对照组外其余各组细胞均行OGD/R操作,细胞计数试剂盒8(Cell counting Kit 8,CCK-8)法测定HT22细胞活力;脂连蛋白V-异硫氰酸荧光素(Adiponectin V-fluorescein isothiocyanate, Annexin V-FITC)细胞凋亡试剂盒测定HT22细胞凋亡;测定HT22细胞乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)漏出率;实时荧光定量聚合酶链反应(Real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, RT-qRCR)法测定HT22细胞miR-424-5p, FBXO3 mRNA水平;蛋白免疫印记法(Western Blot)检测B淋巴细胞瘤-2关联基因X(B lymphoma-2 gene association X,Bax)、活化半胱天冬酶-3(Cleaved caspase-3)、FBXO3水平;双荧光素酶测定CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3靶向关系,并使用RNA下拉实验验证CircTLK1与miR-424-5p关系。结果与对照组比较,OGD/R组miR-424-5p, HT22细胞活力降低(P<0.05),circTLK1,FBXO3 mRNA水平,HT22细胞凋亡率、Bax, Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05);与OGD/R组比较,sh-circTLK1组HT22细胞活力增加(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax, Cleaved caspase-3水平,LDH漏出率降低(P<0.05);与sh-circTLK1组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组细胞活力降低(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax, Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率升高(P<0.05);与sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂组比较,sh-circTLK1+miR-424-5p抑制剂+sh FBXO3组细胞活力升高(P<0.05),HT22细胞凋亡率、Bax, Cleaved caspase-3水平、LDH漏出率降低(P<0.05);CircTLK1与miR-424-5p以及miR-424-5p与FBXO3均存在靶向关系。结论 CircTLK1沉默可能通过调控miR-424-5p/FBXO3对OGD/R诱导的HT22细胞损伤来发挥保护作用。

关键词：环状RNA TLK1 氧糖剥夺/复氧神经细胞损伤微小RNA-424-5p/F-box蛋白3

过表达5-脂氧合酶通路对氧糖剥夺/复氧小胶质细胞增殖、凋亡的影响

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陕西医学杂志 2022年第4期51卷 410-414,418页

作者：周爽王琰孙光强史永恒王川王国全李敏王斌陕西中医药大学陕西咸阳712046

目的:探索5-脂氧合酶(5-LOX)通路在脑缺血炎性损伤中发挥神经保护作用机制。方法:通过慢病毒包装构建5-LOX过表达载体病毒,转染BV2细胞,建立5-LOX过表达的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)BV2细胞模型。OGD/R BV2细胞分别给予抑制剂齐留通(Zileuton... 详细信息

目的:探索5-脂氧合酶(5-LOX)通路在脑缺血炎性损伤中发挥神经保护作用机制。方法:通过慢病毒包装构建5-LOX过表达载体病毒,转染BV2细胞,建立5-LOX过表达的氧糖剥夺/复氧(OGD/R)BV2细胞模型。OGD/R BV2细胞分别给予抑制剂齐留通(Zileuton)、半胱氨酰白三烯受体阻断剂孟鲁司特(Montelukast)和白三烯B4受体抑制剂U75302,分别阻断5-LOX、白三烯B4受体(BLTs)和半胱氨酰白三烯受体(CysLTRs)。实验分为空载体对照组、过表达组、模型组和给药组,显微镜观察细胞形态变化,采用MTT与流式细胞术分别检测空载体对照组与5-LOX过表达组细胞活力与凋亡。结果:显微镜观察显示出空载体对照组OGD后细胞数目减少,细胞形态逐渐形成“阿米巴状”,5-LOX过表达增加细胞损伤;与模型组相比,给予Zileuton、Montelukast、U75302后,细胞形态恢复,减缓细胞的“阿米巴状”。BV2细胞缺氧缺糖4 h复氧12 h后,与空载体对照组相比,过表达5-LOX细胞活力下降(P<0.01),细胞凋亡增加(P<0.01);与模型组相比,过表达5-LOX介导OGD/R损伤;Zileuton、Montelukast、U75302显著提高细胞活力(均P<0.01),减少细胞凋亡(P<0.01)。结论:5-LOX通过CysLTs/CysLTRs和LTB4/BLTs途径介导小胶质细胞OGD/R的损伤和激活,这一结果能够为脑缺血/再灌注损伤的诊断和临床治疗提供分子基础。

关键词： 5-LOX过表达小胶质细胞损伤氧糖剥夺/复氧 5-LOX通路 LTB4通路 CysLTs通路