检索结果-南通市图书馆

作者：王雪颖青岛大学

学位级别：硕士

研究背景:脑卒中是全球神经系统发病率和死亡率均位居前位的疾病之一,约占全球死亡人数的10%。有研究表明,脑卒中的发生率正在逐渐增加,全球脑卒中的终生风险可达24.9%,其中缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)的发病风险明显高于出血性卒... 详细信息

研究背景:脑卒中是全球神经系统发病率和死亡率均位居前位的疾病之一,约占全球死亡人数的10%。有研究表明,脑卒中的发生率正在逐渐增加,全球脑卒中的终生风险可达24.9%,其中缺血性卒中(Ischemic stroke,IS)的发病风险明显高于出血性卒中。缺血性脑卒中是由多种原因造成的脑供血的突然减少进而引起一系列的病理改变,最终造成人脑功能障碍的一种疾病,由于其高致残与高致死率,引起全球广泛关注。CXC趋化因子受体7(CXCR7)为具有7次跨膜结构的非典型趋化因子受体(Atypical chemokine receptors,ACKRs)家族中的一员,是趋化因子12(CXCL12)的受体之一,且其与CXCL12的亲和力明显高于CXCL12另一个受体CXC趋化因子受体4(CXCR4)。虽然,CXCR7具有7次跨膜结构,与典型的G蛋白偶联受体(G Protein-Coupled Receptors,GPCR)的保守结构域具有同源性,但是其与典型的GPCR不同,由于CXCR7缺乏可以用于与Gi蛋白偶联以及用于信号传导的功能域,所以其无法通过Gi蛋白诱导细胞信号转导,而是作为配体的清道夫受体发挥功能。大脑神经元细胞是参与脑部细胞间信号传导的高度特化细胞,是中枢神经系统(Central Nervous System,CNS)中含量最丰富以及功能最重要的细胞种类之一。研究证明,脑部神经元中可以检测到CXCR7的表达。然而,就缺血性脑卒中而言,神经元中CXCR7的作用和机制目前尚不完全清楚,CXCR7通过何种信号通路发挥作用有待进一步研究。目的:探讨氧糖剥夺/复氧(OGD/R)对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中CXCR7表达的影响,阐明CXCR7对OGD/R诱导SH-SY5Y细胞周期、凋亡、毒性及增殖能力的作用及与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路的关系,为进一步阐明探究CXCR7在缺血性脑卒中发生发展中的作用和机制提供实验基础。材料和方法:1.构建表达CXCR7基因与对照组的重组慢病毒载体,感染SH-SY5Y细胞,嘌呤霉素筛选出稳定表达CXCR7的细胞系SH-SY5Y-CXCR7和重组慢病毒对照组细胞系SH-SY5Y-NC,提取细胞总蛋白和RNA,采用蛋白质免疫印迹实验(Western Blot)检测CXCR7蛋白表达,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)检测CXCR7 mRNA转录水平的表达。2.在SH-SY5Y细胞中构建OGD/R模型,通过流式细胞术与Western Blot检测CXCR7蛋白表达,流式细胞术检测细胞周期改变。3.在慢病毒感染成功的细胞中再次构建OGD/R模型,Western Blot检测AKT信号通路表达、细胞周期与细胞凋亡相关蛋白表达,流式细胞术用于检测细胞周期与细胞凋亡,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测细胞LDH释放情况,细胞增殖与活性检测试剂盒(Cell Counting Kit 8,CCK-8)检测细胞增殖能力。4.合成靶向CXCR7编码基因的小干扰RNA,转染SH-SY5Y细胞,48 h后采用Western Blot检测靶细胞中CXCR7蛋白的表达。在si-RNA干扰CXCR7表达后再次构建OGD/R模型,Western Blot检测AKT信号通路表达、细胞周期与细胞凋亡相关蛋白表达,流式细胞术用于检测细胞周期与细胞凋亡,LDH试剂盒检测LDH释放情况,CCK-8检测细胞增殖能力。两两比较采用LSD-t检验。结果:***7过表达慢病毒感染SH-SY5Y细胞成功后,在SH-SY5Y-CXCR7细胞中成功检测到CXCR7表达增加。2.氧糖剥夺6 h/复氧24 h处理后,SH-SY5Y细胞中CXCR7蛋白表达降低,细胞周期阻滞在G0/G1期。3.慢病毒过表达CXCR7后再次构建氧糖剥夺6 h/复氧24 h,细胞周期阻滞在G0/G1期减少,细胞凋亡未发生明显改变,LDH释放减少,细胞增殖能力在第三天明显增加,AKT信号通路激活。***-RNA干扰CXCR7表达后再次构建氧糖剥夺6 h/复氧24 h模型,细胞周期在G0/G1期阻滞增加,细胞凋亡未发生明显改变,LDH释放增加,细胞增殖能力在第三天与第四天均明显降低,AKT信号通路抑制。结论:***/R可使SH-SY5Y细胞中CXCR7表达降低。***7可能通过AKT信号通路的磷酸化影响OGD/R后SH-SY5Y细胞周期与增殖能力,参与调节神经元功能,对缺氧引起的神经细胞损伤产生一定程度的保护作用。

关键词：缺血性脑卒中氧糖剥夺/复氧 CXC趋化因子受体7 丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶细胞周期

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HMGB1基因沉默对氧糖剥夺/复氧导致星形胶质细胞损伤的保护作用研究

HMGB1基因沉默对氧糖剥夺/复氧导致星形胶质细胞损伤的保护作用研...

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作者：汶海琪重庆医科大学

学位级别：硕士

目的探讨高迁移率组蛋白（high mobility group box1，HMGB1）基因沉默对氧糖剥夺/复氧导致星形胶质细胞损伤的保护作用。方法将星形胶质细胞分为对照组、模型组、HMGBl siRNA组。模型组星形胶质细胞在无糖DMEM培养基、1％O2的培养条件... 详细信息

目的探讨高迁移率组蛋白（high mobility group box1，HMGB1）基因沉默对氧糖剥夺/复氧导致星形胶质细胞损伤的保护作用。方法将星形胶质细胞分为对照组、模型组、HMGBl siRNA组。模型组星形胶质细胞在无糖DMEM培养基、1％O2的培养条件下行2、4、6h时长的氧糖剥夺后复氧至24h。HMGBl siRNA组在氧糖剥夺/复氧前对星形胶质细胞转染载有HMGB1干扰序列的慢病毒，然后氧糖剥夺6h复氧至24h。Western Blot检测RNA干扰正常星形胶质细胞后HMGB1蛋白表达;RT-PCR测定星形胶质细胞HMGB1mRNA表达变化;ELISA法测定星形胶质细胞培养上清液中HMGB1蛋白的浓度变化;用乳酸脱氢酶（LDH）漏出率、MTT法检测星形胶质细胞的损伤情况及存活率。结果Western Blot检测结果示：与RNA干扰组比较，RNA干扰能明显抑制星形胶质细胞HMGB1蛋白表达（P氧糖剥夺/复氧后，模型组星形胶质细胞HMGB1mRNA表达量和细胞培养上清液中HMGB1的浓度均有所增加（P氧糖剥夺时间的延长，均呈现不断上升趋势（P氧糖剥夺/复氧后，模型组星形胶质细胞明显损伤，随着氧糖剥夺时间的延长，星形胶质细胞损伤加重，LDH漏出率不断增高（P氧糖剥夺/复氧后，HMGB1siRNA组损伤表现明显减轻，LDH漏出率水平明显下降（P氧糖剥夺/复氧后引起细胞损伤的重要因素之一。

关键词：氧糖剥夺/复氧星形胶质细胞炎症 HMGB1 RNA干扰

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m5C修饰在氧糖剥夺/复氧神经元中的表观遗传学改变及其功能研究

m5C修饰在氧糖剥夺/复氧神经元中的表观遗传学改变及其功能研究

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作者：蹇欢天津医科大学

学位级别：硕士

【目的】本研究旨在探索神经元氧糖剥夺/复氧（Oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R）前后mRNA5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,mC）的修饰改变以及可能涉及的分子机制,进一步探讨mRNA甲基化在神经缺血再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,IRI）及中枢神经系统（Central Nervous System,CNS）疾病中发挥重要作用,阐明mC修饰的特点及功能,为神经缺血再灌注损伤的机制研究和疾病治疗提供新的表观遗传学研究策略和数据基础。【方法】1.原代皮层神经元培养及鉴定:麻醉并脱臼处死孕18天小鼠并取出胎鼠。分离胎鼠的大脑皮层组织,剪碎后消化,解离为单细胞后铺板培养。每3天更换神经元培基,培养第6天通过免疫细胞荧光法进行神经元纯度鉴定。2.神经元氧糖剥夺/复氧模型制备:神经元体外培养6天后,将神经元细胞培养基换为无葡萄糖DMEM,置于低氧条件下3小时,之后将神经元在正常的培养条件下培养24小时。TUNEL染色观察OGD/R处理前后神经元凋亡状态;qRT-PCR和Western Blot实验检测相应凋亡指标及甲基化酶表达水平。3.重亚硫酸盐测序（RNA-BS-seq）及测序结果处理:使用TRIzol试剂从原代培养的神经元中提取RNA,通过NEBNext（?）rRNA试剂盒降低rRNA含量。通过分光光度计测定样品的RNA浓度,变性琼脂糖凝胶电泳评估RNA完整性。使用EZ RNA甲基化试剂盒（Zymo Research）对RNA进行了重亚硫酸氢盐转化和纯化,使用TruSeq链式总RNA文库制备试剂盒（Illumina）构建RNA文库。通过Illumina Hi Seq4000进行150 bp配对末端测序。配对末端测序结果受Q30的质量控制,使用Cutadapt软件去除了低质量reads,通过STAR工具将input数据中的clean reads匹配到参考基因组上（UCSC mm10）,me Ran Gh软件将重亚硫酸盐处理的文库的clean reads比对到参考基因组上。mC甲基化水平≥0.1,修饰位点≥10作为有意义甲基化位点的纳入标准。4.甲基化数据分析及验证:使用BEDTools注释了mC修饰位点信息,将mRNA中的mC位点定位到不同mRNA区域,使用Web Logo绘制甲基化位点序列,Meta Plot R工具绘制mC甲基化峰的分布。Metascape被用于差异甲基化基因的富集分析,GSEA被用于mRNA表达基因集分析。STRING数据库用于对差异甲基化基因蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析。通过甲基化RNA免疫沉淀（Methylated RNA Immunoprecipitation Sequencing,MeRIP-seq）qRTPCR方法对重亚硫酸盐测序数据进行验证。【结果】1.成功体外培养高纯度原代皮层神经元:体外培养7天后,光镜下可见神经元胞体呈现为圆形及椭圆形,胞体周围有突触生成,各个神经元间突触相互连接,呈现密级网状结构。细胞免疫荧光法鉴定神经元纯度为95.12±3.81%。***/R处理诱导神经元发生凋亡:光镜观察可见神经元细胞肿胀,细胞突触形态改变明显;TUNEL染色显示OGD/R后出现明显的神经元凋亡,神经元凋亡率约为37.72±4.31%,qRT-PCR检测发现Cleaved-Caspase3,Bax表达上调,Bcl-2表达下调。Western Blot实验发现凋亡蛋白Cleaved-Caspase3,Bax及甲基化酶NSUN2表达上调,Bcl-2表达下调,OGD/R组数据相比对照组具有统计学意义（p氧化应激等病理过程中显著富集。mC甲基化基因PPI网络分析的Hub基因RPL8和RPS9与脑出血和神经缺血缺氧密切相关,RPL8和RPS9在OGD/R处理后mC甲基化修饰发生显著上调。此外,OGD/R后mRNA甲基化修饰和表达均

关键词：氧糖剥夺/复氧缺血再灌注表观遗传学 5-甲基胞嘧啶凋亡

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神经元氧糖剥夺/复氧模型的构建及CX3CR1在神经元上的表达和作用

神经元氧糖剥夺/复氧模型的构建及CX3CR1在神经元上的表达和作用

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作者：高锋昆明医科大学

学位级别：硕士

[目的]改进小鼠神经元原代培养方法并检验阿糖胞苷纯化方法对神经突起的影响,建立一种高效简便的原代神经元氧糖剥夺/复氧模型。在体外实验中验证原代神经元上表达CX3CR1,探讨CX3CR1对缺血损伤(氧糖剥夺/复氧)神经元的活性是否有影响。... 详细信息

[目的]改进小鼠神经元原代培养方法并检验阿糖胞苷纯化方法对神经突起的影响,建立一种高效简便的原代神经元氧糖剥夺/复氧模型。在体外实验中验证原代神经元上表达CX3CR1,探讨CX3CR1对缺血损伤(氧糖剥夺/复氧)神经元的活性是否有影响。[方法]取出24h内出生的C57BL/6小鼠皮质及海马,经剪碎、消化、吹打、过滤获得细胞悬液,培养48h后原代神经元细胞随机分为3组:Ara-C2.5μM、Ara-C 5μM及空白对照组,观察不同培养时间的神经元形态,用神经元特异标记物MAP2免疫荧光鉴定神经元纯度,通过神经突起长度测量及同心圆法分析(Sholl Analysis)分析阿糖胞苷纯化法对神经元突起的影响。神经元氧糖剥夺/复氧模型(OGD/R)制备,将9d的神经元随机分为5组:OGD15min、OGD30min、OGD45min、OGD60min 及对照组,将培养液换为无糖Neurobasal-A,放入缺氧小室中分别缺糖缺氧15min、30min、45min、60min后复氧复糖,对照组正常培养,24h后计算细胞存活率以筛选合适的氧糖剥夺时间。通过CX3CR1/MAP2免疫荧光双标检测神经元上CX3CR1的表达。根据是否加入CX3CR1抗体和氧糖剥夺时间将原代神经元随机分为2组:氧糖剥夺30min,加抗体组及对照组;氧糖剥夺15min/复氧24h,加抗体组对照组,之后NTT检测细胞活力,以分析CX3CR1对氧糖剥夺/复氧后神经元的活性影响。[结果]1、原代神经元在不同时间段的形态符合典型神经元生长变化过程,Ara-C 2.5 u M和Ara-C 5μM组神经元纯度分别为91.23%±3.26%和91.97%±3.92%,明显高于对照组62.04%±19.87%(p糖胞苷的纯化法不会影响神经突起的生长,并在高纯度原代神经元基础上建立了一种简便有效的OGD/R模型。证实了小鼠原代神经元上有CX3CR1的表达,而且CX3CR1在神经元的缺血损伤中是一个有害因素。

关键词：神经元原代培养氧糖剥夺/复氧 CX3CR1 小鼠

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CIRP减轻氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠海马神经元损伤的机制研究

CIRP减轻氧糖剥夺/复氧诱导的小鼠海马神经元损伤的机制研究

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作者：陈玥福建医科大学

学位级别：硕士

目的:治疗性低温可对急性缺血性卒中血管闭塞再通后的缺血再灌注损伤发挥保护作用,然而其具体分子机制尚未得到完全阐明。本研究探讨治疗性低温可能的神经保护机制,是否可通过诱导冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达,进而上调结合免疫球蛋白... 详细信息

目的:治疗性低温可对急性缺血性卒中血管闭塞再通后的缺血再灌注损伤发挥保护作用,然而其具体分子机制尚未得到完全阐明。本研究探讨治疗性低温可能的神经保护机制,是否可通过诱导冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)的表达,进而上调结合免疫球蛋白(BIP)的表达,抑制内质网应激减轻细胞钙超载,从而改善氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的HT-22小鼠海马神经元损伤。方法:选用HT-22小鼠海马神经元细胞系为研究对象,经氧糖剥夺/复氧(OGD/R)处理在体外环境中模拟脑缺血再灌注诱导的神经元损伤。对该OGD/R模型进行治疗性低温干预(30℃,4h)、质粒转染调控CIRP与BIP蛋白表达水平、内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(Thapsigargin)孵育诱导内质网应激。通过CCK8法和Annexin V-PI双染法检测细胞存活率和凋亡率以反映细胞损伤程度;钙离子荧光探针Fluo-3/AM及流式细胞仪检测胞内钙离子荧光强度以反映细胞钙超载水平;使用蛋白免疫印迹法(WB)检测CIRP、C/EBP同源蛋白(CHOP)和BIP的表达水平。结果:OGD处理HT-22细胞6h后,复氧4h与24h均能引起细胞存活率降低、钙超载与凋亡率增加(P<0.05)。因为钙超载常发生在缺血再灌注早期,所以选择钙超载差异更为明显的OGD/R4h作为体外缺血再灌注模型的构建条件用于后续实验。治疗性低温干预可显著改善OGD/R引起的细胞存活率下降、凋亡率与钙超载水平增加,并可上调CIRP的蛋白表达水平(P<0.05)。抑制CIRP的表达可降低治疗性低温对OGD/R损伤的保护作用,减少细胞存活率,增加凋亡率并加重钙超载(P<0.05);过表达CIRP可增加OGD/R处理的HT-22细胞的存活率、降低细胞凋亡率并抑制钙超载。内质网应激是诱发钙超载的重要方式之一,而CHOP可被内质网应激诱导表达,是内质网应激的标志蛋白之一。实验结果显示OGD/R模型中CHOP表达升高(P<0.05),提示OGD/R处理可诱导内质网应激;使用内质网应激诱导剂Thapsigargin可加重该模型的钙超载和凋亡(P<0.05),而过表达CIRP可显著抑制Thapsigargin所诱导的的钙超载与凋亡(P<0.05)。BIP可发挥抑制内质网应激的作用。进一步探究CIRP的下游靶点发现,敲低/过表达Cirbp基因可下调/上调BIP的表达水平(P<0.05),而质粒转染抑制BIP的蛋白表达可降低CIRP对OGD/R诱导的钙超载和凋亡的抑制作用(P<0.05)。结论:治疗性低温治疗可通过上调CIRP减轻OGD/R诱导的HT-22小鼠海马神经元损伤,发挥神经保护作用;其机制可能与CIRP上调BIP蛋白的表达,减轻HT-22细胞的内质网应激和钙超载有关。CIRP可能是减轻缺血再灌注损伤诱导的钙超载的重要分子,可为急性缺血性卒中的神经保护策略提供新的干预靶点。

关键词：氧糖剥夺/复氧钙超载治疗性低温冷诱导RNA结合蛋白结合免疫球蛋白

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骨髓间充质干细胞分泌的外泌体改善氧糖剥夺/复氧的PC12细胞损伤及机制研究

骨髓间充质干细胞分泌的外泌体改善氧糖剥夺/复氧的PC12细胞损伤...

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作者：周宇晴南方医科大学

学位级别：硕士

背景及目的:脑缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)损伤可导致严重的功能障碍,且临床治疗难度大。NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,伴随着炎症反应而发生,是脑I/R损伤的重要组成部分。文献报道,激活自噬能够抑制炎症反应,从而保护组织免受... 详细信息

背景及目的:脑缺血再灌注(ischemiareperfusion,I/R)损伤可导致严重的功能障碍,且临床治疗难度大。NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,伴随着炎症反应而发生,是脑I/R损伤的重要组成部分。文献报道,激活自噬能够抑制炎症反应,从而保护组织免受I/R损伤。本课题组的前期研究发现骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)对脑I/R损伤的保护作用可能与对自噬的调控有关。最近的研究表明,BMSCs分泌的外泌体(exosomes secreted from BMSCs,BMSC-Exos)在 BMSCs 发挥有效生物性能的机制中可能起着关键作用,BMSC-Exos不仅具有BMSCs的组织修复作用,还能规避细胞移植带来的风险。已有研究发现,在心肌I/R损伤模型中,BMSC-Exos的保护机制与通过激活自噬以缓解炎症有关。但BMSC-Exos在脑I/R损伤中的作用暂不明确。本研究旨在通过体外试验明确BMSC-Exos对脑I/R损伤的影响,并探究其机制是否与细胞焦亡和腺苷酸活化蛋白激酶(AMP activated protein kinase,AMPK)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)依赖的自噬流有关。方法:1、提取和鉴定BMSC-Exos:先采用直接贴壁法提取BMSCs,培养后收集细胞上清液,采用超高速离心法提取BMSC-Exos,使用Western blot、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析进行鉴定。2、造模和分组:对PC12细胞进行氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation,OGD/R)模型的建立,分为正常组、OGD/R 组、OGD/R+BMSC-Exos 组、OGD/R+MCC950 组、OGD/R+BMSC-Exos+pNLRP3 组、OGD/R+BMSC-Exos+Cq 组、OGD/R+BMSC-Exos+compound C 组。3、检测PC12细胞损伤:采用CCK-8检测细胞活性,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)试剂盒检测 LDH 释放。4、检测PC12细胞焦亡:加入NLRP3抑制剂MCC950和转染pNLRP3过表达质粒,采用扫描电镜观察细胞形态,DCFH-DA检测活性氧(reactive oxygen species,ROS),Hoechst 33342/PI 双染色,免疫荧光和 Western blot 检测 NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N 的表达,Elisa 法检测白介素-1β(Interleukin 1β,IL-1β)含量。5、检测PC12细胞自噬流:加入自噬抑制剂Cq和AMPK抑制剂compoundC,采用透射电镜、mRFP-GFP-LC3腺病毒转染和Western blot检测自噬流,以及采用Hoechst 33342/PI 双染色,免疫荧和Western blot 检测 NLRP3、cleaved caspase-1、GSDMD-N的表达,Elisa法检测IL-1β含量检测自噬流对细胞焦亡的影响,最后通过免疫共沉淀检测NLRP3与LC3的结合互作情况。结果:1、BMSC-Exos鉴定:Western blot、透射电镜和纳米颗粒跟踪分析仪的鉴定结果均提示,提取所得的BMSC-Exos符合外泌体的特征。2、PC12细胞损伤情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,细胞存活率增加(p<0.05),LDH 释放减少(p<0.05)。3、PC12细胞焦亡情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,细胞轮廓更加明显清晰,表面绒毛增加且密集,ROS水平降低(p<0.05),Hoechst33342/PI双染色提示细胞膜更加完整(p<0.05),NLRP3、cleavedcaspase-1、GSDMD-N 的表达和IL-1β含量减少(P<0.05),上述作用与加入MCC950的作用相似,并在转染pNLRP3过表达质粒后逆转。4、PC12细胞自噬流情况:加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,LC3Ⅱ/Ⅰ水平无明显变化,p-AMPK/AMPK 上升(p<0.05)、P62 和 p-mTOR/mTOR 下调(p<0.05)。加入Cq和compound C后,上述促进自噬流和抑制焦亡的作用被逆转。免疫共沉淀的结果显示,加入BMSC-Exos后,与OGD/R组对比,NLRP3与LC3的相互作用增强(p<0.05)。结论:1、BMSC-Exos可显著提高PC 12细胞存活率。2、BMSC-Exos可通过抑制NLRP3炎性小体介导的细胞焦亡,减轻OGD/R损伤。3、BM

关键词：氧糖剥夺/复氧骨髓间充质干细胞分泌的外泌体细胞焦亡自噬流

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丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制

丁基苯酞抗大鼠大脑皮质神经元氧糖剥夺/复氧炎性损伤及机制

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作者：吴丽蓉重庆医科大学

学位级别：硕士

背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验和临床研究,使人们对脑缺血损害及药物干预等的认识不断深化,针对该病的不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改... 详细信息

背景:缺血性脑血管病是严重威胁人们生命健康的常见病、多发病。虽然,国内外对该病所作的大量实验和临床研究,使人们对脑缺血损害及药物干预等的认识不断深化,针对该病的不同病理环节进行有目的、分阶段、联合治疗使其预后也有了较大改观,但该病的治疗仍未取得理想效果。因此,寻找新的、针对性的治疗靶点和策略很有必要。目前,对缺血性/再灌注损伤机制的研究主要集中在氧自由基、线粒体损伤、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸、炎症反应和细胞凋亡等方面。其中,缺血/再灌注后的炎症反应是研究的热点。神经元是神经系统的形态和功能单位,具有感受体内、外刺激传导冲动和整合信息的能力。神经元数量庞大,约有1011个,它们通过突触彼此连接,形成复杂的神经网络和通路。脑的不同部位和不同的细胞对缺氧的敏感性不尽相同。各类细胞对缺氧敏感性由高到低依次为:神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞、内皮细胞。脑缺血、脑损伤等多种神经疾病均涉及到神经元的损伤,尤其在脑缺血时,在缺血中心区和半影区存在大量的神经元变性、死亡。神经元作为神经功能的主要承载者和体现者,保护其结构和功能是十分重要的。众多试验表明,脑缺血后ICAM-1、iNOS的表达增强。同时发现,在脑血管疾病尤脑缺血时可引起NF-κB的活化,活化的NF-κB可上调细胞因子、粘附分子、炎性蛋白酶等的表达,造成缺血脑组织的炎性反应加剧,细胞的通透性增高,细胞基质破坏,血脑屏障破坏等最终导致神经元坏死。多数学者认为NF-κB是炎症反应的中心环节。靶向NF-κB的抗炎治疗成为国内外学者的研究热点。恩必普(通用名丁基苯酞软胶囊,NBP)是我国研发的治疗脑血管疾病的一类新药。恩必普的主要成分丁基苯酞是从我国南方的一种水芹籽中提取出来的有效成分,可分为左旋丁基苯酞(l-NBP)、右旋丁基苯酞(d-NBP)及消旋丁基苯酞(dl-NBP),有全新的作用机理,可以增加缺血区的脑血流,重建缺血区微循环,缩小脑梗塞面积,保护线粒体,改善脑缺血后能量代谢,减轻局部脑缺血所致的脑水肿等。有研究提示丁基苯酞可以明显降低缺血再灌时脑损伤区的中性粒细胞数目,并可以抑制缺血区的细胞间黏附分子-1(ICAM-1)和肿瘤坏死因子(TNF-α)表达的升高,d-NBP还可以降低低氧/复氧、IL-1所致的中性粒细胞-内皮细胞粘附,l-NBP能够明显抑制iNOS表达和NO的合成。丁基苯酞(NBP)是否可以通过抑制NF-κB的活化,进而影响其靶基因的转录抑制ICAM-1和iNOS蛋白的表达发挥抗炎作用而保护神经元,是我们研究的重点。目的:(1)探讨大鼠大脑皮质神经元的培养方法并对之进行形态学观察;(2)建立一种方便、稳定、可靠的体外细胞氧糖剥夺(oxygen glucose deprivation,OGD)/复氧(reoxygenation)模型(3)通过该模型,研究神经元在氧糖剥夺/复氧后NF-κB p65的表达、活化的动态规律;(4)研究NBP对神经元在该模型条件下细胞间粘附分子-1(ICAM-1)和诱生型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达的影响。方法:取Wistar大鼠乳鼠脑组织,采用筛网过滤、胰酶酶消化、离心等技术获取大脑皮质神经元并进行培养,通过倒置显微镜、免疫细胞化学进一步鉴定,采用细胞培养、MTT法、酶学检查、光学显微镜等研究和评价氧糖剥夺模型;采用MTT法、酶学检查观察丁基苯酞的保护作用;采用免疫细胞化学和RT-PCR方法研究NF-κB的动态变化及丁基苯酞对其靶基因蛋白ICAM-1、iNOS表达的影响。结果:(1)经形态学、免疫细胞化学(NSE)鉴定所培养的细胞为神经元;(2)OGD前后细胞形态结构变化显著,MTT法及乳酸脱氢酶的释放量测定均提示神经元损伤随氧糖剥夺时间呈时间依赖关系,与正常对照组有显著差异(P0.05)。NF-κB核转位细胞R8h达到高峰,与正常对照组有显著差异(P<0.05),且各组间(R4h、R8h、R12h、R24h)差异显著(P<0.05)。OGD/R前NF-κB p65大多数集中于胞浆,细胞呈“空泡”现象,OGD/R后NF-κBp65大多数集中于胞核,细胞呈“实心”现象;(4)MTT法和LDH释放测定发现在OGD4h/R8h时丁基苯酞各浓度组可增加神经元的细胞活力和减少神经元LDH的释放(P<0.05);(5)免疫细胞化学及RT-PCR检测到在OGD4

关键词：丁基苯酞核因子κB 氧糖剥夺/复氧大脑皮质神经元细胞间粘附分子-1 诱生型一氧化氮合酶

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PIK3CD抑制对氧糖剥夺/复氧诱导周细胞焦亡影响

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临床军医杂志 2024年第11期52卷 1155-1159,1167页

作者：王敏刘权辉孙海涛郭春雷钟丽贞仇靖王秀明北部战区空军医院空勤科辽宁沈阳110000 北部战区总医院神经内科辽宁沈阳110016

目的探讨PIK3CD抑制对氧糖剥夺/复氧诱导的周细胞焦亡的影响及机制。方法将小鼠原代脑血管周细胞分入Control组、氧糖剥夺/复氧组及氧糖剥夺/复氧+CAL-101组。Control组常规培养;氧糖剥夺/复氧组进行氧糖剥夺3 h+复氧24 h处理;氧糖剥夺... 详细信息

目的探讨PIK3CD抑制对氧糖剥夺/复氧诱导的周细胞焦亡的影响及机制。方法将小鼠原代脑血管周细胞分入Control组、氧糖剥夺/复氧组及氧糖剥夺/复氧+CAL-101组。Control组常规培养;氧糖剥夺/复氧组进行氧糖剥夺3 h+复氧24 h处理;氧糖剥夺/复氧+CAL-101组在进行氧糖剥夺/复氧处理的同时加入1μM PIK3CD抑制剂CAL-101。采用荧光实时定量聚合酶链反应和Western blot检测细胞PIK3CD表达;采用流式细胞术检测细胞焦亡情况;采用微量酶标法检测上清乳酸脱氢酶(LDH)活性;采用酶联免疫吸附试验检测上清白细胞介素(IL)-1β和IL-18含量;采用Western blot检测细胞NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)、活化半胱氨酸蛋白酶-1(cleaved Caspase-1)、消皮素D(GSDMD)、消皮素D-N端(GSDMD-N)蛋白表达。结果与Control组比较,氧糖剥夺/复氧组细胞PIK3CD mRNA表达水平上调,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组上调了周细胞中PIK3CD蛋白表达水平。与Control组比较,氧糖剥夺/复氧组Annexin V/PI双阳性细胞比例上调,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组比较,氧糖剥夺/复氧+CAL-101组Annexin V/PI双阳性细胞比例下调,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组细胞培养上清中的LDH活性上调,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组比较,氧糖剥夺/复氧+CAL-101组细胞培养上清中的LDH活性降低,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组细胞培养上清中的IL-1β、IL-18含量均增加,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组比较,氧糖剥夺/复氧+CAL-101组细胞培养上清中的IL-1β、IL-18含量均减少,差异有统计学意义(P氧糖剥夺/复氧组细胞NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达上调;与氧糖剥夺/复氧组比较,氧糖剥夺/复氧+CAL-101组细胞NLRP3、ASC、cleaved Caspase-1、GSDMD-N蛋白表达下调。结论氧糖剥夺/复氧可诱导周细胞焦亡并提高周细胞PIK3CD表达水平,PIK3CD抑制可通过抗焦亡对氧糖剥夺/复氧周细胞发挥保护作用,其机制可能与NLRP3炎症小体通路相关。

关键词： PIK3CD 氧糖剥夺/复氧周细胞细胞焦亡 NOD样受体家族热蛋白结构域相关蛋白3炎症小体

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苦碟子注射液对氧糖剥夺/复氧损伤大鼠C6胶质细胞IκBα/NF-κB蛋白的调节作用

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北京中医药 2017年第7期36卷 589-594页

作者：郑宏张昕洋赵珈艺鲁雨荍曾子修刘雪梅北京中医药大学东方医院实验中心北京100078 北京中医药大学北京100029

目的研究苦碟子注射液对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤大鼠C6胶质细胞的保护作用及对IκBα/NF-κB蛋白活化的影响。方法将C6胶质细胞分为空白对照组、OGD/R模型组、苦碟子注射液组,采用OGD/R方法建立C6胶质细胞损伤模型。MTT法确定氧糖剥夺... 详细信息

目的研究苦碟子注射液对氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤大鼠C6胶质细胞的保护作用及对IκBα/NF-κB蛋白活化的影响。方法将C6胶质细胞分为空白对照组、OGD/R模型组、苦碟子注射液组,采用OGD/R方法建立C6胶质细胞损伤模型。MTT法确定氧糖剥夺/复氧时间和苦碟子注射液的最佳有效浓度;LDH漏出率检测细胞死亡率;Western Blot法检测p-IκBα/IκBα、p-NF-κB/NF-κB蛋白表达。结果 C6胶质细胞OGD/R时间为OGD24h/R6h,苦碟子注射液最佳浓度为1.25%。OGD/R损伤后,细胞IκBα和NF-κB的表达上调及磷酸化蛋白增加;苦碟子注射液能够显著降低细胞死亡率,降低细胞p-IκBα和p-NF-κB蛋白高表达。结论 OGD/R损伤C6胶质细胞,促进了IκBα/NF-κB磷酸化,苦碟子注射液可抑制C6胶质细胞中IκBα/NF-κB磷酸化活化,降低细胞死亡率,对胶质细胞起到保护作用。

关键词： C6胶质细胞氧糖剥夺/复氧脑梗死核转录因子κB 苦碟子注射液

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LINC01116靶向miR-203加剧氧糖剥夺/复氧诱导下人海马星形胶质细胞损伤

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中风与神经疾病杂志 2022年第10期39卷 887-892页

作者：黄正义赵增霞符秋红刘淑云陈协辉深圳市龙华区中心医院老年医学科广东深圳518110 深圳市龙华区中心医院神经内科广东深圳518110 深圳市龙华区中心医院急诊科广东深圳518110

目的明确长基因间非编码RNA 1116(LINC01116)在急性缺血性脑卒中(AIS)海马星形胶质细胞中的作用及分子机制。方法利用实时荧光定量PCR检测131例AIS患者溶栓前后血清中LINC01116与miR-203表达。采用双荧光素酶报告基因与RNA结合蛋白免疫... 详细信息

目的明确长基因间非编码RNA 1116(LINC01116)在急性缺血性脑卒中(AIS)海马星形胶质细胞中的作用及分子机制。方法利用实时荧光定量PCR检测131例AIS患者溶栓前后血清中LINC01116与miR-203表达。采用双荧光素酶报告基因与RNA结合蛋白免疫沉淀试验检测LINC01116对miR-203的调控作用。以人海马星形胶质细胞(hHA)建立氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型并给予LINC01116干扰与LINC01116联合miR-203干扰处理,采用CCK-8、TUNEL与蛋白质印迹、活性氧(ROS)试验、乳酸脱氢酶(LDH)试验及酶联免疫吸附试验分别检测细胞增殖、细胞凋亡、ROS生成、LDH活性及炎症因子的变化。结果溶栓后血清中LINC01116与miR-203的表达分别高于与低于溶栓前,且LINC01116与miR-203表达呈负相关(P<0.05)。LINC01116海绵吸附miR-203并抑制其表达(P<0.05)。LINC01116干扰减轻OGD/R诱导下hHA细胞损伤,表现为细胞增殖能力提高,细胞凋亡率下降,激活型caspase-3与Bax蛋白表达降低而Bcl-2蛋白表达升高,ROS生成减少,LDH活性下降,TNF-α、IL-1β及IL-6浓度下调而IL-4、IL-10及IL-13浓度上调(P<0.05)。miR-203干扰逆转LINC01116干扰对OGD/R诱导下hHA细胞损伤的保护作用(P<0.05)。结论LINC01116靶向miR-203促进OGD/R诱导下hHA细胞损伤,表明LINC01116/miR-203通路可能是AIS的潜在治疗靶点。

关键词：长基因间非编码RNA 1116 急性缺血性脑卒中人海马星形胶质细胞氧糖剥夺/复氧治疗靶点

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