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梓葛冻干粉针对体外氧糖剥夺/再灌注损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用

中国药学杂志 2016年第13期51卷 1124-1130页

作者：童杰曾杰孙文威刘杨魏述永徐晓玉西南大学药学院重庆400715 西南大学荣昌校区动物医学系重庆402460

目的探讨梓葛冻干粉针(C-P)对体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用及可能的机制。方法原代分离培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞的纯度。实验分正常组... 详细信息

目的探讨梓葛冻干粉针(C-P)对体外氧糖剥夺/再灌注(OGD/R)损伤大鼠大脑皮层星形胶质细胞的保护作用及可能的机制。方法原代分离培养大鼠大脑皮层星形胶质细胞,神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光鉴定星形胶质细胞的纯度。实验分正常组、模型组、辅料组、C-P:12.25、24.50、49.00μg·m L-1组。对星形胶质细胞进行OGD 6h/R 12h损伤并同时给予C-P。噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率、比色法测定乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡率。利用试剂盒的方法分别检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)的活性,谷胱甘肽(GSH)、活性氧(ROS)和丙二醛(MDA)的含量以及一氧化氮(NO)的释放量,ELISA法测定细胞培养液中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和前列腺素(PG)E2的含量,Western blot检测细胞内caspase-3,诱导型一氧化氮合酶(i NOS),环氧酶(COX)-2,核因子(NF)-κB p65,p-NF-κB p65,IκB-α,p-IκB-α蛋白表达量。结果原代培养的星形胶质细胞纯度在97%以上。与正常组相比,模型组细胞存活率显著降低,LDH漏出率及细胞凋亡率明显增高;细胞内SOD活性和GSH含量明显降低,MDA和ROS含量显著升高;细胞培养液中NO、TNF-α、IL-1β和PGE2的释放量也显著增加。而以上相关生化指标均可被不同剂量的C-P所抑制。辅料组与模型组无显著差异。进一步研究发现,C-P能显著抑制OGD/R损伤引起的细胞中caspase-3、i NOS、COX-2蛋白表达量及NF-κB p65和IκB-α的磷酸化水平的增高。结论 C-P对体外OGD/R损伤的星形胶质细胞具有保护作用,其保护机制与其抗炎、抗氧化以及抑制细胞凋亡和NF-κB信号通路的激活有关。

关键词：梓葛冻干粉针星形胶质细胞氧糖剥夺/再灌注损伤炎症反应氧化应激细胞凋亡

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基于PiggyBac转座子优化稳定表达细胞系的新型瞬时受体电位M2通道抑制剂筛选

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浙江大学学报(医学版) 2024年

作者：应凯悦华宁骆燕萍刘星宇刘敏杨巍浙江大学基础医学院生物物理学系

目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T，并进行TRPM2通道抑制剂筛选，为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理，构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助... 详细信息

目的:使用PiggyBac(PB)转座系统建立稳定表达瞬时受体电位M2(TRPM2)通道的人胚胎肾细胞HEK293T，并进行TRPM2通道抑制剂筛选，为治疗脑缺血等疾病寻找潜在的药物。方法:根据PB转座原理，构建pPB-hTRPM2真核表达载体。将重组质粒和辅助质粒共同转染至HEK293T细胞中，利用系统携带的荧光与膜片钳鉴定TRPM2基因的表达，通过Z′因子评估细胞模型是否适用于钙成像法的高通量筛选。利用钙成像法和膜片钳对11个先导化合物分子进行初步活性评价，测定化合物分子对TRPM2通道的抑制活性。利用氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）损伤模型和细胞计数试剂盒8(CCK-8)方法验证筛选得到的化合物分子对损伤细胞的保护作用。利用流式细胞术检测细胞活性氧水平。利用小鼠短暂性大脑中动脉栓塞（tMCAO）模型评价化合物的神经保护作用。结果:成功构建pPB-hTRPM2真核表达载体，构建出可高效表达TRPM2基因的HEK293T细胞系，并同时表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）。在筛选获得的嘌呤霉素抗性细胞中，所有细胞荧光明亮可见，诱导后细胞表现出经典的TRPM2通道电流特征，TRPM2通道电流值与瞬时转染对照组差异无统计学意义（P>0.05）。该筛选系统进行钙成像实验的Z′因子为0.5416(Z′>0.5)，表明其适用于高通量筛选。通过钙成像法结合膜片钳筛选出化合物6具有显著的TRPM2通道抑制作用，且1.0μmol/L的化合物6能够显著提高OGD/R后SH-SY5Y细胞的存活率（P氧水平（P氧水平缓解OGD/R后细胞损伤，并对小鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用。

关键词： PiggyBac转座系统瞬时受体电位M2型高通量筛选膜片钳氧糖剥夺/再灌注损伤短暂性大脑中动脉栓塞小鼠

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脑梗死患者外周血miR-146a的表达及其对抗凋亡基因FBXL10的靶向调控

脑梗死患者外周血miR-146a的表达及其对抗凋亡基因FBXL10的靶向调...

引用

作者：李胜华广西医科大学

学位级别：硕士

尽管目前在脑梗死发生后神经细胞的凋亡机制及药物保护作用的研究取得了很大的突破和进展,为揭示脑梗死的本质和未来的临床治疗带来了希望,但是必须认识到,动物实验和临床应用还有很大的差距。最近越来越多的研究集中在脑梗死后患者外周... 详细信息

尽管目前在脑梗死发生后神经细胞的凋亡机制及药物保护作用的研究取得了很大的突破和进展,为揭示脑梗死的本质和未来的临床治疗带来了希望,但是必须认识到,动物实验和临床应用还有很大的差距。最近越来越多的研究集中在脑梗死后患者外周血miRNAs的表达变化及其内源性神经保护作用,这使得miRNAs的基础研究更接近脑梗死的临床应用和实践了。MiRNAs在脑梗死的作用及其机制已成为一个研究热点。本研究的目的是检测miRNA在脑梗死患者外周血的差异表达,并探讨miRNA在脑梗死发生发展过程扮演的角色及其调控机制。第一部分脑梗死患者外周血miRNAs差异表达的分析目的：探讨脑梗死患者外周血miRNAs的异常表达及其作为诊断脑梗死的一种潜在的生物学标志物的可能性。方法：采用miRNAs微阵列芯片技术研究脑梗死患者和健康对照者外周血miRNAs表达谱的差异,再通过逆转录实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法验证候选miRNAs的表达量。结果：与健康对照组相比,miR-145在脑梗死患者外周血的表达差异没有统计学意义(P>0.05), miR-146a和miR-185在急性脑梗死患者的表达明显下调,差异有统计学意义(P损伤异常表达的miR-146a可能通过靶向调控FBXL10和/或BCL2L2参与脑梗死的发生发展。方法：利用生物信息学预测miR-146a的潜在靶基因,并通过双荧光素酶报告基因系统、qRT-PCR和Western blot等方法进行验证。我们采用体外氧糖剥夺再灌注损伤(OGD/R)的细胞模型来模拟脑缺血／再灌注损伤(I瓜)。把miR-146a mimic或inhibitor转染入人SK-N-SH细胞,以使miR-146a过表达或低表达。同时通过qRT-PCR检测FBXL10 mRNA和BCL2L2 mRNA的表达情况,采用Western blot检测FBXL10和BCL2L2蛋白的表达水平。并采用流式细胞仪检测细胞活力、损伤和凋亡情况。最后分析miR-146a及其靶点的相互作用并评价miR-146a模拟物和抑制剂对SK-N-SH神经元细胞凋亡的影响。结果：荧光素酶报告基因系统检测证实了]miR-146a的靶基因是FBXL10而非BCL2L2。与OGD/R组和miR-146a mimic组相比,转染miR-146a inhibitor使miR-146a低表达可以减轻OGD/R诱导的SK-N-SH细胞损伤,降低细胞凋亡率,而转染miR-146a mimic使miR-146a过表达后,明显加重OGD/R诱导的神经元细胞凋亡。同时我们用Western blot法检测了FBXL10的蛋白水平,发现与OGD/R组和miR-146a mimic组相比,转染miR-146a inhibitor明显增加了FBXL10的蛋白水平(P0.05)。结论：以上结果提示：在SK-N-SH神经元细胞氧糖剥夺再灌注损伤中,抑制miR-146a的表达可能通过上调FBXL10的表达水平从而发挥抗神经元细胞凋亡的作用。

关键词：脑梗死急性脑梗死亚急性脑梗死 miR-146a miR-145 miR-185 标志物脑梗死 miR-146a FBXL10 BCL2L2 氧糖剥夺/再灌注损伤凋亡

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