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半理性设计改造氟乙酸脱卤酶RPA1163实现α-氟代羧酸的克级拆分

半理性设计改造氟乙酸脱卤酶RPA1163实现α-氟代羧酸的克级拆分

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作者：张宏霞湖南师范大学

学位级别：硕士

α-氟羧酸(α-fluorocarboxylic acids,FCAs)由于其固有的生物活性和作为构建更复杂药物分子的前体,受到了广泛的关注。目前合成手性α-氟取代的羧酸类化合物主要通过化学方法,然而传统的化学方法操作复杂,立体选择性差,金属催化剂的使... 详细信息

α-氟羧酸(α-fluorocarboxylic acids,FCAs)由于其固有的生物活性和作为构建更复杂药物分子的前体,受到了广泛的关注。目前合成手性α-氟取代的羧酸类化合物主要通过化学方法,然而传统的化学方法操作复杂,立体选择性差,金属催化剂的使用也容易造成环境污染等问题。近年来随着生物催化的发展,相对于化学催化,生物催化往往能在温和的条件下实现反应,具有绿色环保,催化效率高,对映选择性好等优点,因此发展生物催化的方法来制备这一类有机氟化物对于整个有机氟化学领域都是一个重要的推动。然而酶本身也具有热稳定性低,以及针对非天然底物催化效率低等特性,这些缺点严重阻碍了它们的广泛应用。而随着分子生物技术的发展,基因合成以及测序成本的降低,一系列的方法工具(基因挖掘,定向进化计算机辅助设计等等)也被开发出来,有效弥补了这些缺点,全面地推动了生物催化在有机化学领域的开发和利用。前期的工作中发现氟乙酸脱卤酶RPA1163可以特异催化(S)构型的α-氟代苯乙酸以及α-氟代苯丙酸脱氟水解生成对应的(R)构型的α-羟基苯乙酸以及α-羟基苯丙酸,具有手性拆分的潜在用途。但以前的研究主要集中在研究水解脱氟机理方面,所尝试的底物谱也非常狭窄。本论文深入研究了氟乙酸脱卤酶RPA1163在手性拆分中的应用,通过对其进行半理性设计,显著提高了其针对目标底物的活性,成功实现了该酶催化的α-氟代羧酸的克级拆分。此工作不仅开拓了氟乙酸脱卤酶新的用途,为合成手性纯的α-氟代羧酸和α-羟基酸类化合物提供了新思路,而且显示了计算机辅助设计的精准性,为改造蛋白提供了一个强有力的工具。本研究主要围绕以下三个方面展开:1.首先优化了整个反应条件,发现目标蛋白RPA1163热稳定性极高,即使室温存放10天,都未见明显失活。并且在此基础上优化了反应条件,进一步拓展了其底物范围。RPA1163对大多数底物都体现了良好的生物活性。2.针对活性较低的底物,通过计算机辅助半理性设计策略,实验测试发现通过定点突变构建突变体,显著提高了针对目标底物的活性。进一步测试其他底物发现,突变体对大多数底物均有明显提高。最后通过实验以及理论计算的方法阐明了突变体针对模式底物活性提高的机理。3.测试了该酶催化α-氟代羧酸克级手性拆分的能力。通过以野生型氟乙酸脱卤酶RPA1163和突变体W185N、W185T全细胞冻干粉为生物催化剂,实现了α-氟代羧酸的克级拆分,成功制备分离获得10种光学纯的(R)-α-氟代羧酸和10种光学纯的(R)-α-羟基羧酸。

关键词：氟乙酸脱卤酶半理性设计动力学拆分 α-氟代羧酸

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半理性设计氟乙酸脱卤酶RPA1163用于克级立体选择性拆分氟代羧酸的研究

半理性设计氟乙酸脱卤酶RPA1163用于克级立体选择性拆分氟代羧酸...

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第十一届全国化学生物学学术会议

作者：张宏霞田晒校李敏童伟陈波马铭王健博化学生物学和中药分析教育部重点实验室湖南师范大学化学化工学院

有机氟化物因为其独特的理化性质因此被广泛应用于不同领域,尤其是在制药以及农药领域,上市药物中约20%-30%为含氟有机分子。α-氟代羧酸作为一类有机氟化物的小分子,因为其本身的生物活性以及可以作为有机合成砌块,用于合成更加复杂的... 详细信息

有机氟化物因为其独特的理化性质因此被广泛应用于不同领域,尤其是在制药以及农药领域,上市药物中约20%-30%为含氟有机分子。α-氟代羧酸作为一类有机氟化物的小分子,因为其本身的生物活性以及可以作为有机合成砌块,用于合成更加复杂的具有生物活性的有机氟化物,其合成受到化学家的广泛关注。到目前为止,这一类化合物的混旋体可以很方便地通过化学反应制得,但是如何得到手性纯的单体依旧是一个难题。这里,我们基于以往工作中对氟乙酸脱卤酶RPA1163立体选择性的研究结果,通过重新优化RPA1163的反应条件,发现其对选定的大多数底物都有很好的反应活性以及单一的立体选择性,具有用于手性制备(R)-α-氟代羧酸的潜力。进一步针对相对惰性的底物,通过计算机辅助设计的方法,选定了结合底物活性口袋中的起关键作用的185位的色氨酸,将其定点突变成丙氨酸,丝氨酸,苏氨酸以及天冬酰胺,活性测试发现,所有突变体针对模式底物的活性均有提高,而W185N和W185T是最好的两个突变体。进一步通过实验和计算建模的方法验证,所得两个突变体通过降低了生成过渡态的能量从而实现了增强活性的目的。最终结合野生型以及两个突变体优异的反应性能,我们实现了10种α-氟代羧酸的克级拆分,同时得到了R型的α-氟代羧酸以及R型的α-羟基羧酸两种产物。这一工作不仅拓展了氟乙酸脱卤酶用于手性拆分的新用途,而且加深了我们对该蛋白催化碳氟键断裂的酶学机理探讨,同时也展示了计算机辅助设计蛋白改造的高效与精确。

关键词：氟乙酸脱卤酶半理性设计 α-氟代羧酸 α-羟基羧酸动力学拆分

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氟乙酸脱卤酶催化反应机理的理论研究

氟乙酸脱卤酶催化反应机理的理论研究

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作者：岳悦山东大学

学位级别：硕士

卤代化合物具有良好的耐热性、亲油性、热传导性、绝缘性、以及生物活性等特点,在生产生活中被大量生产,并且广泛使用。但是由于其具有毒性、持久性以及生物累积性等特点,对环境污染和生命健康造成了严重影响。生物降解脱卤技术,其本质... 详细信息

卤代化合物具有良好的耐热性、亲油性、热传导性、绝缘性、以及生物活性等特点,在生产生活中被大量生产,并且广泛使用。但是由于其具有毒性、持久性以及生物累积性等特点,对环境污染和生命健康造成了严重影响。生物降解脱卤技术,其本质是微生物、植物或者动物体内的酶发挥作用。区别于传统的化学手段,该技术为生态友好型,其能够在温和的条件下进行,并且不需要额外的化学物质输入,所以该技术在卤代化合物的降解过程中发挥着非常重要的作用。近年来基于高速发展的计算机水平,理论模拟技术成为酶研究中十分重要的手段。理论模拟通过分子动力学模拟（moleculardynamics,MD）以及分子力学与量子力学联用（quantummechanics/molecularmechnics,QM/MM）等手段可以从原子水平研究酶促反应,该手段不仅可以对实验提出的反应机理进行验证,而且可以指导实验对酶进行设计以提高酶催化效率,节省了实验上盲目测试的时间以及经济成本。相较于其他的脱卤酶来说,氟乙酸脱卤酶（FAcD）具有催化自然界中键能最高的C-F键的能力,因而受到了广泛的关注。本论文使用分子动力学模拟以及分子力学和量子力学联用的手段,以2-氟丙酸为底物,探究了 FAcD催化脱氟的反应机理。并且通过不同构象的结构分析,发现了反应物中的关键结构参数（键长OεCα,键角OεCαF）与能垒之间的相关关系,该发现可用于辅助设计提高酶效率,以降解持久性PFCA。另外通过氨基酸静电影响分析,提出Pro41、Lys85以及Asp218可作为氨基酸突变研究的候选。在此基础上,为了提供FAcD催化脱卤机理的统一图景,对FAcD催化脱氯和脱溴机理进行了研究。根据QM/MM计算得到FAcD催化脱氟、脱氯和脱溴的能垒分别为10.1、19.7和20.9 kcal mol-1,表明FAcD催化脱卤作用效率遵循以下顺序:脱氟＞脱氯＞脱溴。通过对结构进行分析,验证了 OεCα距离越短,OεCαX角度越大,能垒越低的规律。通过结构分析、静电势图绘制以及原子电荷分析的方式对FAcD催化效率进行了解释。随后基于氨基酸静电影响分析,认为Asp218可以作为后续突变研究的候选氨基酸。FAcD的催化2-卤代酸的机理分为两部分,首先经过一个亲核反应脱去卤素原子形成共价酯中间体,随后经历水解过程生成2-羟基酸底物。本论文以其天然底物氟乙酸作为研究对象,对FAcD的水解机理进行深入探究,提出了 FAcD催化降解过程的完整反应机理并确定了水解过程为速控步。本论文还对多氟取代乙酸降解进行了研究,发现FAcD降解多氟乙酸时速控步变为脱氟过程,故后续针对多氟取代化合物的降解仍然可以将重点放在脱氟上。综上,本论文的研究明确了 FAcD的催化机理,一定程度上为酶的再设计用于全氟羧酸（PFCAs）的降解提供了理论基础。

关键词：卤代化合物脱氟氟乙酸脱卤酶分子动力学模拟 QM/MM方法

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